또한, 우리는 그들의 우수한 기술 지원을위한 인간의 심방 조직과 클라우디아 Liebetrau, 카트린 Kupser 및 라모나 나겔의 제공에 하이델베르크 대학에서 심장 외과 감사합니다. 그의 도움이 제안과 칼슘 2 + 과도 측정을 설정하는 동안 조언도 앤디 W. 트래포드에 특별한 감사합니다. 그들은 세포의 전기 생리학 및 심근 분리의 기본 기술과 기술을 배우기 위하여 저희에게 제공하는 기회를 기술의 드레스덴 대학 : 저자는 약리학 및 독물학의 부 (어슐러 까마귀 머리)의 구성원에게 그들의 깊은 감사를 표현하고 싶습니다. 저자의 연구는 독일 연구 재단 (Do769/1-1-3), 심방 세동 역량 네트워크를 통해 독일 연방 교육 연구부 (01Gi0204) 심장 혈관 연구에 대한 독일의 센터를 통해 유럽 연합에 의해 지원됩니다 유럽​​ 연합 (EU)심방 세동의 번역 연구 ropean 네트워크 (EUTRAF, FP7 - 건강 - 2010 년 대규모 적분 프로젝트 제안 번호 261057)과 유럽 북미 심방 세동 연구 연합 (ENAFRA) 매그 Leducq (07CVD03)의 교부. 비디오 파일에 나와있는 회로도 개요는 Servier의 의료 기술을 사용하여 제작되었습니다.

실험 프로토콜은 로컬 윤리위원회의 승인을 모든 환자가 서면 동의를 제공해야 할 필요가있다. 우리의 연구는 의료 학부 만하임 윤리위원회, 하이델베르크 대학교 (# 2011-216N-MA)에 의해 승인 된 인간의 복지에 대한 모든, 기관 국가 및 국제 지침을 준수 하였다. 모든 환자는 서면 동의를 주었다. 0. 인간의 심방 조직을 얻는 이식 심폐 바이 패스를위한 오픈 심장 수술을받은 환자의 일상 도관의 과정에서, 오른쪽 심방의 끝은 일반적으로 제거되고 심방 심근의 분리에 사용할 수 있습니다. BDM, 수축 억제제, 심근 C 방지, 절제 후 조직 샘플은 2,3 - butanedione monoxime을 (표 I 포함 + 무료 전송 솔루션은 멸균 칼슘 2 50 ML 팔콘 튜브에 즉시 전송됩니다) ontracture. 30 ~ 45 분 사이의 전송 시간으로, 우리는 고립 된 심방 심근의 수와 질 모두에 대해 냉각 또는 산소의 명확한 이점을 인식하지 않았다. 실험실 일반 교통에 가능한 한 빨리해야한다. 긴 수송 시간은 피할 수없는 경우, 4에서 전송 ° C 산소 용액에 유리할 수 있습니다. 1. Prearrangements <ol><li> 재킷 비커 (표 II)의 온도를 제어하는 thermocirculator에 전환합니다. 비커 내부의 온도가 37 ° C.와 동일해야합니다 전체 분리 과정을 통해 비커 내에서 일정한 온도를 유지하기 위해 유리 뚜껑 비커를 다룹니다. </li><li> 세 개의 유리 비커에 콜라게나 제 I 및 프로테아제 XXIV의 무게를 실온에서 보관하십시오. 효소는 사용 직전에 희석 될 것입니다. </li><li> 칼슘의 저장소 20 ML 4에서 페트리 접시에 + 무료 솔루션 ° C. </li><li>칼슘의 저장 250 ML 37 물 목욕 + 무료 솔루션 ° C. </li></ol> 2. 조직의 청소 <ol><li> 페트리 접시 (~ 10 cm 직경)로 전송 솔루션과 함께 조직 샘플을 전송하고 약 가위를 사용하여 지방 조직을 제거합니다. </li><li> 조직 샘플의 무게. 200과 600 mg의 세포 분리에 사용됩니다. 나머지 조직은 나중에 생화학 적 분석을 위해 액체 질소에 냉동 수 있습니다. </li><li> 20 ML 칼슘이 들어있는 페트리 접시에 조직 샘플을 전송 4에서 + 무료 솔루션 ° C (단계 1.3 참조)의 크기는 약 1mm 3 작은 덩어리로 조직 샘플을 잘라. </li><li> 다음 단계는 100 % O 2 37 ° C에서 지속적인 가스 처리에서 실행해야합니다. 피펫 팁은 강력한 버블 링을 방지하고 지속적인 공기 흐름을 생성하기 위해 산소 튜브에 배치 할 수 있습니다. </li><li> 에서 칼슘 2 + 무료 솔루션과 함께 조직 덩어리를 전송재킷 비커에와 자석 교반 막대 약 3 분 동안주의 깊게 약동하십시오. </li><li> 교반을 중지하고 조직 덩어리가 몇 초 동안 정착 할 수 있습니다. 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 상층 액을 조심스럽게 변형. 집게를 사용하여 비커에 메쉬 절제된 조직 덩어리를 반환합니다. </li><li> 칼슘과 보충 비커 + 무료 솔루션 및 세척 단계에게 2.4 2.5 두 번 반복합니다. </li></ol> 3. 첫 번째 효소 소화 <ol><li> 콜라게나 제와 단백질 분해 효소를 포함하는 20 ML 효소 솔루션 E1 (표 I)와 조직 덩어리를 다시 중지하고 10 분 동안주의 깊게 약동하십시오. </li><li> 20 μM 칼슘 2 +의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다. </li><li> 35 분 조직 덩어리의 대부분은 비커에 남아있는 방식으로 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형 한 후. 나머지를 반환메쉬 비커에 조직 덩어리 비가 내렸다. </li></ol> 4. 두 번째 효소 소화 <ol><li> 난 단지 20 ML 효소 솔루션 E2 포함 된 콜라게나 제 (표 I) 다시 조직 덩어리를 resuspend을. 바로 20 μM 칼슘의 최종 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 2 용액 40 μl를 추가합니다 +. </li><li> 두 번째 소화 용 가위 동안 더욱 가끔 조직의 혈전을 잘라합니다. </li><li> 5 분 후 세포의 분리를 확인 파스퇴르 피펫을 사용하여 샘​​플을 채취. 막대 모양의 줄이있는 심근이 나타날 때까지 2-3 분마다 반복합니다. </li><li> 교반을 중지하고 조직 덩어리는 약 20 ~ 30 초 동안 정착 할 수 있습니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브 (관)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. 비커에 메쉬 구속 조직 덩어리를 반환합니다. </li><li> 20 ML 스토와 비커의 조직 덩어리를 다시 일시 중지합니다GE 용액 (표 I) 10 더 디스펜서로 20 ML 혈청 피펫을 사용하여 부드러운 기계적 분쇄하여 세포를 떼어 놓다. 거품 세포의 생존과 품질에 해로운 때문에 거품 형성을 방지하려고합니다. </li><li> 50 ML 팔콘 튜브 (튜브 B)에 나일론 메쉬 (200 ㎛, 표 II)를 통해 조심스럽게 상층 액을 변형. </li></ol> 5. 최종 칼슘의 최종 준비 및 조정 + 농도 <ol><li> 10 분 95 XG에서 팔콘 튜브와 B (단계 4.5 및 4.7 참조​​)를 모두 원심 분리기. </li><li> 흡인에 의해 조심스럽게 두 튜브에서 뜨는을 제거합니다. 펠렛을 방해하지 않도록합니다. 상층 액을 버린다. </li><li> 1.5 ML 스토리지 솔루션 (표 I) 각 (상온)에서 모두 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 두 번 각 팰콘 10 mM의 염화칼슘 용액 7.5 μL를 추가하고 신중하게 약동하십시오. 각 단계 후 10 분 동안 품어. </li><li>0.2 mm의 최종 칼슘 2 + 농도를 얻기 위해 10 mM의 염화칼슘 용액 15 μl를 추가합니다. </li></ol> 6. 형광 칼슘 2 + - 표시 플루오 오전 3시 (그림 1) 근육 세포의로드 <ol><li> 2 ML의 microcentrifuge 튜브 (에펜 도르프 튜브)에 세포 현탁액의 1.5 ML (튜브 및 / 또는 관 B)를 전송합니다. </li><li> 다음 단계는 형광 칼슘 2 + 표시 플루오 3의 빛의 감도를 고려에서 실행해야합니다. </li><li> 플루로 닉 F-127 (표 3) 원액 (20 % 무수 DMSO에 W / V)를 얻을 수있는 44 μL에 플루오 3 막 투과 아세 톡시 메틸 에스테르 유도체 (플루오로-3 AM, 표 III)의 50 μg을 용해 1 ㎜ 플루오-3는 최대 1 주 동안 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 원액, 오전. </li><li> 15 μl를 추가 플루오 3 1.5 세포 현탁액의 ML (단계 6.1 참조)와 교반을 포함하는 microcentrifuge 관에 원액 오전주의. </li><li> 광학적으로 불투명 한 상자에 10 분 동안 세포 현탁액을 품어. </li><li> 간단히 약 6,000 rpm에서 원심 분리기. </li><li> 뜨는을 취소하고 1.5 ML 목욕 용액 (표 IV)에서 펠렛을 다시 일시 중지합니다. </li><li> 실험을 시작하기 전에 드 에스테르 화 약 30 분 세포 현탁액을 남겨주세요. </li></ol> 7. 동시에 패치 클램프 Epifluorescent 칼슘 2 + 측정 패치 클램프 측정이 리뷰의 주요 주제 아니기 때문에, 우리는이 기술의 깊이 설명에 더 많은을 제공하는 다른 간행물에 관심있는 독자를 참조하십시오. 11-14 완성도를 위해서 우리가 측정 할 수있는 프로토콜의 간단한 요약을 제공합니다 활동 전위 또는 L-형 칼슘 2 + 전류의 동시 칼슘 2 + 과도 녹음과 함께 두. 실험을하는 동안 근육 세포는 목욕 soluti입니다와 37 ° C에서 superfused 있습니다신속한 재관류 시스템 (Octaflow IITM, ALA 과학 악기, NY)를 사용하여 (표 IV)에. 전압 클램프 실험, K + 전류는 목욕 솔루션에 4-아미노 피리딘 (5 mmol / L)와 BaCl 2 (0.1 mmol / L)를 추가로 차단됩니다. 붕 규산염 유리 미세 전극을 사용하고 피펫 용액 (표 V)로 가득 할 때 MΩ 2-5 저항 팁을해야합니다. 플루오 3에 더하여 (6 단계 참조) 근육 세포의로드 오전 플루오 3는 피펫 용액 (표 V)에 포함되어 있습니다. 형광은 488 nm에서 흥분과 방출되는 빛은 (&lt;520 nm의) [칼슘 2 +] 나는 가정으로 변환됩니다 <img alt="식 1" fo:content-width="1.540in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235eq1.jpg" /> 여기서 K D 플루오 3 일정 = 해리 (864 NM), F = 플루오로-3 형광;. F 최대 = 칼슘 각 실험의 끝에 얻어진 + 포화 형광 12 전기 신호 epifluorescent 칼슘 2 + 신호 모두를 동시에 기록됩니다. 활동 전위는 1.2 임계 강도의 1 밀리 전류 펄스를 사용하여 전류 클램프 모드에서 0.5 Hz로 자극된다. L-타입 칼슘 2 + - 전류 100 밀리가 빠른 나 + 전류, 다음을 비활성화 할 -80 MV의 지주 잠재력과 -40 mV에서 100 밀리 초 램프 펄스를 사용하여 전압 클램프 모드에서 측정 0.5 Hz에서 +10 mV에서 테스트 펄스.

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여기에서 우리는 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기에서 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명합니다. 세포질 칼슘의 측정이 근육 세포를 사용하기 위해서는 + 우리는 스토리지 솔루션에서 EGTA를 생략하여 앞에서 설명한 방법 4-11 적응. 이미 1970 년에 그것은 근육 세포가 + 소화하는 동안 칼슘의 존재 해리 있지만, 그들 모두가 따라서 수축과 비 생존. 16, 17에 있었다는 것을 관찰되었고, 세포의 분리는 칼슘 2 + 무료 솔루션에서 수행됩니다. 그러나 칼슘의 생리적 농도의 재 도입 + 빠른 칼슘 2 + 유입과 세포의 죽음을 초래. 이것은 원래 짐머만과 훌스에 의해 관류 마음에서 관찰되었다 칼슘 2 + 역설 현상으로 설명하고있다. 7.0의 pH 감소 등의 절연 매체의 18 수정 &lt;타우린 20 또는 칼슘 2 + (단계 3.2 및 4.1 참조), 21뿐만 아니라 스토리지 솔루션 22을 포함 EGTA 격리 된 근육 세포의 저장을 소량의&gt; 19 추가 한모금은 칼슘 2 + 역설 17.을 방지하기 위해 제안되었다 그러나, 그것은 또한 칼슘 2 + EGTA를 통해 버퍼링 L-타입 칼슘의 진폭 + 전류에 의한 칼슘 2 + 과도 진폭과 칼슘 2 + 과도 이상성 붕괴의 결과를 감소하는 것으로 알려져있다. 23 그러므로 우리는 EGTA 생략 일반적인 속성과 monophasic 붕괴와 칼슘 2 + 과도를 얻기 위해 전체 분리 과정을 통해. 칼슘의 세포를 보호하기 위해 + 역설 우리는 0.2 밀리미터까지 단계적 방식의 스토리지 솔루션의 최종 칼슘 2 + 농도를 증가했다. 콜라의 선택은 아마도 성공 심근 절연을위한 가장 중요한 단계입니다. 기존 콜agenases은 클로 스트 리듐 속의 세균 histolyticum에서 얻은 원유 준비하고 다른 단백, polysaccharidases 및 리파제의 숫자뿐만 아니라 콜라가 포함되어 있습니다. 그들의 일반적인 구성 collagenases에 따라 다른 유형으로 나뉩니다. 24 워딩 턴 콜라 유형 I 및 II가 성공적으로 우리의 현재 기술 프로토콜에서 인간의 심방 근육 세포의 분리. 4-10,15,25-30에 사용 된 우리는 콜라게나 제의 사용을 권장합니다 우리는 또한 교원질 유형 II를 사용하여 가능한 세포의 수용 양을 얻을 수 있었지만, I를 입력합니다. 그러나 단 한 번의 콜라 유형 내에서 효소의 활동에 관한 중요한 배치 별 변화가있다. 이러한 변화는주의 일괄 선택 및 분리 절차를 최적화하기 위해 다양한 배치의 테스트를 필요로합니다. 워딩 턴 생화학 공사 (에서 온라인으로 사용할 일괄 선택 도구 <a href="http://www.worthington-biochem.com/cls/match.php" target="_blank">http://www.worthington-bio</a>chem.com / CLS / match.php)는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 적합한 것으로 표시되었습니다 조성 사용할 배치를 찾는 데 사용할 수 있습니다. 현재 우리는 콜라가 250 U / MG 콜라 활동, 345 U / MG caseinase 활동, 2.16 U / MG clostripain 활동과 0.48 U / MG 트립신 활동 (제비 # 49H11338)와 I를 입력하십시오. 이 논문에 설명 된 절차를 사용하여 얻은 세포 패치 - 클램프 연구, 칼슘 2 + 과도 측정하고 또한 모두. 15 조합을 8 시간에서 사용할 수 있습니다,이 세포는 전기장 자극에 대한 응답으로 세포의 수축을 측정 할 수 있도록 또는 전기 자극 패치 - 클램프 피펫 (게시되지 않은 관찰)를 사용.

패치 클램프 기술과 + 핸들링 이상 격리 된 심근을 필요로 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성을 공부합니다. 이들은 일반적으로 소화 효소에 심장 조직 샘플의 체외 노출 (콜라, 히알루, 펩티드 등)에 따라 얻을 수 있습니다. 1955 2 가능한 심장 근육 세포의 분리의 첫 번째 보고서 이후 프로토콜의 큰 양 마우스, 쥐, 토끼, 개, 기니 돼지와 인간을 포함한 다른 종에서 하나의 심방과 심실 심근를 수확하기 위해 개발되었습니다. 이 리뷰에서 우리는 인간의 심방 근육 세포의 분리에 초점을 맞 춥니 다. 우리는 워딩 턴 생화학 공사, 미국 (에서 제공하는 &quot;워딩 턴 조직 해리 가이드&quot;를 참조하십시오 다른 종에서 근육 세포의 분리 절차에 관한 <a href="http://www.tissuedissociation.com" target="_blank">www.tissuedissociation.com을</a> ). 외. 3에 설명 된 방법에서 파생됩니다 패치 클램프 실험뿐만 아니라, 동시에 세포 내 칼슘 2 + 측정뿐만 아니라 적당한 심방 근육 세포를 얻을 수 있습니다. 4-11

<table><tbody><tr><td> </td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;</td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3059</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 1%</td></tr><tr><td>BDM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31550</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 30</td></tr><tr><td>DL-b-Hydroxy-butyric acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6501</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 20&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>L-Glutamic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1251</td><td>&lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 70</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 10&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 20</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 1.2&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9397</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 5&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 100&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 100</td></tr><tr><td>Taurin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>86330</td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 50&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>Collagenase I</td><td><a href="http://www.worthington-biochem.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png" /> Worthington</a></td><td>4196</td><td>&lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 286 U/ml</td></tr><tr><td>Protease XXIV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8038</td><td>&lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 5 U/ml*</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 7.00&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 7.40</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Transport solution&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Ca2+-free solution&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Enzyme solution E1 and E2&lt;/em&gt;: 1 M NaOH&lt;br/&gt; &lt;em&gt;Storage solution&lt;/em&gt;: 1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">Concentrations in mM unless otherwise stated. BDM, 2,3-Butanedione monoxime. *Protease XXIV is included in Enzyme solution E1 only.</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table I. Solutions.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nylon mesh (200 &amp;#956;m)</td><td>VWR-Germany</td><td>510-9527</td><td></td></tr><tr><td>Jacketed reaction beaker</td><td>VWR</td><td>KT317000-0050</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table II. Specific equipment.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl-sulphoxide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Fluo-3 AM (special packaging)</td><td>Invitrogen</td><td>F-1242</td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127</td><td>Invitrogen</td><td>P6867</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table III. Substances for loading of myocytes with Fluo-3 AM.&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-aminopyridine*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A78403</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 5</td></tr><tr><td>BaCl2*</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>342920</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>CaCl2 &amp;#215; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5080</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>MgCl &amp;#215; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M0250</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 140</td></tr><tr><td>Probenecid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8761</td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 2</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 7.35</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>&lt;em&gt;Bath solution&lt;/em&gt;: 1 M HCl</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table IV. Bath solution for patch-clamp.&lt;/strong&gt; *4-aminopyridine and BaCl were included for voltage-clamp experiments only.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DL-aspartat K+-salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2025</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 92</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4378</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.02</td></tr><tr><td>GTP-Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9002</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9136</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 10</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>1049360250</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 48</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 1</td></tr><tr><td>Na2ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2383</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 4</td></tr><tr><td>Fluo-3**</td><td>Invitrogen</td><td>F3715</td><td>&lt;em&gt;Pipette solution&lt;/em&gt;: 0.1</td></tr><tr><td>pH</td><td></td><td></td><td>7.20</td></tr><tr><td>adjusted with</td><td></td><td></td><td>1 M KOH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Table V. Pipette solution for patch-clamp*. &lt;/strong&gt;*On experimental days pipette solution is stored on ice until use. **Fluo-3 is added from a 1 mM stock solution on experimental days.</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of human atrial myocytes for simultaneous measurements of ca2+ transients and membrane currents

패치 클램프 기법과 심장 세포의 칼슘의 탐사와 심장 이온 채널의 전기 생리학 특성의 연구는 + 처리 이상 격리 심근이 필요합니다. 또한, 이러한 기술을 사용하여 환자의 근육 세포를 조사 할 수있는 가능성은 심방 세동 (AF)와 같은 심장 질환의 분자 기초를 해명하는 귀중한 요구 사항입니다. 여기에 1 우리는 모두에 적합한 인간의 심방 근육 세포의 분리 방법을 설명 패치 클램프 연구와 세포 내 칼슘 2 + 농도의 동시 측정. 첫째, 오픈 심장 수술을받은 환자에서 얻은 심방 부속기는 작은 조직 덩어리 ( &quot;청크 방법&quot;)로 잘게 + 무료 솔루션 칼슘에 씻어 수 있습니다. 그런 다음 조직 덩어리가 20 μM 칼슘 2 + 솔루션을 포함하는 콜라게나 제와 단백질 분해 효소로 소화된다. 그 후, 고립 된 근육 세포는 하브 있습니다조직 현탁액의 여과 및 원심 분리하여 STED. 마지막으로, 세포 스토리지 솔루션에 칼슘 2 + 농도는 0.2 mm까지 단계적으로 조정됩니다. 우리는 간단히 +와 칼슘 2 + 분리 과정에서 버퍼링도 활동 전위와 막 전류의 대표 녹음을 제공하고, 모두 함께 동시에 칼슘 2 + 과도 측정이 고립 된 근육 세포에서 수행과 칼슘의 의미를 설명합니다.

그림 2a는 고립 된 인간의 심방 근육 세포에서 세 가지 대표적인 예를 보여줍니다. 우리는 CellFinder 현미경 슬라이드 (에 세포 현탁액 (단계 5.5) 10 μL 피펫 세포 수율 계량 <a href="http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html" target="_blank">http://www.antenna.nl/microlab/index-uk.html을</a> ). 16.5 ± 3.1 cells/10 μL (n은 = 29) 대 5.1 ± 2.3 cells/10 μL : 그림 2B의 평균 세포 수율은 분명히 만성 AF (CAF)의 낮은 세포 수율 경향 환자 샘플 (튜브가 있음을 나타냅니다 (N = 10)는 각각 SR 및 카페에서, p &lt;0.05; 관 B : 17.9 ± 3.9 cells/10 μL (N = 29) 대 5.9 ± SR과 카페에서 2.0 cells/10 μL (n은 = 10), 각각, p = 0.107). 활동 전위 측정 및 세포질 칼슘 2 + 과도의 동시 녹음의 대표적인 예는 그림 3에 나와있다. 조사 세포, T의 약 90 %에그는 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 + 릴리스는 명확하고 일반 세포의 수축을 발생합니다. 이전에보고 된 세포의 무결성에 대한 허용 지표 휴식 막 잠재력은 -73.9에 대한 평균 ± 2.7 MV (N = 10분의 23 근세포 / 명)와 -77.7 ± 1.8 MV (N = 8분의 19 근세포 / 환자 )는 각각 SR, 커피 (p&gt; 0.05) 인치 15 그림 4는 전압 문 L-타입 칼슘 2 + 전류와 세포질 칼슘 2 + 과도의 대표 동시 녹음을 보여줍니다. 비 선택적 β-아드레날린 수용체 작용제 isoprenaline (1 μM)의 적용은 그대로 β-아드레날린 성 신호 전달 폭포를 제안, I 칼슘, L 및 세포질 칼슘 2 + 과도 모두의 진폭을 증가시킵니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig1.jpg" /> 에프igure 1. 근육 세포 플루오 3의 흐름도는 (단계 6.1-6.5 참조) 프로토콜을로드 오전. M / V, 질량 / 부피. <img alt="그림 2" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig2.jpg" /> 그림 2. 스토리지 솔루션에서 한 한시간, 고립 된 인간의 심방 근육 세포. B는 스토리지 솔루션에서 세포의 10 μL에서 계산 셀 수율의 ± SEM (단계 5.5 참조)를 의미합니다. 여기서 n은 각 그룹 내에서 준비의 수를 나타냅니다. * P &lt;0.05. <img alt="그림 3" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig3.jpg" /> 액션 잠재적 인 트리거 칼슘 2 동 율동에서 심방 근육 세포에서 + - 과도 (CAT) 및 CHR의 그림 3. 대표 기록술폰산 심방 세동 환자. 최고 : 주입 된 자극 (0.5 Hz에서)에 사용되는 현재의 막 (I M). 아래의 : 막 전위 (V M), 및 트리거 된 고양이 (아래)의 동시 녹음. (보이트 등의 허가를 Replotted. 2012) 15 <img alt="그림 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50235/50235fig4.jpg" /> L-타입 칼슘 2 isoprenaline (1 μM) 효과의 그림 4. 대표 녹음 + 전류 트리거 칼슘 부비동 리듬과 만성 심방 세동 환자에서 심방 근육 세포에서 + - 과도 (CAT). 최고 : 전압 클램프 프로토콜 (0.5 Hz에서). 아래 : 현재 총 순 막 동시 녹음 (I M), 주로 L-타입 칼슘 2 + 전류 (가운데) 및 트리거 된 고양이 (아래) 반영합니다. (보이트의 허가를 Replotted,외. 2012) 15 <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table1.jpg" alt="표 1" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table1highres.jpg" /> 표 I. 솔루션을 제공합니다. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table2.jpg" alt="표 2" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table2highres.jpg"/> 표 2. 특정 장비. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table3.jpg" alt="표 3" fo:content-width="2in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table3highres.jpg"/> 표 3. 플루오-3와 근육 세포의로드 물질하십시오. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table4.jpg" alt="표 4" fo:conteNT 너비 = &quot;2.5 인치&quot;FO : SRC = &quot;/ files/ftp_upload/50235/50235table4highres.jpg&quot;/&gt; 표 IV. 패치 클램프 목욕 솔루션입니다. <img src="/files/ftp_upload/50235/50235table5.jpg" alt="표 5" fo:content-width="2.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50235/50235table5highres.jpg"/> 패치 클램프 * 표 V. 피펫 솔루션입니다.

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Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를 설명<sup&gt; 2 +</sup전기 생리학 패치 - 클램프 연구와 함께&gt; 측정.

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리<sup&gt; 2 +</sup&gt; 과도하고 막 전류

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

isolation-human-atrial-myocytes-for-simultaneous-measurements-ca2

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

20.3K 조회수.  University of Duisburg-Essen. 우리는 세포 내 칼슘에 사용할 수있는 인간의 심방 근육 세포의 분리를 설명 2 + 측정.

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Isolation and Functional Characterization of Human Ventricular Cardiomyocytes from Fresh Surgical Samples

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and membrane ion currents. Those changes are likely&#160;to be responsible for the increased arrhythmogenic risk and the contractile alterations leading to systolic and diastolic dysfunction in cardiac patients. However, most information on the alterations of myocyte function in cardiac diseases has come from animal models.
Here we describe and validate a protocol to isolate viable myocytes from small surgical samples of ventricular myocardium from patients undergoing cardiac surgery operations. The protocol is described in detail. Electrophysiological and intracellular calcium measurements are reported to demonstrate the feasibility of a number of single cell measurements in human ventricular cardiomyocytes obtained with this method.
The protocol reported here can be useful for future investigations of the cellular and molecular basis of functional alterations of the human heart in the presence of different cardiac diseases. Further, this method can be used to identify novel therapeutic targets at cellular level and to test the effectiveness of new compounds on human cardiomyocytes, with direct translational value.

Current knowledge on the cellular basis of cardiac diseases mostly relies on studies on animal models. Here we describe and validate a novel method to obtain single viable cardiomyocytes from small surgical samples of human ventricular myocardium. Human ventricular myocytes can be used for electrophysiological studies and drug testing.

신선한 수술 샘플에서 분리 및 인간의 심실 심근 기능 특성

Cardiomyocytes from diseased hearts are subjected to complex remodeling processes involving changes in cell structure, excitation contraction coupling and ...

연구

의학

Isolation and Kv Channel Recordings in Murine Atrial and Ventricular Cardiomyocytes

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their functional properties. Mutations in KCNE genes have been found in patients with cardiac arrhythmias such as the long QT syndrome and/or atrial fibrillation. However, the precise molecular pathophysiology that leads to these diseases remains elusive. In previous studies the electrophysiological properties of the disease causing mutations in these genes have mostly been studied in heterologous expression systems and we cannot be sure if the reported effects can directly be translated into native cardiomyocytes. In our laboratory we therefore use a different approach. We directly study the effects of KCNE gene deletion in isolated cardiomyocytes from knockout mice by cellular electrophysiology - a unique technique that we describe in this issue of the Journal of Visualized Experiments. The hearts from genetically engineered KCNE mice are rapidly excised and mounted onto a Langendorff apparatus by aortic cannulation. Free Ca2+ in the myocardium is bound by EGTA, and dissociation of cardiac myocytes is then achieved by retrograde perfusion of the coronary arteries with a specialized low Ca2+ buffer containing collagenase. Atria, free right ventricular wall and the left ventricle can then be separated by microsurgical techniques. Calcium is then slowly added back to isolated cardiomyocytes in a multiple step comprising washing procedure. Atrial and ventricular cardiomyocytes of healthy appearance with no spontaneous contractions are then immediately subjected to electrophysiological analyses by patch clamp technique or other biochemical analyses within the first 6 hours following isolation.

Kv channel dysfunction is associated with cardiac arrhythmias. In order to study the molecular mechanisms that lead to such arrhythmias we utilize a systematic protocol for isolation of atrial and ventricular cardiomyocytes from Kv channel ancillary subunit knockout mice. Isolated cardiomyocytes can then immediately be used for cellular electrophysiological studies, biochemical or immunofluorescence (IF) assays.

손쥐 심방과 심실 Cardiomyocytes의 절연 및 KV 채널 레코딩

KCNE genes encode for a small family of Kv channel ancillary subunits that form heteromeric complexes with Kv channel alpha subunits to modify their ...

생물학

Isolation, Culture, and Functional Characterization of Adult Mouse Cardiomyoctyes

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of heart disease. In particular, the ability to study ion homeostasis, ion channel function, cellular excitability and excitation-contraction coupling and their alterations in diseased conditions and by disease-causing mutations have led to significant insights into cardiac diseases. Furthermore, the lack of an adequate immortalized cell line to mimic adult CMs, and the limitations of neonatal CMs (which lack many of the structural and functional biomechanics characteristic of adult CMs) in culture have hampered our understanding of the complex interplay between signaling pathways, ion channels and contractile properties in the adult heart strengthening the importance of studying adult isolated cardiomyocytes. Here, we present methods for the isolation, culture, manipulation of gene expression by adenoviral-expressed proteins, and subsequent functional analysis of cardiomyocytes from the adult mouse. The use of these techniques will help to develop mechanistic insight into signaling pathways that regulate cellular excitability, Ca2+ dynamics and contractility and provide a much more physiologically relevant characterization of cardiovascular disease.

Here we describe the isolation of adult mouse cardiomyoctyes using a Langendorff perfusion system. The resulting cells are Ca2+-tolerant, electrically quiescent and can be cultured and transfected with adeno- or lentiviruses to manipulate gene expression. Their functionality can also be analyzed using the MMSYS system and patch clamp techniques.

절연, 문화, 그리고 성인 마우스 된 심근의 기능적 특성

The use of primary cardiomyocytes (CMs) in culture has provided a powerful complement to murine models of heart disease in advancing our understanding of ...

Isolation of Atrial Cardiomyocytes from a Rat Model of Metabolic Syndrome-related Heart Failure with Preserved Ejection Fraction

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of metabolic syndrome (MetS)-related heart failure with preserved ejection fraction (HFpEF). The prevalence of MetS-related HFpEF is rising, and atrial cardiomyopathies associated with atrial remodeling and atrial fibrillation are clinically highly relevant as atrial remodeling is an independent predictor of mortality. Studies with isolated single-cell cardiomyocytes are frequently used to corroborate and complement in vivo findings. Circulatory vessel rarefication and interstitial tissue fibrosis pose a potentially limiting factor for the successful single-cell isolation of ACMs from animal models of this disease.
We have addressed this issue by employing a device capable of manually regulating the intraluminal pressure of cardiac cavities during the isolation procedure, substantially increasing the yield of morphologically and functionally intact ACMs. The acquired cells can be used in a variety of different experiments, such as cell culture and functional Calcium imaging (i.e., excitation-contraction-coupling).
We provide the researcher with a step-by-step protocol, a list of optimized solutions, thorough instructions to prepare the necessary equipment, and a comprehensive troubleshooting guide. While the initial implementation of the procedure might be rather difficult, a successful adaptation will allow the reader to perform state-of-the-art ACM isolations in a rat model of MetS-related HFpEF for a broad spectrum of experiments.

Here, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes from a rat model of metabolic syndrome-related heart failure with preserved ejection fraction. A manual regulation of intraluminal pressure of cardiac cavities is implemented to yield functionally intact myocytes suitable for excitation-contraction-coupling studies.

심 방 Cardiomyocytes 보존된 방출 분수와 함께 대사 증후군 관련 심장 마비의 쥐 모델에서의 격리

In this article, we describe an optimized, Langendorff-based procedure for the isolation of single-cell atrial cardiomyocytes (ACMs) from a rat model of ...

Isolation of Atrial Myocytes from Adult Mice

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents responsible for the action potential can cause pro-arrhythmic substrates that underlie arrhythmias, such as atrial fibrillation, which are highly prevalent in many conditions and disease states. Isolating adult mouse atrial cardiomyocytes for use in patch-clamp experiments has greatly advanced our knowledge and understanding of the cellular electrophysiology in the healthy atrial myocardium and in the setting of atrial pathophysiology. In addition, studies using genetic mouse models have elucidated the role of a vast array of proteins in regulating atrial electrophysiology. Here we provide a detailed protocol for the isolation of cardiomyocytes from the atrial appendages of adult mice using a combination of enzymatic digestion and mechanical dissociation of these tissues. This approach consistently and reliably yields isolated atrial cardiomyocytes that can then be used to characterize cellular electrophysiology by measuring action potentials and ionic currents in patch-clamp experiments under a number of experimental conditions.

This protocol is used to isolate single atrial cardiomyocytes from the adult mouse heart using a chunk digestion approach. This approach is used to isolate right or left atrial myocytes that can be used to characterize atrial myocyte electrophysiology in patch-clamp studies.

성인 마우스에서 심방 근세포의 격리

The electrophysiological properties of atrial myocytes importantly affect overall cardiac function. Alterations in the underlying ionic currents ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

배양 된 HL-1 심방 근육 세포 단층의 전압 및 칼슘 듀얼 채널 광학 매핑

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Modifications of the Langendorff Method for Simultaneous Isolation of Atrial and Ventricular Myocytes from Adult Mice

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction and electrical activity. Hence, isolating viable, high-quality cardiomyocytes from the heart is the initial and most crucial experimental step. Comparing the various protocols for isolating the cardiomyocytes of adult mice, the Langendorff retrograde perfusion is the most successful and reproducible method reported in the literature, especially for isolating ventricular myocytes. However, isolating quality atrial myocytes from the perfused heart remains challenging, and few successful isolation reports are available. Solving this complicated problem is extremely important because apart from ventricular disease, atrial disease accounts for a large part of heart diseases. Therefore, further investigations on the cellular level to reveal the mechanisms are warranted. In this paper, a protocol based on the Langendorff retrograde perfusion method is introduced and some modifications in the depth of aorta cannulation and the steps that may affect the digestion process to isolate atrial and ventricular myocytes were simultaneously made. Moreover, the isolated cardiomyocytes are confirmed to be amenable to patch clamp investigation.

This protocol describes modifications of the Langendorff method including the depth of aorta cannulation for simultaneous Isolation of atrial and ventricular myocytes from adult mice.

성인 마우스에서 심방 및 심실 근세포의 동시 격리를위한 랑엔도르프 방법의 수정

A single cardiomyocyte is a vital tool in the cellular and subcellular level studies of cardiac biology and diseases as a fundamental unit of contraction ...

Camera-based Measurements of Intracellular [Na+] in Murine Atrial Myocytes

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the sarcolemmal Na+/Ca2+ exchanger, the behavior of voltage-gated Na+ channels and the Na+,K+-ATPase. Intracellular Ca2+ signaling is altered in atrial diseases such as atrial fibrillation. While many of the mechanisms underlying altered intracellular Ca2+ homeostasis are characterized, the role of [Na+]i and its dysregulation in atrial pathologies is poorly understood. [Na+]i in atrial myocytes increases in response to increasing stimulation rates. Responsiveness to external field stimulation is therefore crucial for [Na+]i measurements in these cells. In addition, the long preparation (dye-loading) and experiment duration (calibration) require an isolation protocol that yields atrial myocytes of exceptional quality. Due to the small size of mouse atria and the composition of the intercellular matrix, the isolation of high quality adult murine atrial myocytes is difficult. Here, we describe an optimized Langendorff-perfusion based isolation protocol that consistently delivers a high yield of high quality atrial murine myocytes.
Sodium-binding benzofuran isophthalate (SBFI) is the most commonly used fluorescent Na+ indicator. SBFI can be loaded into the cardiac myocyte either in its salt form through a glass pipette or as an acetoxymethyl (AM) ester that can penetrate the myocyte&#8217;s sarcolemmal membrane. Intracellularly, SBFI-AM is de-esterified by cytosolic esterases. Due to variabilities in membrane penetration and cytosolic de-esterification each cell has to be calibrated in situ. Typically, measurements of [Na+]i using SBFI whole-cell epifluorescence are performed using a photomultiplier tube (PMT). This experimental set-up allows for only one cell to be measured at one time. Due to the length of myocyte dye loading and the calibration following each experiment data yield is low. We therefore developed an EMCCD camera-based technique to measure [Na+]i. This approach permits simultaneous [Na+]i measurements in multiple myocytes thus significantly increasing experimental yield.

The intracellular Na+ concentration ([Na+]i) in cardiac myocytes is altered during cardiac diseases. [Na+]i is an important regulator of intracellular Ca2+. We introduce a novel approach to measure [Na+]i in freshly isolated murine atrial myocytes using an electron multiplying charged coupled device (EMCCD) camera and a rapid, controllable illuminator.

Intracellular sodium concentration ([Na+]i) is an important regulator of intracellular Ca2+. Its study provides insight into the activation of the ...

Isolation of Human Ventricular Cardiomyocytes from Vibratome-Cut Myocardial Slices

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly isolated by coronary perfusion with digestive enzymes. However, isolating human cardiomyocytes is challenging because human myocardial specimens usually do not allow for coronary perfusion, and alternative isolation protocols result in poor yields of viable cells. In addition, human myocardial specimens are rare and only regularly available at institutions with on-site cardiac surgery. This hampers the translation of findings from animal to human cardiomyocytes. Described here is a reliable protocol that enables efficient isolation of ventricular myocytes from human and animal myocardium. To increase the surface-to-volume ratio while minimizing cell damage, myocardial tissue slices 300 &#181;m thick are generated from myocardial specimens with a vibratome. Tissue slices are then digested with protease and collagenase. Rat myocardium was used to establish the protocol and quantify yields of viable, calcium-tolerant myocytes by flow-cytometric cell counting. Comparison with the commonly used tissue-chunk method showed significantly higher yields of rod-shaped cardiomyocytes (41.5 &#177; 11.9 vs. 7.89 &#177; 3.6%, p &#60; 0.05). The protocol was translated to failing and non-failing human myocardium, where yields were similar as in rat myocardium and, again, markedly higher than with the tissue-chunk method (45.0 &#177; 15.0 vs. 6.87 &#177; 5.23 cells/mg, p &#60; 0.05). Notably, with the protocol presented it is possible to isolate reasonable numbers of viable human cardiomyocytes (9&#8211;200 cells/mg) from minimal amounts of tissue (&#60;50 mg). Thus, the method is applicable to healthy and failing myocardium from both human and animal hearts. Furthermore, it is possible to isolate excitable and contractile myocytes from human tissue specimens stored for up to 36 h in cold cardioplegic solution, rendering the method particularly useful for laboratories at institutions without on-site cardiac surgery.

Presented is a protocol for the isolation of human and animal ventricular cardiomyocytes from vibratome-cut myocardial slices. High yields of calcium-tolerant cells (up to 200 cells/mg) can be obtained from small amounts of tissue (&#60;50 mg). The protocol is applicable to myocardium exposed to cold ischemia for up to 36 h.

진동절단 심근슬라이스에서 인간 심실 심근세포의 분리

The isolation of ventricular cardiac myocytes from animal and human hearts is a fundamental method in cardiac research. Animal cardiomyocytes are commonly ...

Simultaneous Isolation and Culture of Atrial Myocytes, Ventricular Myocytes, and Non-Myocytes from an Adult Mouse Heart

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. While isolating myocytes from neonatal mouse hearts is relatively straightforward, myocytes from the adult murine heart are preferred. This is because compared to neonatal cells, adult myocytes more accurately recapitulate cell function as it occurs in the adult heart in vivo. However, it is technically difficult to isolate adult mouse cardiac myocytes in the necessary quantities and viability, which contributes to an experimental impasse. Furthermore, published procedures are specific for the isolation of either atrial or ventricular myocytes at the expense of atrial and ventricular non-myocyte cells. Described here is a detailed method for isolating both atrial and ventricular cardiac myocytes, along with atrial and ventricular non-myocytes, simultaneously from a single mouse heart. Also provided are the details for optimal cell-specific culturing methods, which enhance cell viability and function. This protocol aims not only to expedite the process of adult murine cardiac cell isolation, but also to increase the yield and viability of cells for investigations of atrial and ventricular cardiac cells.

A method is described for the simultaneous isolation of myocytes and non-myocytes from both the atria and ventricles of a single adult mouse heart. This protocol results in consistent yields of highly viable cardiac myocytes and non-myocytes and details optimal cell-specific culture conditions for phenotyping and in vitro analysis.

성인용 마우스 심장에서 심방 심근 세포, 심실 심근 세포 및 비근구의 동시 격리 및 문화

The isolation and culturing of cardiac myocytes from mice has been essential for furthering the understanding of cardiac physiology and pathophysiology. ...

칼슘의 동시 측정을위한 인간의 심방 근육 세포의 분리

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