이 연구는 과학 사무소 (BER), 에너지의 미국학과, 아니 계약의 협동에 의해 지원되었다. 드 FC02 - 02ER63453, 국립 과학 재단 (National Science Foundation)의 미생물 게놈 시퀀싱 프로그램 (보너스 번호 0,626,826 및 0,731,916). 우리는 환경 샘플 컬렉션과 함께 자신의 지원에 대한 그의 기술적 전문성과 조언과 K. 에릭 Wommack에 대한 존 유리 주셔서 감사합니다.

1. 솔루션의 준비 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 수행하기 전에, 인산 버퍼가 준비되어야하며 히드록 시아파 타이트가 제대로 수산화해야합니다. <ol><li> 1M 인산 솔루션, 산도 6.8가 : 1L 플라스크에 살균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 일염기의의 119.98g 디졸브 무균, DEPC - H 2 O. 처리 중 1L의 나트륨 인산염 이염의 141.96g를 용해하여 1L 플라스크에 1M 인산 나트륨 이염 솔루션을 준비 1시 1분의 비율로 모노 및 디 - 솔루션을 결합합니다. 저어 플레이트와 자기 볶음 막대를 사용하여 혼합에 장소 술병. 수산화 나트륨 (산도를 증가) 또는 인산을 (산도를 감소)을 추가하여 6.8으로 산도를 조정합니다. </li><li> 0.12M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 30ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.18M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 45ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.20M 인산염 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml에 50ml을 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 0.40 M 인산 버퍼 : 500ml 플라스크에 1M 인산 솔루션 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 산도 6.8, 2.5ml, 그리고 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 5ml 100ml의 결합. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> &quot;1.00M 인산 버퍼는&quot;(이 용액에 인산염의 실제 농도가 0.91 M입니다) : 500ml 플라스크에 10 % 나트륨 dodecyl 황산염 (SDS)의 1M 인산 솔루션, pH6.8, 2.5ml의 30ml 결합하고, 5ml의 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 0.5M. 225ml의 볼륨 살균, DEPC - 처리 H2O를 추가합니다. 6.8으로 산도를 조정합니다. 250ml에 무균, DEPC - 처리된 H 2 O를 추가합니다. 압력솥. </li><li> 히드록 시아파 타이트 수화 : 히드록 시아파 타이트의 1g 밖에 무게와 50ml 튜브에 추가할 수 있습니다. 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가하고 섞어 반전. 이전 60 온도를 가져다 사용하는 ° C와 철저히 섞는다. 4 장시간 보관 ° C. </li><li> 사용하기 전에, 60 ° C. 모든 인산염 버퍼 및 수산화 히드록 시아파 타이트를 평형 </li></ol> 2. 이코노 - 열 준비 <ol><li> 꼭지를 닫습니다. 반복 반전 열의와 decanting로 deionized H 2 O와 열을 여러 번 씻어. </li><li> 이코노 열에서 꼭지를 제거하고 소독하는 열을 압력솥. </li><li> 교체 및 꼭지를 닫습니다. 이코노 열 살균와 코트 모든 유리 표면에 Sigmacote의 1ml을 추가합니다. 꼭지와 가만히 따르다를 엽니다. </li><li> 순환 물 목욕으로 컬럼을 첨부하고 60 온도를 설정할 ° C. 이러한 알루미늄 호일이나 발포 파이프 단열재로 단열 대리인의 컬럼을 포장 열 전체 열 손실의 최소 금액을 einsure하기 위해하는 것은 권장합니다. </li><li> 무균, RNase - 무료 0.12M 인산염 버퍼로 두 번 누른 다음 멸균, RNase 무료 H 2 O와 두 번 이코노 - 컬럼을 씻어. </li></ol> 3. Hydroxypaptite의 Chromotography <ol><li> 확실히 만드는 것은 꼭지가 닫혀 천천히 살균 2ml serological 피펫을 사용하여 이코노 - 칼럼의 맨 아래에 미리 준비 resuspended 히드록 시아파 타이트의 2ml 추가합니다. </li><li> 히드록 시아파 타이트가 30 분 동안 중력에 따라 해결하도록 허용합니다. </li><li> 열에 가까이 꼭지에서 버퍼를 드레인. 60 ° 열 블록이나 물을 욕조에 10 분 C. 500 μl와 부화의 최종 볼륨 0.12M 인산염 버퍼와 핵산을 결합 </li><li> 신속하게 열을 방해하지 않도록하는 2ml serological 피펫을 사용하여 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 준비 핵산을 적용합니다. </li><li> 핵산 30 분 동안 히드록 시아파 타이트에 바인딩을 허용합니다. </li><li> 열 아래 15ml 튜브를 삽입, 꼭지를 열고 ssDNA를 포함하는 초기 샘플을 수집합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> , 컬럼 방해 꼭지를 열고 이전 단계에서 15ml 튜브 단일 좌초된 DNA를 수집하지 않도록하는 히드록 시아파 타이트에 0.12M 인산염 버퍼 6ml를 추가합니다. 꼭지를 닫습니다. </li><li> 클로로포름 : 페놀 1 볼륨을 추가 isoamyl 알코올 (25:25:1 V / V / V) 튜브에 솔루션을 적극적으로 섞어 15 분 3,500 XG에 원심 분리기. 새로운 15ml 튜브에 뜨는 포함 ssDNA를 전송합니다. </li><li> 전자에 0.20M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복칼럼에서 류트와 정화 RNA는 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하는 컬럼의 dsDNA를 elute 및 정화 0.40M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li><li> 컬렉션에 대한 새 15ml 튜브를 사용해야하고 잔여 dsDNA의 열을 제거하기 위해서 1.00M 인산염 버퍼 6ml를 사용하여 3.76와 3.87를 반복합니다. </li></ol> 4. 핵산 샘플을 탈염 <ol><li> 샘플의 양도 4 - 5ml Amicon 울트라 - 4 Ultracel 막 잘라 30,000 분자량과 함께 장착된 필터 원심 장치. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치 샘플 (들)의 나머지 부분을 추가하고 Rnase 무료 1X TE 버퍼와 함께 4 - 5ml에 볼륨을 가져. </li><li> 6000 XG, 30 회전에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> Amicon 울트라 - 4 원심 필터 장치에 Rnase 무료 1X TE 버퍼 4 - 5ml를 추가합니다. 6000 XG, 30 centrifuging에 의해 &lt;500μl에 샘플을 집중 ° C, 고정 앵글 로터 5 분 (또는 농축 볼륨을 얻을 때까지). 을 통해 흐름을 폐기하십시오. </li><li> 완전히 핵산 샘플 (들) 탈염하다 단계 4.5에게 추가 5 회 반복합니다. </li><li> 멸균 1.7ml eppendorf 튜브에 남은 샘플 (들)을 전송합니다. 1/10th 볼륨 3M의 아세트산 나트륨, 산도 7.0, 100 % 에탄올 두 권, 그리고 Glycoblue의 1μl를 추가합니다. vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 28,000 XG, 4 ° C, 60 분 원심 분리기. 가만히 따르다는 펠렛을 방해하지 않도록하고. 70 % 에탄올의 300μl를 추가합니다. 10 분 28,000 XG, 상온에서 스핀. , 가만히 따르다 건조하고 Rnase없는 TE 버퍼의 적절한 볼륨의 각 부분을 resuspend. </li></ol> 5. 대표 결과 : 그림 1은 혼합 바이러스 조립에서 분류 ssDNA, dsDNA와 RNA 핵산에 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하는 제시 방법을 요약한 것입니다. 이 방법은 핵산의 부정 청구 인산염 백본과 긍정적인 요금 칼슘이 사이의 요금 상호 작용을 악용 + 이온은 히드록 시아파 타이트에있는 증가 인산염 버퍼 농도와 핵산 subtypes의 효율적인 분류 (ssDNA, dsDNA와 RNA)를 허용 12. 알려진 ssDNA (M13mp18), dsDNA (람다)와 RNA의 체외 &quot;커뮤니티&quot;에의 히드록 시아파 타이트 분류는 (MS2 및 phi6) 바이러스 genomes은 그림 2에서 보여주고있다. 핵산은 동일한 농도에서 결합 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용 인산염 버퍼의 증가 농도를 사용 eluted 하였다. 각 핵산 subtype 미만 9%는 다음 한 분수에서 - 이월와 다른 독립 elutes. 체사피크 베이에서 수집한 바이러스 공동체로부터 격리 핵산이 기술의 응용 프로그램은 그림 3에 표시됩니다. 정화 바이러스로부터 격리 총 핵산 수율이 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었다. ssDNA, RNA 및 dsDNA 구성된 게놈 자료는 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 인산 버퍼의 0.40M/1.00M 농도와 eluted했다. 두 번 좌초 DNA가 0.40M 및 1.00M의 인산 농도에 eluted이 경우, ssDNA와 RNA genotypes에 비해이 바이러스 공동체를 지배합니다. 이 관찰 복구할 핵산의 대부분 dsDNA 13아르 예상 바이러스 해양의 지역 사회 조성과 estuarine 환경과 일치합니다. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig1.jpg" alt="그림 1"/> 핵산의 분류에 대한 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법을 그림 1. 흐름 다이어그램. 0.12M 인산염 버퍼 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA의 혼합물은 60 ° C로 가열하여 일정한 60 유지 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되는 ° C 순환 물 목욕을 사용합니다. 핵산 (ssDNA, RNA 및 dsDNA)은 인산염 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트에서 eluted 있습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 알려진 바이러스 핵산의 분리. M13mp18 ssDNA, ssRNA MS2, phi6 dsRNA 및 람다 dsDNA (각각 2-5 차선)의 동일한 농도는 결합 (레인 6)와 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. SinglE - 좌초된 DNA (M13mp18), RNA (MS2/phi6)와 dsDNA (람다)가 독립적으로 0.12M (레인 8), 0.18M (레인 9)와 0.40M/1.00M (레인 10)를 사용하여 히드록 시아파 타이트 칼럼에서 eluted되었습니다 . 1킬로바이트 사다리 (레인 1, 7) 게놈 크기를 확인하는 데 사용되었다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12. <img src="/files/ftp_upload/3146/3146fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3. 체사피크 베이 내에서 지역 사회에서 격리 바이러스 핵산의 분리. 핵산은 고립과 히드록 시아파 타이트 컬럼에 적용되었습니다. ssDNA (레인 0.12M), RNA (레인 0.20M)와 dsDNA는 (차선 0.40M/1.0M) 독립적으로 각각 0.12M, 0.20M 및 0.40M/1.00M의 인산염 버퍼 농도를 사용하여 eluted되었습니다. 안녕 질량 DNA 사다리 (레인 L1)와 1킬로바이트 사다리 (레인 L2)는 시각 핵산의 대략적인 분자량 및 질량을 확인하는 데 사용되었습니다. 이 수치는 미생물학의 미국 사회의 허가를 재현되었으며 원래 앤드류스 - Pfannkoch 외에 실렸었습니다. 2010 12.

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	<li>Whitman, W. B., Coleman, D. C., Wiebe, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prokaryotes:+The+Unseen+Majority.">Prokaryotes: The Unseen Majority.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6578-65 (1998).</li><li>Hendrix, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+evolution+of+the+majority.">Bacteriophages: evolution of the majority.</a> Theor Popul Biol. 61, 471-471 (2002).</li><li>Weinbauer, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriophages:+Evolution+of+the+Majority.">Bacteriophages: Evolution of the Majority.</a> FEMS Microbiol Rev. 28, 127-127 (2004).</li><li>Dinsdale, E. A., Edwards, R. A., Hall, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Metabolic+Profiling+of+Nine+Biomes.">Functional Metabolic Profiling of Nine Biomes.</a> Nature. 455, 830-830 (2008).</li><li>McDaniel, L., Breitbart, M., Mobberley, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Lysogeny+in+Tampa+Bay:+Implications+for+Prophage+Gene+Expression.">Metagenomic Analysis of Lysogeny in Tampa Bay: Implications for Prophage Gene Expression.</a> PLoS ONE. 3, e3263-e3263 (2008).</li><li>Williamson, S. J., Rusch, D. B., Yooseph, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sorcerer+II+Global+Ocean+Sampling+Expedition:+Metagenomic+Characterization+of+Viruses+within+Aquatic+Microbial+Samples.">The Sorcerer II Global Ocean Sampling Expedition: Metagenomic Characterization of Viruses within Aquatic Microbial Samples.</a> PLoS ONE. 3, e1456-e1456 (2008).</li><li>Lang, A. S., Rise, M. L., Culley, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+Viruses+in+the+Sea.">RNA Viruses in the Sea.</a> FEMS Microbiol Rev. 33, 295-295 (2009).</li><li>Ng, T. F., Manire, C., Borrowman, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+a+Novel+Single-Stranded+DNA+Virus+from+a+Sea+Turtle+Fibropapilloma+by+using+Viral+Metagenomics.">Discovery of a Novel Single-Stranded DNA Virus from a Sea Turtle Fibropapilloma by using Viral Metagenomics.</a> J. Virol. 83, 2500-2500 (2009).</li><li>Rosario, K., Duffy, S., Breitbart, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+Circovirus-like+Genome+Architectures+Revealed+by+Environmental+Metagenomics.">Diverse Circovirus-like Genome Architectures Revealed by Environmental Metagenomics.</a> J Gen Virol. 90, 2418-2418 (2009).</li><li>Culley, A. I., Lang, A. S., Suttle, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Metagenomic+Analysis+of+Coastal+RNA+Virus+Communities.">Metagenomic Analysis of Coastal RNA Virus Communities.</a> Science. 312, 1795-1795 (2006).</li><li>Bernardi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chromotography+of+Nucleic+Acids+on+Hydroxyapatite.">Chromotography of Nucleic Acids on Hydroxyapatite.</a> Nature. 209, 779-779 (1965).</li><li>Andrews-Pfannkoch, C., Fadrosh, D. W., Thorpe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroxyapatite-Mediated+Separation+of+Double-Stranded+DNA,+Single-Stranded+DNA+and+RNA+Genomes+from+Natural+Viral+Assemblages.">Hydroxyapatite-Mediated Separation of Double-Stranded DNA, Single-Stranded DNA and RNA Genomes from Natural Viral Assemblages.</a> Applied and environmental microbiology. 76, 5039-5039 (2010).</li><li>Wommack, K. E., Colwell, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virioplankton:+Viruses+in+Aquatic+Ecosystems.">Virioplankton: Viruses in Aquatic Ecosystems.</a> Microbiol Mol Biol Rev. 64, 69-69 (2000).</li></ol>

관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

여기에 제시 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피 방법론 목표가 지역 사회의 총 핵산 성분을 연구하는 혼합 바이러스 assemblages에서 핵산의 분별 (분리)를위한 고효율하고 강력한 도구입니다. 일반적으로, ssDNA, RNA 및 dsDNA은 약 ~ 0and 0.40M 각각보다 큰 열을 검사하고 사진을 인산염 버퍼 농도에서 elute 것입니다. 그것이 알려진 핵산을 (재배 바이러스 준비의 예)를 사용하여 각각의 준비를 ?...

<table border="1"><tbody><tr><th> 재료 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 이코노 - 열 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 737-0717 </td><td> 0.7cm 아이디 패키지 / 2 </td></tr><tr><td> 히드록 시아파 타이트 </td><td> 바이오 방사선 </td><td> 130-0520 </td><td> DNA 학년 바이오 젤 HTP 젤, 100g/td&gt; </tr><tr><td> 인산 나트륨, 일염기의 </td><td> VWR </td><td> VW1497 - 01 </td><td> 일수화물, 크리스탈 500g </td></tr><tr><td> 인산 나트륨, 이염 </td><td> VWR </td><td> VW1496 - 01 </td><td> 무수, 파우더 500g </td></tr><tr><td> DEPC - 처리된 물 </td><td> Invitrogen </td><td> AM9922 </td><td> 1L </td></tr><tr><td> 10% SDS 솔루션 </td><td> Invitrogen </td><td> 24730-020 </td><td> UltraPure, 1L </td></tr><tr><td> 0.5M EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> Invitrogen </td><td> AM9262 </td><td> 산도 8.0, 1L </td></tr><tr><td> Sigmacote </td><td> 시그마 - 올드 리치 </td><td> SL2 - 25ML </td><td></td></tr><tr><td> 2ml serological pippette </td><td> VWR </td><td> 89130-884 </td><td> 폴리스티렌, 무균 </td></tr><tr><td> BD 팔콘의 원심 분리기 튜브 </td><td> VWR </td><td> 21008-936 </td><td> 15ml, 무균 </td></tr><tr><td> 페놀 : 클로로포름 : Isoamyl 알코올 (25:24:1 V / V / V) </td><td> Invitrogen </td><td> 15593-031 </td><td> UltraPure, 100ml </td></tr><tr><td> Amicon 울트라 - 4 원심 장치 </td><td> Millipore </td><td> UFC803024 </td><td> Ultracel - 30 멤브레인 </td></tr><tr><td> 20X TE 버퍼, Rnase 무료 </td><td> Invitrogen </td><td> T11493 </td><td> 100ml </td></tr><tr><td> Glycoblue </td><td> Invitrogen </td><td> AM9516 </td><td> 15mg/ml </td></tr></tbody></table>

separation of single-stranded dna, double-stranded dna and rna from an environmental viral community using hydroxyapatite chromatography

바이러스, 특히 bacteriophages은 (phages), 지구 1,2에서 가장 많은 생물 학적 실체입니다. 바이러스가 숙주 세포의 풍요로움과 다양성을 조절, 영양분의 순환에 기여, 세포 표현형를 호스팅 변경, 그리고 유전자 3의 측면 전송을 통해 숙주 세포와 바이러스 모두 지역 사회의 진화에 영향을 미칩니다. 많은 연구는 바이러스 및 자연 환경의 다양한 기능들이 잠재력의 압도적인 유전적 다양성을 강조했습니다. Metagenomic 기술은 taxonomic의 다양성과 회원 단일 좌초된 DNA (ssDNA), 두 번 좌초 DNA (dsDNA)와 RNA의 genotypes 4-9를 포함하는 복잡한 바이러스 assemblages의 기능 잠재력을 연구하는 데 사용되었습니다. 환경 DNA 함유 바이러스를하거나 RNA 함유를 연구하는 데 사용되는 현재 도서관 건설 프로토콜 nontargeted 템플릿 10을 제거하기 위해 초기 nuclease 치료를 필요로합니다. 그러나, 바이러스 지역 사회와 바이러스의 다양성의 집단 유전자 보완의 포괄적인 이해 관계 게놈 구성의 모든 구성원에 대한 지식이 필요합니다. 핵산 subtypes을 정화의 분류는 지역 사회의 유전자 서명의 일부를 희생하지 않고도 바이러스 assemblages을 연구하는 효과적인 메커니즘을 제공합니다. 히드록 시아파 타이트, 인산 칼슘의 결정 형태는 1960 년대 11 일 이후, 핵산의 분리뿐만 아니라 단백질과 미생물에서 채용되었습니다. 긍정적 - 충전 칼슘 2 사이 충전 상호 작용을 이용하여 + 히드록 시아파 타이트와 핵산 subtypes의 부정 청구 인산염 백본의 이온은, 그것이 우선적으로 다른 독립적인 각각의 핵산 subtype을 elute 수 있습니다. 우리는 최근에 DNA 시퀀싱 12 준비 ssDNA, dsDNA와 RNA 함유 바이러스 독립적으로 분류 genomes이 전략을 고용. 여기, 우리는 히드록 시아파 타이트 chromotography를 사용하여 혼합 바이러스 assemblages에서 ssDNA, dsDNA와 RNA 바이러스 핵산의 분류 및 복구를위한 방법을 제시한다.

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Separation of Single-stranded DNA, Double-stranded DNA and RNA from an Environmental Viral Community Using Hydroxyapatite Chromatography

우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

Viruses, particularly bacteriophages (phages), are the most numerous biological entities on Earth1,2.  Viruses modulate host cell abundance and diversity, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

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Immunology and Infection

31.5K 조회수.  The J. Craig Venter Institute. 우리는 환경 바이러스성 사회에서 단일 좌초 DNA를 두 번 좌초 DNA와 RNA 분자를 분리하는 효율적인 방법을 설명합니다. 핵산은 인산 함유 버퍼의 농도 증가와 히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 fractionated 있습니다. 이 방법은 환경 시료에서 바이러스 핵산 형식의 절연을 허용합니다.

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Unraveling the Unseen Players in the Ocean - A Field Guide to Water Chemistry and Marine Microbiology

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling protocols include the assessment of resources available to the microbial community (dissolved organic carbon, particulate organic matter, inorganic nutrients), and a comprehensive description of the viral and bacterial communities (via direct viral and microbial counts, enumeration of autofluorescent microbes, and construction of viral and microbial metagenomes). We use a combination of methods, which represent a dispersed field of scientific disciplines comprising already established protocols and some of the most recent techniques developed. Especially metagenomic sequencing techniques used for viral and bacterial community characterization, have been established only in recent years, and are thus still subjected to constant improvement. This has led to a variety of sampling and sample processing procedures currently in use. The set of methods presented here provides an up to date approach to collect and process environmental samples. Parameters addressed with these protocols yield the minimum on information essential to characterize and understand the underlying mechanisms of viral and microbial community dynamics. It gives easy to follow guidelines to conduct comprehensive surveys and discusses critical steps and potential caveats pertinent to each technique.

Here, we present a comprehensive protocol to assess the organic and inorganic nutrient availability and the abundance and structure of microbial and viral communities in remote marine environments.

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

Here we introduce a series of thoroughly tested and well standardized research protocols adapted for use in remote marine environments. The sampling ...

연구

환경과학

Preparation of Viral DNA from Nucleocapsids

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. Several downstream applications require large quantities of pure viral DNA, which is provided by this protocol. These applications include viral genome sequencing, where the removal of host DNA is crucial to optimize data output for viral sequences, and the production of new viral recombinant strains, where co-transfection of purified plasmid and linear viral DNA facilitates recombination.1,2,3 
This procedure utilizes a combination of extractions and density-based centrifugation to isolate purified linear herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells.4,5 The initial purification steps aim to isolate purified viral capsids, which contain and protect the viral DNA during the extractions and centrifugation steps that remove cellular proteins and DNA. Lysis of nucleocapsids then releases viral DNA, and two final phenol-chloroform steps remove remaining proteins. The final DNA captured from solution is highly concentrated and pure, with an average OD260/280 of 1.90. Depending on the quantity of infected cells used, yields of viral DNA range from 150-800 &mu;g or more. The purity of this DNA makes it stable during long-term storage at 4C. This DNA is thus ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections. 
Prior to beginning the protocol, it is important to know the average number of cells per dish (e.g. an average of 8 x 106 PK-15 cells in a confluent 15 cm dish), and the titer of the viral stock to be used (e.g. 1 x 108 plaque-forming units per ml). These are necessary to calculate the appropriate multiplicity of infection (MOI) for the protocol.6 For instance, to infect one 15 cm dish of PK-15 cells with the above viral stock, at an MOI of 5, you would use 400 &mu;l of viral stock and dilute it with 3.6 ml of medium (total inoculation volume of 4 ml for one 15 cm plate).
Multiple viral DNA preparations can be prepared at the same time. The number of simultaneous preparations is limited only by the number of tubes held by the ultracentrifuge rotor (one per virus; see step 3.9 below). Here we describe the procedure as though being done for one virus.

We describe the process of isolating high purity herpesvirus nucleocapsid DNA from infected cells. The final DNA captured from solution is of high concentration and purity, making it ideally suited for high-throughput sequencing, high fidelity PCR reactions, and transfections to produce new viral recombinants.

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Viruses are obligate cellular parasites, and thus the study of their DNA requires isolating viral material away from host cell contaminants and DNA. ...

면역학 및 감염병학

Detection of Viruses from Bioaerosols Using Anion Exchange Resin

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid impingement-based air sampling devices for efficacious concentration of negatively-charged viruses from bioaerosols. Thus, the resin serves as an additional concentration step in the bioaerosol sampling workflow. Nucleic acid extraction of the viral particles is then performed directly from the anion exchange resin, with the resulting sample suitable for molecular analyses. Further, this protocol describes a custom-built bioaerosol chamber capable of generating virus-laden bioaerosols under a variety of environmental conditions and allowing for continuous monitoring of environmental variables such as temperature, humidity, wind speed, and aerosol mass concentration. The main advantage of using this protocol is increased sensitivity of viral detection, as assessed via direct comparison to an unmodified conventional liquid impinger. Other advantages include the potential to concentrate diverse negatively-charged viruses, the low cost of anion exchange resin (~$0.14 per sample), and ease of use. Disadvantages include the inability of this protocol to assess infectivity of resin-adsorbed viral particles, and potentially the need for the optimization of the liquid sampling buffer used within the impinger.

An anion exchange resin-based method, adapted to liquid impingement-based bioaerosol sampling of viruses is demonstrated. When coupled with downstream molecular detection, the method allows for facile and sensitive detection of viruses from bioaerosols.

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

This protocol demonstrates a customized bioaerosol sampling method for viruses. In this system, anion exchange resin is coupled with liquid ...

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

생체공학

Bacterial Artificial Chromosomes: A Functional Genomics Tool for the Study of Positive-strand RNA Viruses

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose genomes have the same polarity as cellular mRNA. The cDNA-based reverse genetics system is a seminal method that enables direct manipulation of the viral genomic RNA, thereby generating recombinant viruses for molecular and genetic studies of both viral RNA elements and gene products in viral replication and pathogenesis. It also provides a valuable platform that allows the development of genetically defined vaccines and viral vectors for the delivery of foreign genes. For many positive-strand RNA viruses such as Japanese encephalitis virus (JEV), however, the cloned cDNAs are unstable, posing a major obstacle to the construction and propagation of the functional cDNA. Here, the present report describes the strategic considerations in creating and amplifying a genetically stable full-length infectious JEV cDNA as a bacterial artificial chromosome (BAC) using the following general experimental procedures: viral RNA isolation, cDNA synthesis, cDNA subcloning and modification, assembly of a full-length cDNA, cDNA linearization, in vitro RNA synthesis, and virus recovery. This protocol provides a general methodology applicable to cloning full-length cDNA for a range of positive-strand RNA viruses, particularly those with a genome of &gt;10 kb in length, into a BAC vector, from which infectious RNAs can be transcribed in vitro with a bacteriophage RNA polymerase.

Here, a protocol is presented for creating an infectious bacterial artificial chromosome containing a full-length cDNA of the positive-strand genomic RNA of Japanese encephalitis virus. This protocol can be used to construct a functional cDNA of other positive-strand RNA viruses, making it a powerful genomic tool for studying virus biology.

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

Reverse genetics, an approach to rescue infectious virus entirely from a cloned cDNA, has revolutionized the field of positive-strand RNA viruses, whose ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Combining Analysis of DNA in a Crude Virion Extraction with the Analysis of RNA from Infected Leaves to Discover New Virus Genomes

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low titers in their host or cannot be mechanically inoculated to another host are difficult to propagate to achieve a greater titer of infectious material. Infected leaves are ground in a mild buffer with optimal pH and ionic composition recommended for purifying most bacilliform Para retroviruses. Urea is used to break up inclusion bodies that trap virions and to dissolve cellular components. Differential centrifugation provides further separation of virions from plant contaminants. Then proteinase K treatment removes the capsids. Then the viral DNA is concentrated and used for next-generation sequencing (NGS). The NGS data are used to assemble contigs which are submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in the generated dataset. In a parallel pipeline, RNA is isolated from infected leaves using a standard column-based RNA extraction method. Then ribosome depletion is carried out to enrich for a subset of mRNA and virus transcripts. Assembled sequences derived from RNA sequencing (RNA-seq) were submitted to NCBI-BLASTn to identify a subset of virus sequences in this dataset. In our study, we identified two related full-length badnavirus genomes in the two datasets. This method is preferred to another common approach which extracts the aggregate population of small RNA sequences to reconstitute plant virus genomic sequences. This latter metagenomic pipeline recovers virus related sequences that are retro-transcribing elements inserted into the plant genome. This is coupled to biochemical or molecular assays to further discern the actively infectious agents. The approach documented in this study, recovers sequences representative of replicating viruses that likely indicate active virus infection.

Here we present a new approach to identify plant viruses with double-strand DNA genomes. We use standard methods to extract DNA and RNA from infected leaves and carry out next-generation sequencing. Bioinformatic tools assemble sequences into contigs, identify contigs representing virus genomes and assign genomes to taxonomic groups.

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

This metagenome approach is used to identify plant viruses with circular DNA genomes and their transcripts. Often plant DNA viruses that occur in low ...

Single-Step Heparin Affinity Chromatography를 이용한 AAV 벡터 정제

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

저자 스포트라이트: Adeno-Associated Viral Vectors의 생산 및 정제를 위한 개선된 방법

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

히드록 시아파 타이트 크로마 토그래피를 사용하여 환경 바이러스성 커뮤니티에서 단일 좌초 DNA, 더블 좌초된 DNA와 RNA의 분리

요약

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이 비디오의 챕터

물 화학 및 해양 미생물에 필드 가이드 - 바다에서 보이지 않는 선수를 해명

Nucleocapsids에서 바이러스성 DNA의 준비

Bioaerosols 음이온 교환 수 지를 사용 하 여 바이러스의 검출

세포 외 소포의 분리 및 특성에 대한 종이 기반의 장치

세균 인공 염색체 : RNA 바이러스 양성 가닥의 연구에 대한 기능 유전체학 도구

관련된 바이러스 및 세포질 단백질의 Id에 대 한 바이러스 성 DNA의 정화

새로운 바이러스 게놈을 발견 감염 된 잎에서 RNA 분석 원유 Virion 추출에 DNA의 결합 분석

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리

단일 단계 및 반자동 Heparin Affinity Chromatography Protocol을 통한 Adeno-associated viral vectors 분리