עבודה זו נתמכה על ידי המכונים הלאומיים לבריאות בפרס R01 HL105734 לVVPMDL נתמך, בין שאר, על ידי המכון הלאומי לבריאות בקריירה מחקר פרס K08 HL094748. VVP הוא חוקר חדשני של איגוד הלב האמריקאי נתמך על ידי מענק 11IRG900384.

.1 הכנת הפתרונות וציוד הדרושים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לעקר את מכשירי ניתוח (מלקחיים ישרים צורה, מלקחיים צורה מעוגלות, מספריים צורה ישרות, ומספריים צורה מעוגלות) על ידי המעוקר במשך 15 דקות. ב 121 C °. להכין 2 סטים של מכשירים, שבו קבוצה אחת משמשת ללנתח את לבם ואת הסט השני ישמש למיותר את הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפזר 1 שקית של תקשורת בתרבות MCDB153 ב900 מ&quot;ל מים מעוקרים, מסוננים ומערבבים לאט עד שהאבקה נמסה. הוספת 1.2 יקרבונט גרם נתרן, או 15.7 פתרון ביקרבונט מ&quot;ל של נתרן [7.5% w / v], לכל ליטר של נפח הסופי של מדיום שמכין ומערבבים עד שהיא נמסה. התאם את רמת החומציות ל7.2 על ידי הוספה או N HCl 1 או 1 N NaOH, ואז לשפוך את התקשורת דרך מסנן עליון 0.2 מיקרומטר בקבוק בתנאים סטריליים בשכונת תרביות רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי). לאחר מכן לאסוף את התקשורת ולאחסן אותו ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את התוספים ללהוסיף לתקשורת והתרבות (חומרי רשימה). יש להוסיף התוספים לתקשורת רק לפני יש צורך בתקשורת לציפוי התאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן DPBS עם 10% FBS בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להכין פתרון טריפסין 0.25% על ידי הוספת 0.25 גרם של טריפסין (לבלב שור, פעילות&gt; 2,500 USP יחידות / מ&quot;ג, ultrapure; USB) לשל DPBS בתוספת אנטיביוטיקה (פניצילין וסטרפטומיצין) 100 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ציוד הנדרש אחר הנחוץ להשלמת הליך זה כולל סטראו, פטרי מנות (10 ס&quot;מ), צינורות חרוטי 50 מ&quot;ל, מסננות תא 40-מיקרומטר, DPBS בתוספת אנטיביוטיקה, מנות תרבות 60 מ&quot;מ ומנות תרבות 35 מ&quot;מ. </li></ol> .2 בידוד לבבות מגורי עכבר ילודים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להשיג P0 לגורי עכבר יילודי P2 (n = 6 עד 8). מומלץ להשתמש בגורים שנוצרו על ידי רביית DCT-Cre נקבות הומוזיגוטים עם זכרים כי הם הטרוזיגוטיים לאו R26R: אלל EYFP או Z אלל / EG לתייגתאים כמו melanocyte-. שני R26R: עכברי EYFP וZ / EG זמינים מג&#39;קסון מעבדות (מספרי מניית 006,148 ו003,920, בהתאמה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, להרדים את גורי עכבר יילודים, לנגב חזה עם ספוגית אלכוהול ולאחר מכן למקם את הגורים ב10 ס&quot;מ צלחת פטרי עם DPBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את העור באזור החזה ועצם חזה עם מלקחיים ומספריים מעוקרים ולאחר מכן פתח את החזה בזהירות תחת סטראו. לבם של גורי עכבר יילודים קטנים מאוד כדי להיות זהיר כדי לוודא כדי להסיר את כל הלב עם אטריה המצורפת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את הלב בDPBS ולהעביר אותם לצלחת פטרי 10 ס&quot;מ חדש. </li></ol> .3 אנזימתי עיכול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להביא את צלחת פטרי עם הלבבות עקורים למכסת מנוע בתרבית רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי) ולאחר מכן בצע את השלבים הבאים תוך שימוש בטכניקות סטרילי במכסת המנוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, לשטוף את הלבבות שלוש פעמים בDPBS בתוספת האנטיביוטיקה סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הלבבות (n = 6-8) בצלחת 60 מ&quot;מ התרבות ולהוסיף 6-8 מ&quot;ל של .0.5% פתרון טריפסין לצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לחתוך את הלב לחתיכות קטנות (פחות מ -1 מ&quot;מ בגודל) ודגירה אותם 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות באווירת 5% CO 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> , לאחר תקופת הדגירה היא מלאה לשפוך את הפתרון של רקמה וטריפסין מצלחת לב וכתוצאה מכך לתוך צינור חרוטי 50 מ&quot;ל סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר מכן, באמצעות פיפטה סטרילית 10-מ&quot;ל, במהירות אך בעדינות, triturate הפתרון בצינור חרוטי 50 מ&quot;ל 30-50 פעמים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן את הפתרון דרך מסננת תא 40-מיקרומטר על גבי צינור חדש, נקי 50 מ&quot;ל חרוטי וכתוצאה מכך לאיסוף התסנין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב בא, צנטריפוגות צינור 50 מ&quot;ל ב240 x גרם בצנטריפוגה בטבלה העליונה למשך 5 דקות בטמפרטורת חדר. ואז, בעדינות לשאוב את supernatant וresuspend גלולה שנותר ב6-8 מ&quot;ל של DPBS סטרילי. חזור על פעולה זו 2 פעמים יותר. צעד זה פלטות myocytes פרוזדורים ומלנוציטים לב אבל לא להפיל את fibroblasts מאז fibroblasts הם קטנים יותר ויישארו בsupernatant. </li></ol> תאים דמויי Melanocyte .4 ציפוי הלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות השטיפה השלישית לאחר צנטריפוגה, לנקז בזהירות או לשאוב את הפתרון לשטוף (DPBS) וresuspend גלולה ב6 מ&quot;ל של תקשורת בתרבות MCDB שלתוספים נוספו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, לצייר הפתרון המושעה לפיפטה העברת סטרילי ולמקם את התאים בצלחת 35 מ&quot;מ, או בטוב של צלחת 6 היטב, וברכת תאי לב הבודדים מ3 עכברים בילוד בצלחת 35 מ&quot;מ אחד או כן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות הלילה בשעה 37 ° C באווירת 5% CO 2, לשאוב את התקשורת והתרבות יחד עם כל תאים פנויים ולאחר מכן לשטוף את הצלחות פעם אחת עם DPBS. לאחר מכן להוסיף תקשורת טרי לצלחות ולהחליף את התקשורת כל 2 ימים. תאים מבודדים מלב בילוד או עוברי יכולים להישמר בתרבות לתקופה של עד 3 שבועות, ואילו תאים מבודדים מלשמוע מבוגריכול להישמר ts בתרבות עד 10 ימים. </li></ol> תאים דמויי Melanocyte .5 בידוד לב מלב מאוס למבוגרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להסיר את הלב מעכברים בוגרים (3-4 שבועות בן, n = 3) דרך sternotomy קו האמצע לאחר מתן הפרין 100 intraperitoneal U לעכברים ולאחר מכן הרדמת חסדם. מומלץ להשתמש pentobarbital להרדים עכברים להליך זה, אך תרופה זו אינה זמינה בכל המקומות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הבא, לשטוף את הלבבות העקורים בDPBS סטרילי המכיל אנטיביוטיקה במכסת מנוע בתרבית רקמה (קבינט בטיחות ביולוגי). לסחוט את לבם מעט עם מלקחיים לנתח מעוקלים כדי להסיר כל דם שנותר מהם ולאחר מכן לשטוף את לבם בDPBS עוד פעם אחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הפרוזדורים וannulus בין העליות וחדרים מהלב (מבנים אלה מכילים תאים כמו melanocyte-) ולמקם את דגימות רקמה שהוסרו בצלחת 35 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הלבבות לחתיכות קטנות בעזרת מספריים וכוח מעוקליםps אז ולהוסיף 6-8 מ&quot;ל של .0.5% פתרון טריפסין לצלחת. ואז דגירה המנות ב37 מעלות צלזיוס למשך 45-60 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו, בצע את השלבים מהתהליך שתואר לעיל החל מהצעד 3.6 ואילך. </li></ol>

<ol>
	<li>Hornyak, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mitf+dosage+as+a+primary+determinant+of+melanocyte+survival+after+ultraviolet+irradiation.">Mitf dosage as a primary determinant of melanocyte survival after ultraviolet irradiation.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 22, 307-318 (2009).</li><li>Yonetani, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+expansion+of+immature+melanoblasts+and+their+ability+to+repopulate+melanocyte+stem+cells+in+the+hair+follicle.">In vitro expansion of immature melanoblasts and their ability to repopulate melanocyte stem cells in the hair follicle.</a> J. Invest. Dermatol. 128, 408-420 (2008).</li><li>Levin, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melanocyte-like+cells+in+the+heart+and+pulmonary+veins+contribute+to+atrial+arrhythmia+triggers.">Melanocyte-like cells in the heart and pulmonary veins contribute to atrial arrhythmia triggers.</a> J. Clin. Invest. 119, 3420-3436 (2009).</li><li>Patel, V. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+insights+in+the+cellular+basis+of+atrial+fibrillation.">Novel insights in the cellular basis of atrial fibrillation.</a> Expert Rev. Cardiovasc. Ther. 8, 907-915 (2010).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+neurons+and+melanocytes+induced+from+immortal+lines+of+postnatal+neural+crest-like+stem+cells.">Functional neurons and melanocytes induced from immortal lines of postnatal neural crest-like stem cells.</a> FASEB J. 23, 3179-3192 (2009).</li><li>Sviderskaya, E. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=P16Ink4a+in+melanocyte+senescence+and+differentiation.">P16Ink4a in melanocyte senescence and differentiation.</a> J. Natl. Cancer. Inst. 94, 446-454 (2002).</li><li>Cook, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+melanoblasts+in+culture:+Expression+of+BRN2+and+synergistic+regulation+by+fibroblast+growth+factor-2,+stem+cell+factor,+and+endothelin-3.">Human melanoblasts in culture: Expression of BRN2 and synergistic regulation by fibroblast growth factor-2, stem cell factor, and endothelin-3.</a> J. Invest. Dermatol. 121, 1150-1159 (2002).</li><li>Fang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defining+the+conditions+for+the+generation+of+melanocytes+from+human+embryonic+stem+cells.">Defining the conditions for the generation of melanocytes from human embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 24, 1668-1677 (2006).</li><li>Brito, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Timeline+and+distribution+of+melanocyte+precursors+in+the+mouse+heart.">Timeline and distribution of melanocyte precursors in the mouse heart.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 464-470 (2008).</li><li>Yajima, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+isolation+of+heart+melanocytes+is+specified+and+the+level+of+pigmentation+in+the+heart+may+correlate+with+coat+color.">The isolation of heart melanocytes is specified and the level of pigmentation in the heart may correlate with coat color.</a> Pigment Cell Melanoma Res. 21, 471-476 (2008).</li></ol>

יש לנו מה למסור.

מלנוציטים לב נמצאים במקומות אנטומיים בתוך הלב, כי בדרך כלל לגרום לטריגרים הפרעות קצב פרוזדורים. אזורים אלה כוללים את ורידי ריאה, annulus בין העליות והחדרים, המבואה האחורית עזב וovale הנקב (איור 4). כדי להבין את תפקיד תאים אלה לשחק בarrhythmogenesis, אנו מפתחים טכניקות לבודד...

לאחרונה זיהו אוכלוסיית תא רומן בלב של עכברים ובני האדם שמבטאים את אנזימי מלנין-סינתזה ומורפולוגית דומה מלנוציטים עורית. אנו נקראים &#39;מלנוציטים הלב&#39; התאים אלה ומצאנו שהם נמצאים במקומות אנטומיים שממנו הפרעת קצב פרוזדורים מתעורר בי לעתים קרובות מקורן בבני אדם. מצאנו גם מלנוציטים לב לתרום להפרעות קצב פרוזדורים בעכברים עם מחיקה בתאי מין של DCT. מלנוציטים לב מופצים בדלילות לאורך אטריום העכבר שבו הם מהווים פחות מ -0.1% מכל תאי פרוזדורים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר באמצעות סמנים ספציפיים melanocyte Cre-מושרה. ההליך הראשוני שלנו פותח מאלו המשמשים לבודד את שריר לב עכברי בילוד ומספרים קטנים מאוד הניבו של תאים מתאימים להקלטות מהדק תיקון או ניתוח PCR. עם זאת, על מנת לשפר את לרפאה ואת הכדאיות של מלנוציטים לב, ליותר בניתוח המעמיק אלקטרו או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן מאלה שנועדו לבודד את מלנוציטים עורית. יש ההליך המתואר והפגין בסקירה זו את היתרון של ייצור מלנוציטים לב בריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.

<table><tbody><tr><td>MCDB 153</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7403</td><td>Dissolve in water</td></tr><tr><td>DPBS, no calcium no magnesium</td><td>Invitrogen</td><td>14190136</td><td>Stock conc.: 1x&lt;br/&gt; Working conc.: 1x</td></tr><tr><td>Penicillin-streptomycin </td><td>Invitrogen</td><td>15140163</td><td>Stock conc.: 100x&lt;br/&gt; Working conc.: 1x</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>Life Technology</td><td>Certified</td><td>Working conc.: 4%</td></tr><tr><td>TPA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1585</td><td>Dissolve in DMSO&lt;br/&gt;Stock conc.: 3.2 &amp;mu;M&lt;br/&gt;Working conc.: 32 nM</td></tr><tr><td>Transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8158</td><td>Dissolve in DPBS&lt;br/&gt;Stock conc.: 0.1 mg/ml&lt;br/&gt;Working conc.: 1 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Dibutyryl cyclic AMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0627</td><td>Dissolve in DPBS&lt;br/&gt;Stock conc.: 0.5 mM&lt;br/&gt;Working conc.: 5 &amp;mu;M</td></tr><tr><td>Insulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I6634</td><td>Dissolve in 10 mM acetic acid&lt;br/&gt;Stock conc.: 1 mg/ml&lt;br/&gt;Working conc.: 5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Basic FGF</td><td>BD Biosciences</td><td>354060</td><td>Dissolve in water&lt;br/&gt;Stock conc.: 4 ng/&amp;mu;l&lt;br/&gt;Working conc.: 4 ng/ml</td></tr></tbody></table>

isolating primary melanocyte-like cells from the mouse heart

זיהינו אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורמים לגורמי הפרעת קצב פרוזדורים בעכברים. כדי לחקור את התכונות חשמליות וביולוגיות של מלנוציטים לב פיתחנו הליך לבודד אותם מלב העכבר שנגזרים מאלה שנועדו לבודד את שריר לב עכברי בילוד. על מנת לקבל מלנוציטים לב בריאים מתאימים למהדק תיקון נרחב יותר או מחקרים ביוכימיים, שפיתחנו הליך מעודן לבידוד וציפוי מלנוציטים לב המבוססים על אלה שתוכננו במקור לבודד מלנוציטים עורית. ההליך המעודן בא לידי הביטוי בסקירה זו ומייצר מספרים גדולים יותר של תאים כמו melanocyte הבריאים שיכול להיות מצופה כאוכלוסייה טהורה או עם שריר לב.

הפרוטוקול המתואר במאמר זה הוא טכניקה משופרת בהשוואה לזו שפורסמנו בעבר לבידוד מלנוציטים לב מהלב העכברי. הליך זה מעסיק את השימוש של סמני ניאון מונעים על ידי Cre-recombinase אנזים ספציפי סינתזת מלנין לתייג תאים כמו melanocyte-לב. חשוב להשתמש בסמן כדי לתייג מלנוציטים לב כאשר עובדים ...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart at JoVE.com

Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים.

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

We identified a novel population of melanocyte-like cells (also known as cardiac melanocytes) in the hearts of mice and humans that contribute to atrial ...

isolating-primary-melanocyte-like-cells-from-the-mouse-heart

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

10.4K Views.  University of Pennsylvania.  בפרוטוקול זה, w הדואר זיהה אוכלוסיית רומן של תאים כמו melanocyte-(הידוע גם במלנוציטים לב) בלבם של עכברים ובני אדם שתורם להפרעות קצב פרוזדורים גורמת בעכברים. 

Video: Isolating Primary Melanocyte-like Cells from the Mouse Heart

Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

Developmental Biology

Rapid Generation of Primary Murine Melanocyte and Fibroblast Cultures

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation defects and cancer. Vital to the understanding and amelioration of these diseases are experiments in primary fibroblast and melanocyte cultures. Nevertheless, current protocols for melanocyte isolation require that the epidermal and dermal layers of the skin are trypsinized and manually disassociated. This process is time consuming, technically challenging and contributes to inconsistent yields. Furthermore, methods to simultaneously generate pure fibroblast cultures from the same tissue sample are not readily available. Here, we describe an improved protocol for isolating melanocytes and fibroblasts from the skin of mice on postnatal days 0-4. In this protocol, whole skin is mechanically homogenized using a tissue chopper and then briefly digested with collagenase and trypsin. Cell populations are then isolated through selective plating followed by G418 treatment. This procedure results in consistent melanocyte and fibroblast yields from a single mouse in less than 90 min. This protocol is also easily scalable, allowing researchers to process large cohorts of animals without a significant increase in hands-on time. We show through flow cytometric assessments that cultures established using this protocol are highly enriched for melanocytes or fibroblasts.

This protocol outlines a rapid method to simultaneously generate melanocyte and fibroblast cultures from the skin of 0-4 day old mice. These primary cultures can be maintained and manipulated in vitro to study a variety of physiologically relevant processes, including skin cell biology, pigmentation, wound healing and melanoma.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

Defects in fibroblast or melanocyte function are associated with skin diseases, including poor barrier function, defective wound healing, pigmentation ...

Cancer Research

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכבר ברזולוציה של תא בודד

Nuclei Isolation from Mouse Cardiac Progenitor Cells for Epigenome and Gene Expression Profiling at Single-Cell Resolution

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene expression and chromatin state of individual cells allows the identification of the cell type and state. Single-cell sequencing approaches have revealed a number of important characteristics of cardiac progenitor cell heterogeneity. However, these methods are generally restricted to fresh tissue, which limits studies with diverse experimental conditions, as the fresh tissue must be processed at once in the same run to reduce the technical variability. Therefore, easy and flexible procedures to produce data from methods such as single-nucleus RNA sequencing (snRNA-seq) and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing (snATAC-seq) are needed in this area. Here, we present a protocol to rapidly isolate nuclei for subsequent single-nuclei dual-omics (combined snRNA-seq and snATAC-seq). This method allows the isolation of nuclei from frozen samples of cardiac progenitor cells and can be combined with platforms that use microfluidic chambers.

מחבר זרקור: בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד  

Here, we present a protocol describing cell nuclei preparation. After microdissection and enzymatic dissociation of cardiac tissue into single cells, the progenitor cells were frozen, followed by isolation of pure viable cells, which were used for single-nucleus RNA sequencing and the single-nucleus assay for transposase-accessible chromatin with high-throughput sequencing analyses.

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

The developing heart is a complex structure containing various progenitor cells controlled by complex regulatory mechanisms. The examination of the gene ...

Isolation and Physiological Analysis of Mouse Cardiomyocytes

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force used to pump blood. Individual cardiomyocytes were first isolated over 40 years ago in order to better study the physiology and structure of heart muscle. Techniques have rapidly improved to include enzymatic digestion via coronary perfusion. More recently, analyzing the contractility and calcium flux of isolated myocytes has provided a vital tool in the cellular and sub-cellular analysis of heart failure. Echocardiography and EKGs provide information about the heart at an organ level only. Cardiomyocyte cell culture systems exist, but cells lack physiologically essential structures such as organized sarcomeres and t-tubules required for myocyte function within the heart. In the protocol presented here, cardiomyocytes are isolated via Langendorff perfusion. The heart is removed from the mouse, mounted via the aorta to a cannula, perfused with digestion enzymes, and cells are introduced to increasing calcium concentrations. Edge and sarcomere detection software is used to analyze contractility, and a calcium binding fluorescent dye is used to visualize calcium transients of electrically paced cardiomyocytes; increasing understanding of the role cellular changes play in heart dysfunction. Traditionally used to test drug effects on cardiomyocytes, we employ this system to compare myocytes from WT mice and mice with a mutation that causes dilated cardiomyopathy. This protocol is unique in its comparison of live cells from mice with known heart function and known genetics. Many experimental conditions are reliably compared, including genetic or environmental manipulation, infection, drug treatment, and more. Beyond physiologic data, isolated cardiomyocytes are easily fixed and stained for cytoskeletal elements. Isolating cardiomyocytes via perfusion is an extremely versatile method, useful in studying cellular changes that accompany or lead to heart failure in a variety of experimental conditions.

Individual cardiomyocytes from wild type and mutant mice can be isolated from the heart in order to study their contractility and calcium transients. This allows characterization of the contribution of cellular dysfunction to heart dysfunction from any cause.

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

Cardiomyocytes, the workhorse cell of the heart, contain exquisitely organized cytoskeletal and contractile elements that generate the contractile force ...

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult cardiomyocytes are widely accepted as a good model for cardiac cellular physiology and pathophysiology, as well as for pharmaceutical intervention. Genetically modified mice preclude the need for complicated cardiomyocyte infection processes to generate the desired genotype, which are inefficient due to cardiomyocytes&#8217; terminal differentiation. Isolation and culture of high quantity and quality functional cardiomyocytes will dramatically benefit cardiovascular research and provide an important tool for cell signaling transduction research and drug development. Here, we describe a well-established method for isolation of adult mouse cardiomyocytes that can be implemented with little training. The mouse heart is excised and cannulated to an isolated heart system, then perfused with a calcium-free and high potassium buffer followed by type II collagenase digestion in Langendorff retrograde perfusion mode. This protocol yields a consistent result for the collection of functional adult mouse cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

Isolation and Culture of Adult Mouse Cardiomyocytes for Cell Signaling and in vitro Cardiac Hypertrophy

We describe a reliable method for isolation of adult mouse cardiomyocytes. This protocol yields a consistent result for the culture of functional adult cardiomyocytes from a variety of genetically modified mice.

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו<em&gt; במבחנה</em&gt; לב היפרטרופיה

Technological advances have made genetically modified mice, including transgenic and gene knockout mice, an essential tool in many research fields. Adult ...

A Simple and Effective Method to Consistently Isolate Mouse Cardiomyocytes

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and molecular functional experiments (e.g., contraction, electrophysiology, calcium cycling, etc.) on cardiomyocytes are the gold standard for establishing mechanism(s) of disease. The mouse is the species of choice for functional experiments and the described technique is specifically for the isolation of mouse cardiomyocytes. Previous methods requiring a Langendorff apparatus require high levels of training and precision for aortic cannulation, often resulting in ischemia. The field is shifting toward Langendorff-free isolation methods that are simple, are reproducible, and yield viable myocytes for physiological data acquisition and culture. These methods greatly diminish ischemia time compared to aortic cannulation and result in reliably obtained cardiomyocytes. Our adaptation to the Langendorff-free method includes an initial perfusion with ice-cold clearing solution, use of a stabilizing platform that ensures a steady needle during perfusion, and additional digestion steps to ensure reliably obtained cardiomyocytes for use in functional measurements and culture. This method is simple and quick to perform and requires little technical skill.

The gold standard in cardiology for cellular and molecular functional experiments are cardiomyocytes. This article describes adaptations to the non-Langendorff technique to isolate mouse cardiomyocytes.

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

The need for reproducible yet technically simple methods yielding high-quality cardiomyocytes is essential for research in cardiac biology. Cellular and ...

Medicine

Preparation of a Non-Cardiomyocyte Cell Suspension for Single-Cell RNA Sequencing from a Post-Myocardial Infarction Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more than half of the total cardiac cell population, and they contribute to adaptive compensations upon myocardial injury, including inflammatory responses, tissue repair, and scar formation. To study the post-MI cardiac microenvironment, single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) is widely used to identify different cardiac cell types and intercellular communications. Among the procedures of scRNA-seq sample preparation, preparing the cell suspension is one of the most critical steps, because the cell viability can affect the quality of the scRNA-seq results. Therefore, we designed an experimental protocol for preparing a non-cardiomyocyte cell suspension from post-MI mouse hearts with an extra focus on improving the cell viability by choosing mild digestive enzymes, controlling the digestion time, and applying fluorescence-activated cell sorting (FACS). Finally, we isolated CD45+ cells from the non-cardiomyocyte cell suspension obtained through this protocol, and then we performed scRNA-seq.

Here, we describe a protocol to isolate a sufficient amount of single non-cardiomyocytes with high viability from a post-myocardial infarction (MI) mouse heart. This can be used for subsequent single-cell sequencing, flow cytometry analysis, and primary cell culture.

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

Myocardial infarction (MI) is one of the most common cardiovascular diseases, with increasing mortality worldwide. Non-cardiomyocytes account for more ...

Isolation, Characterization, and Differentiation of Cardiac Stem Cells from the Adult Mouse Heart

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead myocardium after MI. Although several strategies have been used to regenerate myocardium, stem cell therapy remains a major approach to replenish the dead myocardium of an MI heart. Accumulating evidence suggests the presence of resident cardiac stem cells (CSCs) in the adult heart and their endocrine and/or paracrine effects on cardiac regeneration. However, CSC isolation and their characterization and differentiation toward myocardial cells, especially cardiomyocytes, remains a technical challenge. In the present study, we provided a simple method for the isolation, characterization, and differentiation of CSCs from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient method for the isolation of CSCs, where the heart is digested by a 0.2% collagenase II solution. To characterize the isolated CSCs, we evaluated the expression of CSCs/cardiac markers Sca-1, NKX2-5, and GATA4, and pluripotency/stemness markers OCT4, SOX2, and Nanog. We also determined the proliferation potential of isolated CSCs by culturing them in a Petri dish and assessing the expression of the proliferation marker Ki-67. For evaluating the differentiation potential of CSCs, we selected seven- to ten-days cultured CSCs. We transferred them to a new plate with a cardiomyocyte differentiation medium. They are incubated in a cell culture incubator for 12 days, while the differentiation medium is changed every three days. The differentiated CSCs express cardiomyocyte-specific markers: actinin and troponin I. Thus, CSCs isolated with this protocol have stemness and cardiac markers, and they have a potential for proliferation and differentiation toward cardiomyocyte lineage.

The overall goal of this article is to standardize the protocol for the isolation, characterization, and differentiation of cardiac stem cells (CSCs) from the adult mouse heart. Here, we describe a density gradient centrifugation method to isolate murine CSCs and elaborated methods for CSC culture, proliferation, and differentiation into cardiomyocytes.

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים

Myocardial infarction (MI) is a leading cause of morbidity and mortality around the world. A major goal of regenerative medicine is to replenish the dead ...

בידוד תאים כמו Melanocyte-ראשיים מלב העכבר

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בידוד תאי גזע זקיק שיער עוריות קרטינוציטים מן עור עכבר הגבה

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד גרעינים מתאי אב לבביים של עכברים עבור אפיגנום ופרופיל ביטוי גנים ברזולוציה של תא בודד

בידוד ופיזיולוגי ניתוח של שריר לב העכבר

בידוד והתרבות של שריר לב מאוס למבוגרים לתא איתות ו

שיטה פשוטה ויעילה לבודד באופן עקבי קרדיומיוציטים עכבר

הכנת תרחיף תאים שאינו קרדיומיוציטים לריצוף RNA חד-תאי מלב עכבר בוגר לאחר אוטם שריר הלב

בידוד, אפיון, התמיינות של תאי גזע הלב מהלב העכבר למבוגרים