이 작품은 VVPMDL에 건강 상 R01 HL105734의 국립 연구소에 의해 지원되었다 건강 연구 경력 상 K08 HL094748의 국립 연구소에 의해 부분적으로 지원됩니다. VVP 교부 11IRG900384 지원하는 미국 심장 협회 (American Heart Association)의 혁신 연구원이다.

1 필요한 솔루션 및 장비 준비 <ol><li> 첫째, 15 분간 고압 증기 멸균을하여 수술기구 (직선 모양 집게, 곡선 모양 집게, 직선 모양 가위, 곡선 모양의 가위) 소독. 121 ° C에서. 조직을 닦지에 사용되는 하나의 세트가 마음과 다른 세트를 해부에 사용되는 악기, 2 세트를 준비합니다. </li><li> 살균, 여과 물 900 ㎖에 MCDB153 문화 미디어의 한 패킷을 녹이고 분말이 용해 될 때까지 천천히 저어. 1.2 g의 중탄산 나트륨, 또는 15.7 ml의 나트륨 바이 카보네이트 용액, 배지의 최종 부피의 각각의 리터를 준비하고 용해 될 때까지 교반중인 [V / w 7.5 %]를 추가한다. 다음 조직 문화 후드 (바이오 안전성 캐비닛)에서 무균 조건 하에서 0.2 μm의 병 상단 필터를 통해 미디어를 부어, 1 N 염산 또는 1 N의 NaOH를 추가하여 7.2으로 산도를 조정합니다. 그런 다음 미디어를 수집하고 4 ℃에서 보관하십시오. </li><li> 보충제를 준비배양 배지 (자료 목록)에 추가합니다. 보충 미디어 세포 도금에 필요한 미디어 직전에 첨가한다. </li><li> 10 % FBS 플러스 항생제 (페니실린과 스트렙토 마이신)와 DPBS를 준비합니다. </li><li> DPBS 플러스 항생제 (페니실린 스트렙토 마이신) 100 ㎖에, 다음에, 0.25 g의 트립신 (USB 소의 췌장 활동&gt; 2500 USP 단위 / ㎎, 초순수)을 첨가하여 0.25 % 트립신 용액을 제조 하였다. </li><li> 이 절차를 완료하는 데 필요한 기타 필요한 장비는 입체 현미경, 페트리 접시 (10 cm), 50 ML 원뿔 튜브, 40 μm의 셀 스트레이너, DPBS 플러스 항생제, 60-mm 배양 접시 35-mm 배양 접시를 포함한다. </li></ol> 2 신생아 마우스 새끼들까지 잔치에서 하트의 분리 <ol><li> 먼저, P2 신생아 마우스 새끼에 P0을 얻었다 (N = 6-8). EYFP 대립 유전자 또는 라벨을 붙이기 위해 Z / EG 대립 유전자 : 그것은 R26R 중 이형 아르 남성과 DCT-Cre 호텔에게 동형 접합 여성의 번식에 의해 생성 된 새끼를 사용하는 것이 좋습니다멜라닌 세포 유사 세포. 두 R26R는 : EYFP 및 Z / EG 마우스는 잭슨 연구소 (주식 수는 각각 006,148과 003,920)에서 사용할 수 있습니다. </li><li> 다음으로, 신생아 마우스 새끼를 안락사 알코올 면봉으로 자신의 가슴을 닦아 낸 후 DPBS와 10 cm 페트리 접시에 새끼를 놓습니다. </li><li> 가슴을 통해 피부를 잘라 소독 집게와 가위로 흉골 후 실체 현미경을 이용하여 조심스럽게 가슴을 엽니 다. 신생아 마우스 새끼의 마음이 부착 된 심방과 심장 전체를 제거해야합니다주의해야하므로 매우 작은 수 있습니다. </li><li> DPBS에 마음을 씻고 새로운 10 cm 페트리 접시로 전송. </li></ol> 3 효소 소화 <ol><li> 조직 문화 후드 (생물 안전 캐비닛)에 절제 마음 페트리 접시를 가져와 다음 후드에서 멸균 기술을 이용하여 아래의 단계를 따릅니다. </li><li> 첫째, 무균 DPBS 플러스 항생제의 마음을 세 번 씻는다. </li><li> 에서 (N = 6-8) 마음을 놓으십시오60 mm 배양 접시와 접시에 0.5 % 트립신 용액 6-8 ML을 추가합니다. </li><li> 다음으로, (크기가 1 mm 이하) 작은 조각으로 마음을 절감하고 5 % CO 2 분위기에서 30 분 동안 37 ° C에서 그들을 품어. </li><li> 잠복기가 완료된 후, 50 ㎖의 멸균 원추형 튜브에 심장 조직과 접시에서 트립신의 생성 된 용액을 붓는다. </li><li> 그런 다음, 신속하게 조심스럽게 10 ml의 멸균 피펫을 사용하여 50-ML 원뿔 튜브 30 ~ 50 시간에서 솔루션을 씹다. </li><li> 여액을 수집하고 새로운 깨끗한 50ml의 원뿔형 튜브의 상단에 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 얻어진 용액을 필터. </li><li> 이어서, 실온에서 5 분 동안 테이블 탑 원심 분리기에서 240 × g에서 50 mL의 원심 분리 튜브. 그런 다음 조심스럽게 뜨는을 대기음 및 멸균 DPBS의 6-8 ㎖에 남아있는 펠렛을 재현 탁. 이 단계 2 번 더 반복합니다. 이 단계는 심방 근육 세포와 심장 멜라닌 세포를 펠렛하지만 소설을 미치지 않습니다섬유 아세포 이후 broblasts는 작은 상등액에 남아있게됩니다. </li></ol> 4 도금 심장 멜라닌 세포 유사 세포 <ol><li> 신중하게 배출 또는 세척 용액 (DPBS)를 대기음 및 MCDB 문화 미디어 6 ML에서 펠렛을 재현 탁, 원심 분리 후 세번째 린스를 따라하는 것은 어떤 보충제가 추가되었습니다합니다. </li><li> 이제, 멸균 전송 피펫으로 재 부유 솔루션을 그리고 35 mm 접시에 세포를 올려 놓거나, 6 웰 플레이트의 잘, 그리고 한 35-mm 접시에 세 신생아 쥐에서 분리 된 심장 세포를 풀거나 잘. </li><li> , 5 % CO 2 분위기에서 하룻밤 37 ° C에서 요리를 품어 모든 부착되지 않은 세포와 함께 배양 배지를 흡인 한 후 DPBS 한 번 번호판을 씻어. 그런 다음 접시에 신선한 미디어를 추가하고 미디어마다 이일을 교체합니다. 세포는 성인 듣고에서 격리 반면 신생아 또는 배아 마음에서 고립 된 세포는 최대 3 주 동안 배양 유지 될 수있다TS는 최대 10 일 동안 배양 유지할 수있다. </li></ol> 성인 마우스의 심장에서 5 고립시키기 심장 멜라닌 세포와 같은 세포 <ol><li> 첫째, 성숙 마우스의 마음 제거 (3-4 주령을, N = 3) 마우스에 헤파린 100 U의 복강 내 투여 한 다음를 안락사 후 중간 줄 흉골 절개를 통해. 그것은이 절차 쥐를 안락사하는 펜토 바르 비탈을 사용하는 것이 좋습니다,하지만이 약은 모든 지역에서 사용할 수 없습니다. </li><li> 다음으로, 조직 문화 후드 (바이오 안전성 캐비닛)에서 항생제를 포함하는 멸균 DPBS에 절제의 마음을 씻는다. 그들에 남아있는 혈액을 제거하고 DPBS에 한 번 더 마음을 씻어 곡선 해부 포셉 약간 마음을 짠다. </li><li> 마음에서 심방과 방실 고리를 제거합니다 (이러한 구조는 멜라닌 세포 유사 세포를 포함) 및 35 mm 접시에 절제 조직 표본을 배치합니다. </li><li> 곡선 가위와 힘을 사용하여 작은 조각으로 마음을 잘라추신 후 접시에 0.5 % 트립신 용액을 6-8 ML을 추가합니다. 그런 다음 45 ~ 60 분 동안 37 ° C에서 요리를 품어. </li><li> 이제, 이후 단계 3.6에서 시작하여 위의 프로 시저의 단계를 따릅니다. </li></ol>

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	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

우리는 공개 할게 없다.

심장 멜라닌 세포는 일반적으로 심방 부정맥 트리거를 야기 심장 내에서 해부학 적 위치에 있습니다. 이 지역은 폐 혈관, 방실 고리, 후방 좌심방과 난원 공 개존증 (그림 4)를 포함한다. 이러한 세포가 arrhythmogenesis에서의 역할을 이해하기 위해, 우리는 그들을 격리하고 그들의 생리학을 연구하는 기술을 개발한다. 그러나, 우리는이 기술을 개선하는 것은 심장 멜라닌 세포의 건강하고...

우리는 최근 멜라닌 합성 효소를 표현하고 형태 학적으로 피부 멜라닌 세포를 닮은 쥐와 인간의 심장에 새로운 세포 인구를 확인했다. 우리는이 세포의 멜라닌 세포를 심장 &#39;이라고하고 심방 부정맥은 종종 인간에서 발생 트리거되는 해부학 적 위치에 있습니다 발견했다. 우리는 또한 심장 멜라닌 세포는 DCT의 생식 세포 삭제와 생쥐에서 심방 부정맥에 기여했습니다. 심장 멜라노가 띄엄 그들은 모두 심방 세포의 0.1 % 미만을 포함 할 마우스 심방에 걸쳐 분산된다. 심장 멜라닌 세포의 전기 화학적 특성과 생물학적 특성을 조사하기 위해 우리는 Cre 호텔 유도 멜라닌 세포 특정 마커를 사용하여 마우스 마음에서 그들을 분리하는 절차를 개발했다. 당초 절차는 신생아 쥐의 심근 및 패치 클램프 기록 또는 PCR 분석에 적합한 세포의 수득 매우 작은 수를 분리하기 위해 사용되는 것들로부터 개발되었다. 그러나, 치료를 개선하기 위해일 및 전기 생리 분석 또는 생화학 적 연구에 대한 심층적 인 이상 심장 멜라닌 세포의 생존, 우리는 피부 멜라닌 세포를 분리하기 위해 설계된에서 정제 과정을 개발했다. 이 리뷰에서 설명하고 입증 절차는 순수한 인구 또는 심근으로 도금 될 수 건강한 심장 멜라닌을 생산하는 장점이있다.

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>Dissolve in water</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium no magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>Stock conc.: 1x&lt;br/&gt; Working conc.: 1x</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin </td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Stock conc.: 100x&lt;br/&gt; Working conc.: 1x</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technology</td><td>Certified</td><td>Working conc.: 4%</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>Dissolve in DMSO&lt;br/&gt;Stock conc.: 3.2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;Working conc.: 32 nM</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>Dissolve in DPBS&lt;br/&gt;Stock conc.: 0.1 mg/ml&lt;br/&gt;Working conc.: 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>Dissolve in DPBS&lt;br/&gt;Stock conc.: 0.5 mM&lt;br/&gt;Working conc.: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Dissolve in 10 mM acetic acid&lt;br/&gt;Stock conc.: 1 mg/ml&lt;br/&gt;Working conc.: 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>Dissolve in water&lt;br/&gt;Stock conc.: 4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;Working conc.: 4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

우리는 생쥐에서 심방 부정맥 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다. 심장 멜라닌 세포의 전기 화학적 특성과 생물학적 특성을 조사하기 위해 우리는 우리가 신생아 쥐의 심근 세포를 분리하기 위해 설계된로부터 유도 된 마우스의 마음에서 그들을 분리하는 절차를 개발했다. 더 광범위한 패치 클램프 또는 생화학 적 연구에 적합한 건강 심장 멜라노를 얻기 위해, 우리는 단리 및 원래 피부 멜라닌 세포를 분리하기 위해 설계된 이들에 기초하여 심장 멜라노 도금을위한 정제 과정을 개발 하였다. 정제 과정이 리뷰에서 설명하고 순수한 인구 또는 심근으로 도금 할 수있다 건강한 멜라닌 세포와 같은 세포의 큰 숫자를 생산하고있다.

이 문서에서 설명하는 프로토콜은 우리가 이전에 쥐의 심장에서 심장 멜라닌 세포를 분리 출판 일에 비해 개선 된 기술이다. 이 절차는 심장 멜라닌 세포 유사 세포를 라벨 멜라닌 합성 효소 특이 치운다 재조합 효소에 의해 구동되는 형광 마커의 사용을 채택한다. 이 심방 근육 세포에서 심장 멜라닌 세포를 구별 형태 학적 차이는 아직 (그림 1A)을 개발하지 않았기 때문에, 갓 격리 ?...

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Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다.

마우스의 심장에서 차 멜라닌 세포와 같은 세포를 분리

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K 조회수.  University of Pennsylvania.  이 프로토콜에서는 전자 와트 심방 부정맥 쥐에 트리거에 기여 쥐와 인간의 마음에서 (또한 심장 멜라닌 세포라고도 함) 멜라닌 세포와 같은 세포의 새로운 인구를 확인했다. 

비디오: Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

연구

발생학

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

1 차적인 뮤린 멜라닌세포 및 섬유아세포 배양물의 급속한 생성

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

암 연구학

Single-Cell Resolution에서 Mouse Cardiac Progenitor Cells의 핵 분리(Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells at Single-Cell Resolution)

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

저자 스포트라이트: Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

단일 세포 분해능에서 후성유전체 및 유전자 발현 프로파일링을 위한 마우스 심장 전구 세포에서 핵 분리

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

마우스 심근의 분리 및 생리 학적 분석

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

생물학

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

분리 및 문화 성인 마우스 세포 신호 전달 용의 Cardiomyocytes과의<em&gt; 시험관</em&gt; 심장 비대

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

마우스 심근 세포를 일관되게 분리하는 간단하고 효과적인 방법

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

의학

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more than half of the total cardiac cell population, and they contribute to adaptive compensations upon myocardial injury, including inflammatory responses, tissue repair, and scar formation. To study the post-MI cardiac microenvironment, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is widely used to identify different cardiac cell types and intercellular communications. Among the procedures of scRNA-seq sample preparation, preparing the cell suspension is one of the most critical steps, because the cell viability can affect the quality of the scRNA-seq results. Therefore, we designed an experimental protocol for preparing a non-cardiomyocyte cell suspension from post-MI mouse hearts with an extra focus on improving the cell viability by choosing mild digestive enzymes, controlling the digestion time, and applying fluorescence-activated cell sorting (FACS). Finally, we isolated CD45+ cells from the non-cardiomyocyte cell suspension obtained through this protocol, and then we performed scRNA-seq.

Here, we describe a protocol to isolate a sufficient amount of single non-cardiomyocytes with high viability from a post-myocardial infarction (MI) mouse heart. This can be used for subsequent single-cell sequencing, flow cytometry analysis, and primary cell culture.

심근경색 후 성인 마우스 심장에서 단일 세포 RNA 시퀀싱을 위한 비심근세포 세포 현탁액의 제조

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

절연, 특성, 및 성인 마우스 심장에서 심장 줄기 세포의 분화

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