DOZ는 제네바 재단에서 수여 교부금에 의해 지원됩니다. SN은 피츠버그 조직 공학 이니셔티브에서 박사 과정 이수 화목 그랜트에 의해 지원되었다.

1. 격리 지방 파생 줄기 세포 (ASC) 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 쥐 perirenal 및 epididymal 지방을 분리하고 이전 6 설명된대로 1퍼센트 태아 소 혈청 (FBS)을 포함하는 무균 행크의 버퍼 소금 용액 (HBSS)으로 씻는다. </li><li> 조직을 말하다하고 실온에서 8 분 500g에서 50 ML 튜브 및 원심 분리기로 1퍼센트 FBS가 포함된 HBSS의 25 ML에 1-2그램을 전송. </li><li> 자유 부동 지방 조직 계층과 125 ML erlenmeyer 플라스크에 송금을 모아서 37시 45 분 대한 HBSS에서 collagenase 2 형 (200 U / ML)의 25 ML과 치료 ° 궤도 흔드는 (125 RPM)에서 C #. </li><li> 조심스럽게 액체 분획을 (오일과 지방 레이어 아래)을 제거하고 100 μm의 및 70 μm의 나일론 메쉬 필터를 통해 순차적으로 필터링합니다. 상온에서 10 분 동안 500g에 여과물을 원심 분리기, supernatan을 기음t 및 25 ML의 HBSS로 두 번 펠릿 씻는다. </li><li> MesenPRO RS 형성제 (100 U / 페니실린 G, 100 μg / ML의 스트렙토 마이신 황산과 0.25 μg / ML Amphotericin B의 ML) 항생제 - antimycotic으로 보충 성장 매체 (MesenPRO RS 자연적으로 흐르는 것과, 반사적으로 흐르는 중간)의 50 ML에 세포 펠렛을 Resuspend , 2 T75 flasks (25 ML / 플라스크)에 2 밀리미터 L-글루타민과 pipet 세포. </li><li> 문화 37 ° C (ASC가 모든 실험에 사용되는 항로 2-4)에서 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 ASC. </li></ol> 2. 키토산 Microspheres (CSM)을 준비 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> CSM은 우리의 이전 프로토콜 6을 사용 이온 coacervation 기법과 함께 워터 인 오일 유화 과정에서 준비가되어 있습니다. 콩으로 구성된 오일 위상 혼합물의 100 ML에 키토산의 수용액 (0.5 M 아세트산의 산성에서 3퍼센트 W / V 키토산 6 ML)를 유상으로 만들다석유, N-octanol (1시 2분 V / V) 5 % 솔비 탄 모노-oleate (폭 80) 유화제, 반대 방향으로, 오버헤드 (1700 RPM)과 동시에 자성 저어 (1000 RPM)를 사용. 초기 가교가 발생하기 전에에서 형성 micelles이 용액에 남아하고 아래로 정착 수없는 혼합 보장이 이중 방식입니다. 또한,의 자석 볶음 바 AIDS 마이셀 형성 및 rigidization 동안 키토산을 취소 수렴. </li><li> 혼합물은 지속적으로 안정적인 물 인 석유 유제를 얻을 때까지 약 1 시간 동안 흔들 수 있습니다. 이오니아 crosslinking은 4 H (24 ML 합계)에 대한 N-octanol 매 15 분 안에 1퍼센트 W / V 수산화 칼륨 1.5 ML의 추가와 함께 시작됩니다. </li><li> crosslinking 반응 완료 후, 천천히 혼합물이 포함된 CSM의 석유 단계를 가만히 따르다 즉시 아세톤 100 ML에 분야를 추가합니다. 오일 위상이 완전히 제거될 때까지 아세톤과 분야 씻으십시오. </li><li> 진공 건조기와 항문에서 복구된 분야 말리추가 처리없이 yze. 평균 CSM 입자 크기, 밀리그램 당 면적과 단위 입방 볼륨이 입자 크기 분석기를 사용하여 결정되었다. </li><li> 후속 실험의 경우 잔류 염분을 제거하고 절대 알코올로 소독하는 살균 물로 CSM 세 번 씻는다. </li></ol> 3. CSM에서의 자유 아미노 그룹의 개수를 결정 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> Bubins 및 Ofner 7 trinitro benzenesulfonic (TNBS) 산성 분석을 사용하여 이온 crosslinking 후 CSM에있는 무료 아미노 그룹의 개수를 결정합니다. 40 ° C 4 H에 대한 50 ML 유리관의 0.5 % TNBS 용액 1 ML과 microspheres의 5 밀리그램을 부화하고 2 시간 동안 60 ° C에서 6N HCL 3 ML의 추가와 함께 hydrolyze. </li><li> 실내 온도에 샘플을 냉각하고, 탈이온수 5 ML과 에틸 10 ML을 추가하여 무료 TNBS를 추출에테르. </li><li> ° C 물 목욕 15 분 실온에 시원한 잔여 마취제, 증발 및 물 15 ML로 희석하기 위해 40 수성 단계의 5 ML의 나누어지는을 따뜻하게. </li><li> 빈과 키토산은 아미노 그룹의 총 수를 결정하기 위해 CSM 준비에 사용으로 키토산없이 TNBS 솔루션을 사용하여 분광 광도계로 345 nm의 흡광도에서 측정. 키토산에 상대적인 CSM 무료 아미노 그룹의 수를 예상됩니다. </li></ol> 4. CSM의 로딩 ASC 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 하룻밤 무균 HBSS의 섹션 2.5에서 소독 CSM의 5 밀리그램을 평형과 8 μm의 기공 크기의 멤브레인 문화 플레이트 인서트 (24 - 웰 플레이트)에 추가합니다. </li><li> CSM은 멤브레인에 정착한 후, 조심스럽게 HBSS를 기음과 세기에 성장 미디어 삽입 700 μL의 내부에 성장 배지 300 μL를 추가할삽입 이외의 전자. </li><li> 문화 플레이트 인서트 내부 CSM 이상 성장 매체와 종자 200 μL의 적절한 농도에서 Resuspend ASC (1 X 10월 4일에서 4일까지 × 10 4). 문화 삽입 내에서 매체의 최종 부피는 시딩 후, 500 μL입니다. </li><li> 37시 5 % CO 2 humidified 배양기에서 24 H 위해 CSM에 대한 ASC 씨앗을 품어 ° C. </li></ol> 5. CSM에 ASC로드 및 세포 생존 능력의 비율을 결정 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 부화 후 삽입 막으로 마이그레이션한 세포를 방해하지 않고 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브의 ASC-로드된 CSM를 수집합니다. </li><li> 잔여 매체를 제거하고 튜브에 신선한 성장 매체 250 μL를 추가합니다. </li><li> 각각의 튜브는 25 μL MTT에게 [3 - (4,5-dimethylthiozole-2-yl) -2,5-diphenyltetrazolium의 브로마이드] 추가하려면용액 (5 밀리그램 / ML) 37시 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서 4 H 동안 품어 ° C. </li><li> 부화 후, 매체를 제거 디메틸 sulfoxide 250 μL를 추가하고 formazan 복잡한 solubilize 위해 2-5 분 와동 혼합. </li><li> 5 분 동안 2,700 X g에서 CSM을 원심 분리기, 그리고 참고로 630 nm의를 사용하여 570 nm의에서 측정 뜨는 흡광도를 결정한다. </li><li> 가능한 ASC의 알려진 숫자에서 얻은 흡광도 값에 상대적 CSM과 관련된 휴대폰 번호를 확인합니다. </li></ol> 6. ASC-CSM-임베디드 콜라겐 젤 특성화 주의 : 별도로 명시하지 않는 한 모든 절차를 상온에서 수행되었다. <ol><li> 2 N NaOH를 사용하여 6.8로 산도를 조정 후 Bornstein 8 fibrillate의 방법에 따라 쥐의 꼬리 힘줄에서 추출한 제 1 형 콜라겐 (7.5 밀리그램 / ML)와 믹스 ASC-로드된 CSM (5 MG는 ≈ 2 X 10 4 세포를 포함). </lI&gt; <li> 12 잘 판에 fibrillated 콜라겐-ASC-CSM 혼합물을 추가하고 37에서 5 % CO 2 humidified 배양기에서 30 분 동안 품어 ° C. </li><li> 전체 세동 후, 37 ° C.에 최대 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에 14 일 동안 콜라겐-ASC-CSM의 젤을 품어 </li><li> 겔에 CSM에서 세포의 출시 및 마이 그 레이션은 표준 현미경 기술을 이용하여 관찰되었다. </li></ol> 7. 대표 결과 현재 연구에서 우리는 콜라겐 젤 발판으로 키토산 microspheres (CSM)에서 줄기 세포를 전달에서 체외 전략을 개발했습니다. 균일한 크기 (직경 175-225 μm의)와 구성 다공성 CSM은 휴대 캐리어 (그림 2)로 준비하고 사용되었습니다. CSM으로 ASC를 잠복기되면 세포는 CSM 2 X 10 4 cells/5mg의 농도에 첨부. filopodia을 확장하는 동안 세포가 microsphere를 통해 확산이 가능했다microsphere의 다공성 틈새 (그림 3)에. 휴대 로드된 CSM은 콜라겐 젤과 혼합되었다되면, 세포는 즉시 젤류 (그림 4)로 이주하기 시작했다. <img alt="표 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624table1.jpg" /> 표 1. 줄기 세포 전달 시스템의 키토산과 콜라겐의 사용에 대한 생물 학적 장점. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig1.jpg" /> 그림 1. 도식은 ASC-CSM 로드된의 콜라겐 공사장 공중 발판의 이중 사용을위한 전반적인 전략을 묘사. 그림 2, 3 및 4는 이미지의 해석에 도움을 도식 내에 주석이 있습니다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig2.jpg" /> 그림 2. 도식 표현은 키토산 microspheres에 줄기 세포를 퍼뜨리고하는 과정을 묘사. PROCμm의 기공 크기의 멤브레인 문화 플레이트 인서트 - ESS는 8 CSM과 함께 공동 culturing ASC 관련이 있습니다. 24 시간 이내에, microspheres는 삽입에서 제거 및 biomaterial 행렬에 포함되어있는 준비가됩니다. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig3.jpg" /> 그림 3. ASC와 CSM-로드의 형태학의 특성. 패널 B는 공촛점 형광 현미경으로 얻은 이미지로 겹쳐보기의 같은 필드를 표시하는 동안 패널, ASC-로드된의 CSM의 가벼운 현미경을 묘사. ASC는 calcein AM (녹색)가 미리로드되었습니다. 패널 D는 microsphere (별표)에 싣게되는 세포를 보여주면서 패널 C는, 신이 microsphere의 SEM 이미지의 이미지를 묘사. 패널 전자의 TEM 이미지는 신이 microsphere의 단면을 보여줍니다. 모공과 틈새의 무리가 microsphere에 걸쳐 위치하고 있습니다. 패널 F는 세포와 교차 sectioned microsphere (화살표)를 첨부하고 cre로 filopodia을 확장 보여줍니다나쁜. 원래 배율 : &amp; B = 70X; C = 500x, D = 2,000 X, E &amp; F = 2,500 X. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig4.jpg" /> 그림 4. 입체 콜라겐 발판으로 CSM에서 ASC의 마이 그 레이션. 패널은 A와 B는 세포가 떨어져 microsphere의 이주와 함께 일 3 콜라겐 매트릭스 (, 화살표)으로 CSM을 묘사. 패널 B는 12 일 후에 유사한 문화를 보여줍니다. 전송 전자 현미경은 (TEM) 이미지가 C, D, 및 C와 D에서 E가 별표에 묘사된하고는 세포가 microsphere (화살표)에서 떨어져 마이 그 레이션과 함께 교차 sectioned되었습니다 microsphere를 보여줍니다. 패널 D의 높은 배율은 패널 전자에 묘사된, 그리고 콜라겐 원섬유 (삽입된 페이지)에 부착된 세포 filopodia를 보여줍니다. 원래 배율 : &amp; B = 100x, C &amp; D = 6,000 X; E = 20,000 X, 삽입된 페이지 = 150,000 X. <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/3624/3624fig5.jpg" /> 그림 5.도식은 재생 의료 및 약물 전달에 CSM의 광대한 사용을 묘사.

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어떤 경쟁하는 금융 이익은 존재하지. 유의 사항 여기에 포함된 의견이나 주장은 저자의 개인 의견이며 공식이나 국방 또는 미국 정부 부서의 의견을 반영 해석할 수 없습니다. 저자는 미국 정부의 직원이며,이 작품들은 공무의 일환으로 준비되었다. 모든 작품은 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령에 의해 지원되었다. 이 연구는 미국 육군 의학 연구 및 Materiel 명령 기관 검토위원회 및 승인 절차에 따라의 검토 및 승인 절차하에 실시되었다.

줄기 세포 기반 요법의 주요 장애물은 수리를 위해 지정된 지역에 세포의 전달을위한 효율적인 방법을 개발하고있다. 환자의 다양성에 대한 환자로 인해 조직 유형, 부상 크기와 깊이, 전달하는 줄기 세포의 방법론은 사례별로 결정되어야합니다. 매트릭스 내에서 줄기 세포를 내장하고 상처 사이트에 배달하는 것은 조직 공학을위한 다음 논리적인 접근 방식 것으로 보이지만 몇 가지 기술적인 ?...

<table border="1" ><tbody><tr><td> 시약 / 장비의 명칭 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td><td> 댓글 </td></tr><tr><td> 행크스 BalancedSalt 솔루션 (HBSS) </td><td> Gibco </td><td> 14,175 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 태아 소 혈청 </td><td> Hyclone </td><td> SH30071.03 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> Collagenase 타입 II </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> C6685 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 70 μm의 나일론 메쉬 필터 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,350 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 100 μm의 나일론 메쉬 필터 </td><td> BD Biosciences </td><td> 352,360 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> MesenPRO 성장 매체 시스템 </td><td> Invitrogen </td><td> 12746-012 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Gibco </td><td> 25,030 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> T75 조직 배양 플라스크 </td><td> BD Biosciences </td><td> 137,787 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 키토산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 448,869 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 초산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 320,099 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> N-Octanol </td><td> Acros의 생명체 </td><td> 150,630,025 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 솔비 - 모노-oleate </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S6760 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 수산화 칼륨 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P1767 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 아세톤 </td><td> 피셔 과학 </td><td> L-4859 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 에탄올 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 270,741 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> Trinitro Benzenesulfonic 산성 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> P2297 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 염산 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 320,331 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 에틸 에테르 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> 472-484 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 8 μm의 조직 문화 플레이트 삽입물 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,097 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 1.5 ML의 Microcentrifuge 튜브 </td><td> 어부 </td><td> 05-408-129 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> MTT 시약 </td><td> Invitrogen </td><td> M6494 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 디메틸 Sulfoxide </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> D8779 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> Qtracker 셀 라벨 키트 (Q 추적기 655) </td><td> 분자 프로브 </td><td> Q2502PMP </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 한 콜라겐을 입력 </td><td> Travigen </td><td> 3447-020-01 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 수산화 나트륨 </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> S8045 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 12 음 조직 배양 플레이트 </td><td> BD Biosciences </td><td> 353,043 </td><td> 소모품 </td></tr><tr><td> 원심 분리기 </td><td> Eppendorf </td><td> 5417R </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 궤도 흔드는 </td><td> 뉴 브 런 즈윅 Scienctific </td><td> C24 </td><td> 장비 </tD&gt; </tr><tr><td> 에어 5 % CO 2와 Humidified 인큐베이터 </td><td> 써모 과학 </td><td> 모델 370 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 오버헤드 활동가 </td><td> 이카 </td><td> Visc6000 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 마그네틱 활동가 </td><td> 코닝 </td><td> PC-210 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 진공 건조기 </td><td> - </td><td> - </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 입자 크기 분석기 </td><td> Malvern </td><td> STP2000 Spraytec </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 열탕 목욕 </td><td> 피셔 과학 </td><td> Isotemp210 </td><td> 장비 </TD&gt; </tr><tr><td> 분광 </td><td> Beckman </td><td> Beckman 보습 바로 앞에 달린 풀베는 날 DU800UV/Visible 분광 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 와동 </td><td> Diagger </td><td> 3030a </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> Microplate Reader를 </td><td> 분자 장치 </td><td> SpectraMax M2 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 형광 / 라이트 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> IX71 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 공촛점 현미경 </td><td> 올림포스 산 </td><td> 공촛점 현미경 스캐닝 FV-500 레이저 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 전자 현미경 검사 </td><td> 칼 자이스 혈구 마이크roImaging </td><td> 레오 435 부사장 </td><td> 장비 </td></tr><tr><td> 전송 전자 현미경 </td><td> JEOL </td><td> JEOL 1230 </td><td> 장비 </td></tr></tbody></table>

constructing a collagen hydrogel for the delivery of stem cell-loaded chitosan microspheres

Multipotent 줄기 세포는 재생 의료 1-3 분야에서 매우 유용한 것으로 표시되었습니다. 그러나, 조직 재생을 위해 효과적으로 이들 세포를 사용하기 위해서는 변수의 수를 고려되어야한다. 이러한 변수는 다음과 같습니다 : 총 볼륨 및 주입 사이트의 표면적, 조직의 기계적 성질과 vascularization의 금액 및 세포외 기질의 구성 요소를 포함하는 조직 microenvironment를. 호스트 조직을 모방한 것이었 기계적 강도를 유지하면서 따라서 이러한 세포를 전달하기 위해 사용되는 자료는 정의된 화학 성분과 biocompatible이어야합니다. 이 자료는 또한 산소와 영양소를 세포 부착 및 분아 따위에 의해 번식하는 데 유리한 microenvironment를 제공하기 위해 대한 투과이어야합니다. 키토산, 우수한 biocompatibility과 양이온 다당류, 쉽게 화학적으로 바뀌었 및 생체내 맥에서 함께 바인딩 높은 친화력을 가지고 있습니다romolecules 4-5. 키토산은 세포 접착, 마이 그 레이션 및 확산을위한 기판으로 작동할 수 있도록, 세포외 기질의 glycosaminoglycan 부분을 모방한 것이었 지요. 본 연구에서는 입체 비계 6 기반의 콜라겐으로 지방 파생 줄기 세포 (ASC)를 제공하는 microspheres의 형태로 키토산을 활용. 이상적인 휴대 microsphere 비율은 배양 시간 및 로드할 수있는 세포의 최대 개수를 달성하기위한 세포 밀도에 대하여 산출된 것입니다. ASC는 키토산 microspheres (CSM)에 놓는되면, 그들은 콜라겐 발판에 포함된 및 확장 기간 동안 문화를 유지하실 수 있습니다. 요약이 연구는 정확하게 입체 biomaterial 발판 내에서 줄기 세포를 제공하는 방법을 제공합니다.

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Constructing a Collagen Hydrogel for the Delivery of Stem Cell-loaded Chitosan Microspheres

현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

Multipotent stem cells have been shown to be extremely useful in the field of regenerative medicine1-3. However, in order to use these cells effectively ...

constructing-collagen-hydrogel-for-delivery-stem-cell-loaded-chitosan

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

16.7K 조회수.  United States Army Institute of Surgical Research. 현재 줄기 세포 치료에서 주요 장애물은 호스트 조직으로 이들 세포를 전달하는 가장 효과적인 방법을 결정합니다. 지방 파생 줄기 세포들이 multipotency을 유지할 수 있도록하면서 여기에서, 우리는 효과적이고 접근 간단 키토산 기반의 전달 방법을 설명합니다.

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Engineering a Bilayered Hydrogel to Control ASC Differentiation

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in vivo. An area of research that holds promise in regenerative medicine is the combinatorial use of novel biomaterials and stem cells. A fundamental strategy in the field of tissue engineering is the use of three-dimensional scaffold (e.g., decellularized extracellular matrix, hydrogels, micro/nano particles) for directing cell function. This technology has evolved from the discovery that cells need a substrate upon which they can adhere, proliferate, and express their differentiated cellular phenotype and function 2-3. More recently, it has also been determined that cells not only use these substrates for adherence, but also interact and take cues from the matrix substrate (e.g., extracellular matrix, ECM)4. Therefore, the cells and scaffolds have a reciprocal connection that serves to control tissue development, organization, and ultimate function. Adipose-derived stem cells (ASCs) are mesenchymal, non-hematopoetic stem cells present in adipose tissue that can exhibit multi-lineage differentiation and serve as a readily available source of cells (i.e. pre-vascular endothelia and pericytes). Our hypothesis is that adipose-derived stem cells can be directed toward differing phenotypes simultaneously by simply co-culturing them in bilayered matrices1. Our laboratory is focused on dermal wound healing. To this end, we created a single composite matrix from the natural biomaterials, fibrin, collagen, and chitosan that can mimic the characteristics and functions of a dermal-specific wound healing ECM environment.

This protocol focuses on utilizing the inherent ability of stem cells to take cue from their surrounding extracellular matrix and be induced to differentiate into multiple phenotypes. This methods manuscript extends our description and characterization of a model utilizing a bilayered hydrogel, composed of PEG-fibrin and collagen, to simultaneously co-differentiate adipose-derived stem cells1.

ASC의 분화를 제어하는​​ Bilayered 히드로겔 꾸민

Natural polymers over the years have gained more importance because of their host biocompatibility and ability to interact with cells in vitro and in ...

연구

생체공학

Preparation of Chitosan-based Injectable Hydrogels and Its Application in 3D Cell Culture

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is prepared by mixing solutions of glycol chitosan with a synthesized benzaldehyde terminated polymer gelator, and hydrogels are efficiently obtained in several minutes at room temperature. By varying ratios between glycol chitosan, polymer gelator, and water contents, versatile hydrogels with different gelation times and stiffness are obtained. When damaged, the hydrogel can recover its appearances and modulus, due to the reversibility of the dynamic imine bonds as crosslinkages. This self-healable property enables the hydrogel to be injectable since it can be self-healed from squeezed pieces to an integral bulk hydrogel after the injection process. The hydrogel is also multi-responsive to many bio-active stimuli due to different equilibration statuses of the dynamic imine bonds. This hydrogel was confirmed as bio-compatible, and L929 mouse fibroblast cells were embedded following standard procedures and the cell proliferation was easily assessed by a 3D cell cultivation process. The hydrogel can offer an adjustable platform for different research where a physiological mimic of a 3D environment for cells is profited. Along with its multi-responsive, self-healable, and injectable properties, the hydrogels can potentially be applied as multiple carriers for drugs and cells in future bio-medical applications.

Here we describe a facile preparation of chitosan-based injectable hydrogels using dynamic imine chemistry. Methods to adjust the hydrogel&#8217;s mechanical strength and its application in 3D cell culture are presented.

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

The protocol presents a facile, efficient, and versatile method to prepare chitosan-based hydrogels using dynamic imine chemistry. The hydrogel is ...

화학

Engineering 3D Cellularized Collagen Gels for Vascular Tissue Regeneration

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. Collagen has been extensively used for a wide range of biomedical applications and is considered a valid alternative to synthetic materials due to its inherent biocompatibility (i.e., low antigenicity, inflammation, and cytotoxic responses). However, the limited mechanical properties and the related low hand-ability of collagen gels have hampered their use as scaffold materials for vascular tissue engineering. Therefore, the rationale behind this work was first to engineer cellularized collagen gels into a tubular-shaped geometry and second to enhance smooth muscle cells driven reorganization of collagen matrix to obtain tissues stiff enough to be handled.
The strategy described here is based on the direct assembling of collagen and smooth muscle cells (construct) in a 3D cylindrical geometry with the use of a molding technique. This process requires a maturation period, during which the constructs are cultured in a bioreactor under static conditions (without applied external dynamic mechanical constraints) for 1 or 2 weeks. The &#8220;static bioreactor&#8221; provides a monitored and controlled sterile environment (pH, temperature, gas exchange, nutrient supply and waste removal) to the constructs. During culture period, thickness measurements were performed to evaluate the cells-driven remodeling of the collagen matrix, and glucose consumption and lactate production rates were measured to monitor the cells metabolic activity. Finally, mechanical and viscoelastic properties were assessed for the resulting tubular constructs. To this end, specific protocols and a focused know-how (manipulation, gripping, working in hydrated environment, and so on) were developed to characterize the engineered tissues.

In this work, we present a technique for the rapid fabrication of living vascular tissues by direct culturing of collagen, smooth muscle cells and endothelial cells. In addition, a new protocol for the mechanical characterization of engineered vascular tissues is described.

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

Synthetic materials are known to initiate clinical complications such as inflammation, stenosis, and infections when implanted as vascular substitutes. ...

3D Hydrogel Scaffolds for Articular Chondrocyte Culture and Cartilage Generation

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer cartilage tissue offer a promising solution to repair articular cartilage. To select the optimal cell source for tissue repair, it is important to develop an appropriate culture platform to systematically examine the biological and biomechanical differences in the tissue-engineered cartilage by different cell sources. Here we applied a three-dimensional (3D) biomimetic hydrogel culture platform to systematically examine cartilage regeneration potential of juvenile, adult, and osteoarthritic (OA) chondrocytes. The 3D biomimetic hydrogel consisted of synthetic component poly(ethylene glycol) and bioactive component chondroitin sulfate, which provides a physiologically relevant microenvironment for in vitro culture of chondrocytes. In addition, the scaffold may be potentially used for cell delivery for cartilage repair in vivo. Cartilage tissue engineered in the scaffold can be evaluated using quantitative gene expression, immunofluorescence staining, biochemical assays, and mechanical testing. Utilizing these outcomes, we were able to characterize the differential regenerative potential of chondrocytes of varying age, both at the gene expression level and in the biochemical and biomechanical properties of the engineered cartilage tissue. The 3D culture model could be applied to investigate the molecular and functional differences among chondrocytes and progenitor cells from different stages of normal or aberrant development.

Cartilage repair represents an unmet medical challenge and cell-based approaches to engineer human articular cartilage are a promising solution. Here, we describe three-dimensional (3D) biomimetic hydrogels as an ideal tool for the expansion and maturation of human articular chondrocytes.

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

Human articular cartilage is highly susceptible to damage and has limited self-repair and regeneration potential. Cell-based strategies to engineer ...

Synthesis of Thermogelling Poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer the clinical advantages of being implanted minimally invasively and easily forming space-filling solids in irregularly shaped defects. Injectable biomaterials have been widely investigated as scaffolds for tissue engineering. However, for the repair of certain load-bearing areas in the body, such as the intervertebral disc, scaffolds should possess adhesive properties. This will minimize the risk of dislocation during motion and ensure intimate contact with the surrounding tissue, providing adequate transmission of forces. Here, we describe the preparation and characterization of a scaffold composed of thermally sensitive poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate (PNIPAAM-g-CS) and alginate microparticles. The PNIPAAm-g-CS copolymer forms a viscous solution in water at RT, into which alginate particles are suspended to enhance adhesion. Above the lower critical solution temperature (LCST), around 30 &#176;C, the copolymer forms a solid gel around the microparticles. We have adapted standard biomaterials characterization procedures to take into account the reversible phase transition of PNIPAAm-g-CS. Results indicate that the incorporation of 50 or 75 mg/ml&#160;alginate particles into 5% (w/v) PNIPAAm-g-CS solutions quadruple the adhesive tensile strength of PNIPAAm-gCS alone (p&#60;0.05). The incorporation of alginate microparticles also significantly increases swelling capacity of PNIPAAm-g-CS (p&#60;0.05), helping to maintain a space-filling gel within tissue defects. Finally, results of the in vitro toxicology assay kit, 2,3-bis-(2-methoxy-4-nitro-5-sulfophenyl)-2H-tetrazolium-5-carboxanilide (XTT) and Live/Dead viability assay indicate that the adhesive is capable of supporting the survival and proliferation of encapsulated Human Embryonic Kidney (HEK) 293 cells over 5 days.

Synthesis of Thermogelling PolyN-isopropylacrylamide-graft-chondroitin Sulfate Composites with Alginate Microparticles for Tissue Engineering

An injectable tissue engineering scaffold composed of poly(N-isopropylacrylamide)-graft-chondroitin sulfate (PNIPAAm-g-CS)-containing alginate microparticles was prepared. The adhesive strength, swelling properties and in vitro biocompatibility are analyzed in this study. The characterization techniques developed here may be applicable to other thermogelling systems.

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

Injectable biomaterials are defined as implantable materials that can be introduced into the body as a liquid and solidify in situ. Such materials offer ...

Protocols of 3D Bioprinting of Gelatin Methacryloyl Hydrogel Based Bioinks

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed from mammal collagen. Thus, the arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequences and target motifs of matrix metalloproteinase (MMP) remain on the molecular chains, which help achieve cell attachment and degradation. Furthermore, formation properties of GelMA are versatile. The methacrylamide groups allow a material to become rapidly crosslinked under light irradiation in the presence of a photoinitiator. Therefore, it makes great sense to establish suitable methods for synthesizing three-dimensional (3D) structures with this promising material. However, its low viscosity restricts GelMA's printability. Presented here are methods to carry out 3D bioprinting of GelMA hydrogels, namely the fabrication of GelMA microspheres, GelMA fibers, GelMA complex structures, and GelMA-based microfluidic chips. The resulting structures and biocompatibility of the materials as well as the printing methods are discussed. It is believed that this protocol may serve as a bridge between previously applied biomaterials and GelMA as well as contribute to the establishment of GelMA-based 3D architectures for biomedical applications.

Presented here is a method for the 3D bioprinting of gelatin methacryloyl.

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

Gelatin methacryloyl (GelMA) has become a popular biomaterial in the field of bioprinting. The derivation of this material is gelatin, which is hydrolyzed ...

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell cultures. Microcarrier culture technology has become one of the main techniques in cytological research and is commonly used in the field of large-scale cell expansion. Microcarriers have also been shown to play an increasingly important role in in vitro tissue engineering construction and clinical drug screening. Current methods for preparing microcarriers include microfluidic chips and inkjet printing, which often rely on complex flow channel design, an incompatible two-phase interface, and a fixed nozzle shape. These methods face the challenges of complex nozzle processing, inconvenient nozzle changes, and excessive extrusion forces when applied to multiple bioink. In this study, a 3D printing technique, called alternating viscous-inertial force jetting, was applied to enable the construction of hydrogel microcarriers with a diameter of 100-300 &#181;m. Cells were subsequently seeded on microcarriers to form tissue engineering modules. Compared to existing methods, this method offers a free nozzle tip diameter, flexible nozzle switching, free control of printing parameters, and mild printing conditions for a wide range of bioactive materials.

3D Printing of In Vitro Hydrogel Microcarriers by Alternating Viscous-Inertial Force Jetting

Presented here is a mild 3D printing technique driven by alternating viscous-inertial forces to enable the construction of hydrogel microcarriers. Homemade nozzles offer flexibility, allowing easy replacement for different materials and diameters. Cell binding microcarriers with a diameter of 50-500 &#181;m can be obtained and collected for further culturing.

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

Microcarriers are beads with a diameter of 60-250 &#181;m and a large specific surface area, which are commonly used as carriers for large-scale cell ...

Microfluidic Fabrication of Core-Shell Microcapsules carrying Human Pluripotent Stem Cell Spheroids

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and scalability. In this paper, we describe a strategy for the robust and reproducible formation of hPSC spheroids where a co-axial flow focusing device is utilized to entrap hPSCs inside core-shell microcapsules. The core solution contained single cell suspension of hPSCs and was made viscous by the incorporation of high molecular weight poly(ethylene glycol) (PEG) and density gradient media. The shell stream comprised of PEG-4 arm-maleimide or PEG-4-Mal and flowed alongside the core stream toward two consecutive oil junctions. Droplet formation occurred at the first oil junction with shell solution wrapping itself around the core. Chemical crosslinking of the shell occurred at the second oil junction by introducing a di-thiol crosslinker (1,4-dithiothreitol or DTT) to these droplets. The crosslinker reacts with maleimide functional groups via click chemistry, resulting in the formation of a hydrogel shell around the microcapsules. Our encapsulation technology produced 400 &#181;m diameter capsules at a rate of 10 capsules per second. The resultant capsules had a hydrogel shell and an aqueous core that allowed single cells to rapidly assemble into aggregates and form spheroids. The process of encapsulation did not adversely affect the viability of hPSCs, with &gt;95% viability observed 3 days post-encapsulation. For comparison, hPSCs encapsulated in solid gel microparticles (without an aqueous core) did not form spheroids and had &lt;50% viability 3 days after encapsulation. Spheroid formation of hPSCs inside core-shell microcapsules occurred within 48 h after encapsulation, with the spheroid diameter being a function of cell inoculation density. Overall, the microfluidic encapsulation technology described in this protocol was well-suited for hPSCs encapsulation and spheroid formation.

This article describes encapsulation of human pluripotent stem cells (hPSCs) using a co-axial flow focusing device. We demonstrate that this microfluidic encapsulation technology enables efficient formation of hPSC spheroids.

인간 다능성 줄기 세포 구상체를 운반하는 코어-쉘 마이크로캡슐의 미세유체 제조

Three-dimensional (3D) or spheroid cultures of human pluripotent stem cells (hPSCs) offer the benefits of improved differentiation outcomes and ...

Fabrication of Size-Controlled and Emulsion-Free Chitosan-Genipin Microgels for Tissue Engineering Applications

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, chitosan microgels are commonly fabricated using emulsion methods that require organic solvent rinses, which are toxic and harmful to the environment. The present protocol presents a rapid, non-cytotoxic, non-emulsion-based method for fabricating chitosan-genipin microgels without the need for organic solvent rinses. The microgels described herein can be fabricated with precise size control. They exhibit sustained release of biomolecules, making them highly relevant for tissue engineering, biomaterials, and regenerative medicine. Chitosan is crosslinked with genipin to form a hydrogel network, then passed through a syringe filter to produce the microgels. The microgels can be filtered to create a range of sizes, and they show pH-dependent swelling and degrade over time enzymatically. These microgels have been employed in a rat growth plate injury model and were demonstrated to promote increased cartilage tissue repair and to show complete degradation at 28 days in vivo. Due to their low cost, high convenience, and ease of fabrication with cytocompatible materials, these chitosan microgels present an exciting and unique technology in tissue engineering.

The present protocol describes a non-emulsion-based method for the fabrication of chitosan-genipin microgels. The size of these microgels can be precisely controlled, and they can display pH-dependent swelling, degrade in vivo,&#160;and be loaded with therapeutic molecules that release over time in a sustained manner, making them highly relevant for tissue engineering applications.

조직 공학 응용 분야를 위한 크기 조절 및 무유제 키토산-제니핀 마이크로젤 제조

Chitosan microgels are of significant interest in tissue engineering due to their wide range of applications, low cost, and immunogenicity. However, ...

내연골 골화술을 통한 뼈 재생을 위한 인공 연골 임플란트

Integrated Bone Formation Through In Vivo Endochondral Ossification Using Mesenchymal Stem Cells

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it does not have a mechanism to induce angiogenesis. Implanting artificial cartilage tissue fabricated from MSCs induces angiogenesis and bone formation in vivo via endochondral ossification (ECO). Therefore, this ECO-mediated approach may be a promising bone regeneration therapy in the future. An important aspect of the clinical application of this ECO-mediated approach is establishing a protocol for preparing enough cartilage to be implanted to repair the bone defect. It is especially not practical to design a single mass of grafted cartilage of a size that conforms to the shape of the actual bone defect. Therefore, the cartilage to be transplanted must have the property of forming bone integrally when multiple pieces are implanted. Hydrogels may be an attractive tool for scaling up tissue-engineered grafts for endochondral ossification to meet clinical requirements. Although many naturally derived hydrogels support MSC cartilage formation in vitro and ECO in vivo, the optimal scaffold material to meet the needs of clinical applications has yet to be determined. Hyaluronic acid (HA) is a crucial component of the cartilage extracellular matrix and is a biodegradable and biocompatible polysaccharide. Here, we show that HA hydrogels have excellent properties to support in vitro differentiation of MSC-based cartilage tissue and promote endochondral bone formation in vivo.

저자 스포트라이트: Vascularized Artificial Cartilage Integration을 통한 뼈 재생 향상 

Bone therapy via endochondral ossification by implanting artificial cartilage tissue produced from mesenchymal stem cells has the potential to circumvent the drawbacks of conventional therapies. Hyaluronic acid hydrogels are effective in scaling up uniformly differentiated cartilage grafts as well as creating integrated bone with vascularization between fused grafts in vivo.

중간엽 줄기세포를 이용한 In Vivo Endochondral Ossification Through Integrated Bone Formation

Conventional bone regeneration therapy using mesenchymal stem cells (MSCs) is difficult to apply to bone defects larger than the critical size because it ...

줄기 세포 - 로드된 키토산 Microspheres의 배달을 위해 콜라겐 히드로겔을 구축

요약

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이 비디오의 챕터

ASC의 분화를 제어하는 Bilayered 히드로겔 꾸민

주 사용 Hydrogels 키토 산 기반 및 3D 세포 배양에서의 응용의 준비

혈관 조직 재생을위한 엔지니어링 3D Cellularized 콜라겐 젤

관절 연골 세포 문화와 연골 생성을위한 3D 하이드로 겔 공사장 공중 발판

조직 공학 알긴산 미세 입자와 Thermogelling 폴리 (N- 이소 프로필) -graft - 콘드로이틴 황산 복합 재료의 합성

젤라틴 메타크릴 하이드로겔 기반 바이오잉크의 3D 바이오프린팅 프로토콜

점성-관성 포스 제팅을 번갈아 가며 생체외 하이드로겔 마이크로캐리어의 3D 프린팅

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