우리는 최고의 기술 서비스와 존 랄프 귀중한 조언, 토론 및 포플러 나무 샘플에 대해 위스콘신 대학의 매튜 로버트 웨더에게 감사하고 있습니다. 이 작품은 화학 과학, Geosciences 및 Biosciences 부문, 기초 에너지 과학, 과학의 사무실 미국 에너지학과 (수상 안돼. DE - FG02 - 91ER20021)과 에너지의 미 교육부 (DOE)에서 오대호의 사무실에 의해 투자되었다 Bioenergy 연구 센터 (과학 DOE BER 사무소 DE - FC02 - 07ER64494).

1. 세포 벽 절연 <ol><li> 갈기 대략 60 - 70mg의 공기 또는 retschmill (1 분, 25 Hz에서)를 사용하여 2ml sarstedt 스크류 캡 튜브에 5.5 mm 스테인레스 스틸 공 건조 식물 자료를 동결. 대안은 높은 처리량 연삭 및 로봇 칭했다 iWall을 분배의 사용은 부 3에 설명되어 있습니다. </li><li> 세포 벽 절연 절차를 계속하기 전에 강철 공을 제거 세포 벽 재료의 준비의 상세한 프로토콜은 부 3 표시됩니다. 여기에 완성도 프로토콜의 서면 단계를하십시오. </li><li> 1.5 70% 수성 에탄올의 ML, 그리고 철저하게 소용돌이를 추가 </li><li> 펠렛 10 분 알코올 불용성 잔류물을 위해 10,000 RPM에서 원심 분리기 </li><li> 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 </li><li> 잔류물에 클로로포름 / 메탄올 (1:1 V / V) 솔루션의 1.5 ML를 추가하고 펠렛을 resuspend하기 위해 철저하게 튜브를 흔들 </li><li> 10 분 10,000 rpm으로 원심 분리기 및 뜨는을 대기음 또는 가만히 따르다 </li><li> 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 </li><li> 35 공기의 흐름과 용매를 증발 ° C를 건조까지 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li><li> 예제 0.1 M sodiumacetate 버퍼 산도 5.0 1.5 ML에 다시 중지 펠렛에서 전분의 제거를 시작합니다. </li><li> 20 분 대한 sarstedt 튜브와 열을 모자. 80 ° C 가열 블록에. </li><li> 얼음 정지 냉각 </li><li> 펠렛 다음 에이전트를 추가합니다 : 35 0.01 % Sodiumazide의 μl (난 3), 35 μl 아밀라아제 (50 μg/1mL H 2 O, 바실러스 종, 시그마), 17 μl Pullulanase (바실러스 acidopullulyticus에서 18.7 단위, 시그마) . 튜브와 철저하게 소용돌이를 캡. </li><li> 정지 37 박 이상 incubated입니다 ° 통에 C. 튜브를 Orienting 수평 보좌관은 혼합 향상. </li><li> 100 열 정지 ° C 소화를 종료하기 위해 가열 블록에서 10 분. </li><li> 원심 분리기 (10,000 RPM, 10 분) 및 폐기 뜨는 포함 solubilized 전분 </li><li> , 1.5 ML 물을 추가 vortexing, centriguation 및 세척 물을 decanting하여 나머지 펠렛을 세 번 씻으십시오. </li><li> 아세톤 500 UL에 resuspend 펠릿 </li><li> 건조까지 35 공기의 흐름 ° C로 용매를 증발. 그것은 더 건조 주걱으로 튜브에 재료를 헤어지게하는 것도 필요할 수 있습니다. 마른 재료는 절연 세포 벽 (lignocellulosics)를 제공합니다. 필요한 건조 표본은 추가 처리까지 방 온도에서 저장될 수있다면. </li></ol> 2. 매트릭스 다당류 성분 이 방법은 기본적으로 Albersheim 1 발행 방식의 변경이다. <ol><li> 벽 소재의 monosaccharide 구성을 확인하려면 직접 또는 iWall, 로봇 분쇄 및 무게 로봇을 사용하여 highthroughput 방식 중 2ml starstedt 튜브에 세포 벽 재료 2 MG 나가는거야. </li><li> 내부 표준으로 이노시톨 솔루션 (5mg/ml) 20 UL을 추가합니다. 2 MG 세포 벽 샘플을 위해 100 UG를 추가하는 것이 좋습니다. </li><li> 튜브의 바닥에있는 세포 벽 자료를 수집하는 아세톤 250 UL과 튜브 벽을 씻어하고, 공기에서 아세톤은 매우 부드러운 증발. </li><li> 약한 산성 가수 분해에 대한 각각의 샘플에 2M trifluoroacetic 산성 (TFA) 250 UL를 추가합니다. 어떤 물질이 튜브 벽에까지 치켜하지 않도록 신중하게 TFA를 추가합니다. </li><li> 단단히 뚜껑 121 90 분 품어 ° 가열 블록의 C. </li><li> 얼음 가열 블록 및 샘플을 냉각. </li><li> 10 분 10,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기. </li><li> 펠렛 자료를 방해하지 않도록하는 유리 스크류 캡 튜브에 monosaccharide를 파생 매트릭스 다당류를 포함하는 산성 뜨는 100 UL을 전송. 펠렛은 (3을 참조하십시오.) 아래의 결정성 셀룰로오스 분석에 사용할 수 </li><li> 증발 장치의 공기의 부드러운 흐름에 따라 유리관에 TFA를 증발. </li><li> 300 μl 2 - 프로파놀, 소용돌이를 추가하고 25 증발 ° C (세 번 총 반복) </li><li> alditol 아세테이트 derivati​​zation 절차의 첫 번째 단계는 해당 alditols 수있는 단당류의 감소를 수행하는 것입니다. 이러한 목적으로 각 건조 시료에 나트륨 borohydride 솔루션 200 μl를 추가합니다. 신선한 해결책에게 1M 질산 수산화의 1ml 당 나트륨 borohydride의 10mg을 사용하여 각 시간을 준비합니다. </li><li> 1.5 시간 동안 실온에서 유리관를 떠나 </li><li> 빙초산 150 UL 추가하여 솔루션을 중화 </li><li> 25 와동과 증발 ° C. </li><li> 250 μl 초산 / 메탄올 (1시 9분, V / V), 소용돌이를 추가하고 25 증발 ˚ C </li><li> (세 번 총 반복) 250 μl 메탄올을 추가하고, 공기의 흐름에 따라 증발 </li><li> alditols의 아세틸화 들면, 아세트산 무수물 50 μl와 Pyrid 50 μl를 추가121 20 분 이네, 소용돌이 그리고 품어 ° 가열 블록의 C. </li><li> 얼음 블록 시원하고 샘플 다운은 약 상온으로 온도 감소를 기다리는 동안. </li><li> 상온에서 공기의 부드러운 흐름에 따라 시약을 증발. 주의 : alditol acetates는 매우 휘발성이 있습니다. </li><li> 공기 아래에 200 μl 톨루엔을 추가하고 증발 (X3) </li><li> 마지막 단계에서는 alditol acetates가 추출됩니다. 첫째, 에틸 아세테이트 및 가볍게 소용돌이 500 UL를 추가합니다. </li><li> 이 물을 ML, 캡 튜브와 와동를 추가합니다. </li><li> 맑은 별도의 레이어 (상단에 에틸 아세테이트, 바닥에 물)을 구하는 5 분 2,000 RPM에서 튜브를 원심 분리기 </li><li> 삽입과 GC / MS 유리병에 에틸 아세테이트 층의 피펫 50 UL. </li><li> GC - 유리병과 뚜껑에 아세톤 100 UL을 추가하여 희석. 샘플 농도가 너무 높은 경우 샘플 볼륨 및 희석 볼륨은 GC / MS를 과부하 방지하기 조정할 수 있습니다. GC - 유리병 4 ° C가, GC / MS 분석을 즉시 진행되지 않는 경우에 저장할 수 있습니다 </li><li> 샘플은 quadrupole MS를 갖춘 GC에 주입하지만, 불꽃 이온화 검출기도 적합합니다. Supelco SP - 2380 (30mm X 0.25mm X 0.25 μm의 필름 두께) 컬럼 4min 용매 지연과 1.5ml/min의 유량과 함께 사용됩니다. 주입 샘플은 다음과 온도 프로그램에 들어서는 아르 : 160에서 초기 개최 ° 2 분 C, 20 ° 200 C / 분 램프 ° C 5 분 개최, 20 ° 245 C / 분 램프 ° C 유지 12 분, 270 스파이크 ° C와 160 ° C 2.26의 초기 온도까지 냉각하기 전에 5 분 기다) 봉우리가 표준 대량 프로필 및 / 또는 유지 시간에 의해 식별됩니다.. 단당류는 표준 곡선에 따라 계량입니다. </li></ol> 3. 결정 셀룰로오스 내용 이 방법은 기본적으로 Updegraf 8 시까지 설명되어 있습니다. 절연 세포 벽 재료 (1 참조) 또는 이미 2M TFA (2.8 참조) 중 남아있는 펠렛 즉시 산성 치료 후 (2.8 참조) 또는 TFA로 처리되어 벽의 재질 :이 절차를위한 시작 물질의 여러 가지가 있습니다 2 - 프로파놀, 말린과 함께 세탁되었습니다 펠릿. <ol><li> Updegraff 시약의 나사 덮인 유리관 1 ML (질산 : 물, 8시 1분 2초 V / V 초산)에서 TFA 펠렛에 추가합니다. </li><li> 100 가열 블록에 밀접하게 캡 튜브, 소용돌이, 그리고 열 ° C 30 분. 이 치료의 결과로만 결정 셀룰로오스는 펠렛의 불용성 남아 있습니다. </li><li> 객실 온도 또​​는 냉각기에 얼음 블록 시원하고 샘플 </li><li> 원심 분리기 샘플 15 분 10,000 rpm으로 </li><li> 펠렛이 없어야하고 제거 펠렛부터 물질이 아니라고 보장 뜨는 폐기하십시오. 이런 목적을 위해 약 두십시오. 튜브의 표면에 뜨는 150 UL. </li><li> , 원심 분리기를 흔들, 물 1.5 ML를 추가하여 위의 완료로 뜨는 취소 </li><li> 아세톤 1.5 ML을 사용하여 프로 시저 추가 3 번 반복 세척 </li><li> 공기 건조 펠렛은 매우 부드럽게 공기 같이, 또는 야간 벤치에서 건조시킬 </li><li> 펠렛 (결정 셀룰로오스)는 Saeman 가수 분해라는 무엇에 의해 지금은 포도당으로 완전히 분해됩니다. 이러한 목적은 sarstedt 튜브에 175 μl 72%의 황산을 추가를위한 </li><li> 또 다른 15 분 30 분, 소용돌이 및 부화에 대한 실온에서 알을 품다 </li><li> 825 μl 물 소용돌이를 추가 </li><li> 5 분 10,000 RPM에서 샘플을 원심 분리기. 튜브에 남아 약간 갈색 불용성 물질, 리그닌이있을 수 있습니다. </li><li> 뜨는의 포도당 내용은 colorimetric anthrone 분석을 사용하여 assayed입니다. 이 분석은 96 잘 폴리스티렌 microtiter 플레이트에서 수행됩니다. </li><li> 표준 곡선은 1mg/ml 포도당 주식 (0 ° C에서 저장)을 사용하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UL을 pipetting하여 0, 2, 4, 6, 8, 10 UG 표준을 중복 작성을위한 별도의 적합한 우물에. 물을 각각 잘 최대 100 UL을 입력합니다. </li><li> 별도의 셀에하지만 표준으로 동일한 microtiter 접시에 각 시료 표면에 뜨는 10 μl와 물 90 ML를 추가합니다. </li><li> 신선한 Anthrone 시약 (Anthrone이 집중 황산, 2 MG anthrone / ML 황산에 용해) 200 μl를 추가 </li><li> 80 30 분 열 플레이트 오븐에 ° C (알루미늄 히트 스프 레더). 포도당이 포함된 샘플은 푸른 녹색으로 노란색에서 설정합니다. </li><li> 룸 온도에 접시가 식지 철저하게 발라줍니다. </li><li> microtiter 접시 리더를 사용하여 625mm에서 접시의 흡수를 참조하십시오. </li><li> 포도당 (그리고 따라서 결정 셀룰로오스 함량)가 같은 접시에 설립 표준 곡선과 비교하여 흡광도를 기반으로 계산됩니다. </li></ol> 4. 대표 결과 벽 분석의 예제는 그림 2에 표시됩니다. 이 경우에는 포플러 줄기 (나무)은 프로토콜 섹션에서 설명한 여러 가지 절차에 의해 분석되었다. 매트릭스 POlysaccharide 구성이 식물 세포 벽에있는 전형적인 설탕 선물을 식별하는 예제 크로마토 그램으로 강조 표시됩니다, fucose, rhamnose, 자일로 오스, arabinose, 갈락토 오스, mannose와 포도당 (및 내부 표준 이노시톨). 높은 자일로 오스 함량에 의해 증명으로 포플러의 주요 hemicellulosic 구성 요소 크실란입니다. 그러나 이러한 당분의 풍부한는 공급 원료의 used4에 따라 달라집니다. 이 분석에서 포도당은 hemicellulose의 xyloglucan 및 비정질 셀룰로스에서 파생됩니다. 분석에 의한 데이터는 몰의 % 또는 UG / MG 벽 재​​료 (또는 건조 중량)로 제시하실 수 있습니다. 결정 셀룰로오스의 내용은 자체 설명이고, 하나는 벽 건조 무게의 20-50% 사이의 가치를 기대할 수 있습니다. 여기 부품 I3에 표시된 결과를 바탕으로 포플러 나무의 리그노셀룰로오스성 구성은 21 % 리그닌, 30 % hemicelluloses 및 41% 결정 셀룰로오스이다. 나머지 화산재 것입니다. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1 :. 리그노셀룰로오스성 분석의 개요 세포 벽 (lignocellulosics)는 원유 건조 식물으로부터 격리됩니다. 벽 재료는 다음 aliquots에 가중치 및 다양한 assays에 대한 세분화됩니다. 매트릭스 다당류 성분은 약한 산성 (2M TFA)와 벽에 자료를 치료 자신의 alditol acetates하는 결과 solubilized 단당류를 derivati​​zing하고, GC - MS에 의해 분석 후에 설정됩니다. 약한 산성 치료의 잔여물은 소위 Updegraff 시약은 뒤에서만 불용성 crystlline의 셀룰로오스를 떠나지로 세탁합니다. 셀룰로오스는 황산에 의해 solubilized 및 포도당 내용을 결정하는 colorimetric 분석하여 계량입니다. 부 3에서 설명한대로 병렬로, 리그닌의 내용과 구성이 결정하실 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1837/1837fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2 :. 포플러 (포풀러스 tremoloides)에서 포플러 나무 종합 리그노셀룰로오스성 분석 우드 칩은 설명 프로토콜에 받게되었습니다. 왼쪽 상단 : 매트릭스 다당류 성분, Fuc fucose, rhamnose Rha, 아라 arabinose, Xyl 자일로 오스, 남자 mannose, 걸 갈락토 오스, Glc 포도당, 이노시톨 내부 기준.

<ol>
	<li>Albersheim, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+analysis+of+sugars+in+plant+cell+wall+polysaccharides+by+gas-liquid+chromatography.">A method for the analysis of sugars in plant cell wall polysaccharides by gas-liquid chromatography.</a> Carbohydr. Res. 5, 340-340 (1967).</li><li>Carroll, A., Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellulosic+Biofuels.">Cellulosic Biofuels.</a> Annu Rev Plant Biol. 60, 165-165 (2009).</li><li>Foster, C. E., Martin, T., Pauly, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+compositional+analysis+of+Plant+Cell+Walls+(Lignocellulosic+biomass),+Part+I:+Lignin.">Comprehensive compositional analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass), Part I: Lignin.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2010).</li><li>Pauly, M., Keegstra, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-wall+carbohydrates+and+their+modification+as+a+resource+for+biofuels.">Cell-wall carbohydrates and their modification as a resource for biofuels.</a> Plant J. 54 (4), 559-559 (2008).</li><li>Somerville, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+systems+approach+to+understanding+plant-cell+walls.">Toward a systems approach to understanding plant-cell walls.</a> Science. 306 (5705), 2206-2206 (2004).</li><li>Teeri, T. T., Brumer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery,+characterisation+and+applications+of+enzymes+from+the+wood-forming+tissues+of+poplar:+Glycosyl+transferases+and+xyloglucan+endotransglycosylases.">Discovery, characterisation and applications of enzymes from the wood-forming tissues of poplar: Glycosyl transferases and xyloglucan endotransglycosylases.</a> Biocatalysis and Biotransformation. 21, 173-173 (2003).</li><li>UPDEGRAF, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SEMIMICRO+DETERMINATION+OF+CELLULOSE+IN+BIOLOGICAL+MATERIALS.">SEMIMICRO DETERMINATION OF CELLULOSE IN BIOLOGICAL MATERIALS.</a> Anal. Biochem. 32 (3), 420-420 (1969).</li></ol>

설명 방법 리그노셀룰로오스성 식물 바이오 매스의 구성의 급속한 양적 평가를 가능하게합니다. 방법은 즉 매트릭스 다당류 hemicelluloses의 설탕 구성, 결정 셀룰로오스 내용을 포함하여 같은 물질의 조성의 결정 수 있습니다. 인당 다양한 분석 방법의 처리량이 다릅니다. 여기에서 설명한 프로토콜을 사용하여, 20 샘플이 결정 셀룰로오스 내용에 대한 매트릭스 다당류의 성분과 30 처리할 수 있습니다. 데이터 최적의 공급 원료 작물의 양적 특성으로 인해, 다양한이나 genotypes는 생물 연료 생산을위한 그들의 적합성의 관점에서 평가하실 수 있습니다.

<table><tbody><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>myo-Inositol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5125</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Borohydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>213462</td><td></td></tr><tr><td>Pyridine</td><td>JT Baker</td><td>3348-01</td><td></td></tr><tr><td>Acetic Anhydride</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Spectromax Plus 384</td><td>Molecular Devices</td><td>Plus384</td><td></td></tr><tr><td>GC-MS</td><td>Agilent Technologies</td><td>7890A GC/5975C MSD</td><td></td></tr><tr><td>5.5mm Stainless Steel Balls</td><td>Salem Ball Company</td><td>(N/A)</td><td></td></tr><tr><td>96 well plate heat spreader</td><td>Biocision</td><td>Coolsink 96F</td><td></td></tr><tr><td>Retsch Mill</td><td>Qiagen</td><td>TissueLyser II</td><td></td></tr><tr><td>Heating block</td><td>Techne</td><td>Dri-block DB-3D</td><td></td></tr><tr><td>Sample concentrator</td><td>Techne</td><td>FSC400D</td><td></td></tr></tbody></table>

comprehensive compositional analysis of plant cell walls (lignocellulosic biomass) part ii: carbohydrates

재생, 탄소 중립, 그리고 산업과 사회에 대한 지속적인 원료의 필요성은 21 세기의 가장 눌러 문제 중 하나가되고있다. 이것은 교통 액체 연료의 생산을위한 산업 원료 등 공장 제품의 사용에 흥미를 rekindled있다<sup&gt; 2</sup이러한 biocomposite 자료 등&gt; 및 기타 제품<sup&gt; 6</sup&gt;. 식물 바이오 매스는 지구상에서 가장 큰 미개척 보유 중 하나 남아있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 그것은 주로 에너지 셀룰로오스를 포함한 다양한 고분자 다양한 hemicelluloses 및 폴리페놀 리그닌 구성되어 있으며 세포 벽 구성됩니다<sup&gt; 5</sup&gt; 때문에 때로는 lignocellulosics를 칭했다. 그러나, 식물의 세포 벽을 벽에 강도와 전체 식물의 구조적 무결성에 광범위하게 기여로 저하에 완강히 저항하는 것으로 진화했습니다. 의 필요한 강성에도 불구하고, 세포 벽이 metabolically 활성 및 식물의 성장과 분화와 같은 다양한 세포 활동에 중요한 역할을 담당하고 매우 역동적인 실체이다<sup&gt; 5</sup&gt;. 벽의 다양한 기능으로 인해 엄청난 구조적 다양성은 단일 플랜트 내의 다른 식물 종의 및 세포 유형의 벽 안에있다<sup&gt; 4</sup&gt;. 따라서 농작물 종, 작물 다양성, 또는 식물의 조직이 biorefinery 사용되는 무엇에 따라, 화학 / 효소 프로세스와 액체 바이오 연료에 대한 다양한 설탕의 후속 발효에 의해 depolymerisation에 대한 처리 단계 조정하고 최적화해야합니다. 이 사실 뒷받침 식물 바이오 매스 feedstocks의 철저한 특성화를위한 필요합니다. 여기 lignocellulosics의 구성의 결정을 가능하게 높은 처리량 분석 매체 (그림 1) 의무가있는 포괄적인 분석 방법을 설명합니다. 방법은 destarched 세포 벽 재료 준비와 함께 시작합니다. 그 결과 lignocellulosics는 다음의 hemicelluloses의 monosaccharide 구성 및 기타 매트릭스 polysaccharides1하고, 결정 셀룰로오스의 내용을 확인하기 위해 갈라 아르<sup&gt; 7</sup&gt;. 리그노셀룰로오스성 바이오 매스의 리그닌 구성 요소를 분석하는 프로토콜은 부분을 설명합니다 I<sup&gt; 3</sup&gt;.

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part II: Carbohydrates

식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 2 부 : 탄수화물

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st ...

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Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part II: Carbohydrates

Unit 1

Plant Cell Structure and Organization

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30.0K 조회수.  Michigan State University (MSU). 식물 바이오 매스는 바이오 연료 생산에 사용될 수있는 주요 탄소 중립 되살릴 수있는 자원입니다. 식물 바이오 매스는 주로 세포 벽, lignocellulosics를 칭했다 구조적으로 복잡한 복합 재료로 구성되어 있습니다. 여기서 우리는 콘텐츠와 벽 파생 탄수화물의 구성의 포괄적인 분석을 위해 프로토콜을 설명합니다.

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Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The analysis does not usually require extensive sample preparation; structural and chemical information can be obtained without labeling. However, each Raman image contains thousands of spectra; this raises difficulties when extracting hidden information, especially for components with similar chemical structures. This work introduces a multivariate analysis to address this issue. The protocol establishes a general method to visualize the main components, including lignin, cellulose, and hemicellulose within the plant cell wall. In this protocol, procedures for sample preparation, spectral acquisition, and data processing are described. It is highly dependent upon operator skill at sample preparation and data analysis. By using this approach, a Raman investigation can be performed by a non-specialist user to acquire high-quality data and meaningful results for plant cell wall analysis.

This protocol aims to present a general method to visualize lignin, cellulose, and hemicellulose in plant cell walls using Raman imaging and multivariate analysis.

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

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연구

생화학

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts of purified material. Here, we describe a simple method for gaining detailed polysaccharide structural information, including resolution of structural isomers. For polysaccharide analysis by gel electrophoresis (PACE), plant cell wall material is hydrolyzed with glycosyl hydrolases specific to the polysaccharide of interest (e.g., mannanases for mannan). Large format polyacrylamide gels are then used to separate the released oligosaccharides, which have been fluorescently labeled. Gels can be visualized with a modified gel imaging system (see Table of Materials). The resulting oligosaccharide fingerprint can either be compared qualitatively or, with replication, quantitatively. Linkage and branching information can be established using additional glycosyl hydrolases (e.g., mannosidases and galactosidases). Whilst this protocol describes a method for analyzing glucomannan structure, it can be applied to any polysaccharide for which characterized glycosyl hydrolases exist. Alternatively, it can be used to characterize novel glycosyl hydrolases using defined polysaccharide substrates.

A protocol for the structural analysis of polysaccharides by gel electrophoresis (PACE), using mannan as an example, is described.

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

화학

Preparation of Fungal and Plant Materials for Structural Elucidation Using Dynamic Nuclear Polarization Solid-State NMR

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR and sensitivity-enhanced DNP experiments. The sample processing procedure of plant biomass is also detailed. This method allows the measurement of a series of 1D and 2D 13C-13C/15N correlations spectra, which enables high-resolution structural elucidation of complex biomaterials in their native state, with minimal perturbation. The isotope-labeling can be examined by quantifying the intensity in 1D spectra and the polarization transfer efficiency in 2D correlation spectra. The success of dynamic nuclear polarization (DNP) sample preparation can be evaluated by the sensitivity enhancement factor. Further experiments examining the structural aspects of the polysaccharides and proteins will lead to a model of the three-dimensional architecture. These methods can be modified and adapted to investigate a wide range of carbohydrate-rich materials, including the natural cell walls of plants, fungi, algae and bacteria, as well as synthesized or designed carbohydrate polymers and their complex with other molecules.

A protocol for preparing 13C,15N-labeled fungal and plant samples for multidimensional solid-state NMR spectroscopy and dynamic nuclear polarization (DNP) investigations is presented.

곰 팡이의 준비 및 동적인 핵 분극 고체 NMR을 사용 하 여 구조 설명에 대 한 식물 재료

This protocol shows how uniformly 13C, 15N-labeled fungal materials can be produced and how these soft materials should be proceeded for solid-state NMR ...

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls (Lignocellulosic biomass) Part I: Lignin

The need for renewable, carbon neutral, and sustainable raw materials for industry and society has become one of the most pressing issues for the 21st century. This has rekindled interest in the use of plant products as industrial raw materials for the production of liquid fuels for transportation1 and other products such as biocomposite materials7. Plant biomass remains one of the greatest untapped reserves on the planet4. It is mostly comprised of cell walls that are composed of energy rich polymers including cellulose, various hemicelluloses (matrix polysaccharides, and the polyphenol lignin6 and thus sometimes termed lignocellulosics. However, plant cell walls have evolved to be recalcitrant to degradation as walls provide tensile strength to cells and the entire plants, ward off pathogens, and allow water to be transported throughout the plant; in the case of trees up to more the 100 m above ground level. Due to the various functions of walls, there is an immense structural diversity within the walls of different plant species and cell types within a single plant4. Hence, depending of what crop species, crop variety, or plant tissue is used for a biorefinery, the processing steps for depolymerization by chemical/enzymatic processes and subsequent fermentation of the various sugars to liquid biofuels need to be adjusted and optimized. This fact underpins the need for a thorough characterization of plant biomass feedstocks. Here we describe a comprehensive analytical methodology that enables the determination of the composition of lignocellulosics and is amenable to a medium to high-throughput analysis. In this first part we focus on the analysis of the polyphenol lignin (Figure 1). The method starts of with preparing destarched cell wall material. The resulting lignocellulosics are then split up to determine its lignin content by acetylbromide solubilization3, and its lignin composition in terms of its syringyl, guaiacyl- and p-hydroxyphenyl units5. The protocol for analyzing the carbohydrates in lignocellulosic biomass including cellulose content and matrix polysaccharide composition is discussed in Part II2.

Comprehensive Compositional Analysis of Plant Cell Walls Lignocellulosic biomass Part I: Lignin

Plant biomass is a major carbon-neutral renewable resource that could be used for the production of biofuels. Plant biomass consists mainly of cell walls, a structurally complex composite material termed lignocellulosics. Here we describe a protocol for a comprehensive analysis of the content and composition of the polyphenolic lignin.

식물 세포 벽의 종합 작곡 분석 (리그노셀룰로오스성 바이오 매스) 부 I : 리그닌

생물학

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

Glycan Profiling of Plant Cell Wall Polymers using Microarrays

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the raw materials for human societies (e.g. wood, paper, textile and biofuel industries)1,2. However, understanding the biosynthesis and function of these components remains challenging.
Cell wall glycans are chemically and conformationally diverse due to the complexity of their building blocks, the glycosyl residues. These form linkages at multiple positions and differ in ring structure, isomeric or anomeric configuration, and in addition, are substituted with an array of non-sugar residues. Glycan composition varies in different cell and/or tissue types or even sub-domains of a single cell wall3. Furthermore, their composition is also modified during development1, or in response to environmental cues4.
In excess of 2,000 genes have Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans been predicted to be involved in cell wall glycan biosynthesis and modification in Arabidopsis5. However, relatively few of the biosynthetic genes have been functionally characterized 4,5. Reverse genetics approaches are difficult because the genes are often differentially expressed, often at low levels, between cell types6. Also, mutant studies are often hindered by gene redundancy or compensatory mechanisms to ensure appropriate cell wall function is maintained7. Thus novel approaches are needed to rapidly characterise the diverse range of glycan structures and to facilitate functional genomics approaches to understanding cell wall biosynthesis and modification.
Monoclonal antibodies (mAbs)8,9 have emerged as an important tool for determining glycan structure and distribution in plants. These recognise distinct epitopes present within major classes of plant cell wall glycans, including pectins, xyloglucans, xylans, mannans, glucans and arabinogalactans. Recently their use has been extended to large-scale screening experiments to determine the relative abundance of glycans in a broad range of plant and tissue types simultaneously9,10,11.
Here we present a microarray-based glycan screening method called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) (Figures 1 &amp; 2)10,11 that enables multiple samples (100 sec) to be screened using a miniaturised microarray platform with reduced reagent and sample volumes. The spot signals on the microarray can be formally quantified to give semi-quantitative data about glycan epitope occurrence. This approach is well suited to tracking glycan changes in complex biological systems12 and providing a global overview of cell wall composition particularly when prior knowledge of this is unavailable.

A technique called Comprehensive Microarray Polymer Profiling (CoMPP) for the characterisation of plant cell wall glycans is described. This method combines the specificity of monoclonal antibodies directed to defined glycan-epitopes with a miniature microarray analytical platform allowing screening of glycan occurrence in a broad range of biological contexts.

Microarrays를 사용하여 식물 세포의 벽 폴리머의 Glycan 프로파일

Plant cell walls are complex matrixes of heterogeneous glycans which play an important role in the physiology and development of plants and provide the ...

Isolation and Compositional Analysis of Plant Cuticle Lipid Polyester Monomers

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester of glycerol and modified fatty acids that constitutes the framework of the cuticle that covers aerial plant surfaces. Suberin is a related lipid polyester that is deposited on the cell walls of certain tissues, including the root endodermis and the periderm of tubers, tree bark and roots. These lipid polymers are highly variable in composition among plant species, and often differ among tissues within a single species. Here, we describe a detailed protocol to study the monomer composition of cutin in Arabidopsis thaliana leaves by sodium methoxide (NaOMe)-catalyzed depolymerisation, derivatization, and subsequent gas chromatography-mass spectrometry (GC/MS) analysis. This method can be used to investigate the monomers of insoluble polyesters isolated from whole delipidated plant tissues bearing either cutin or suberin. The method can by applied not only to characterize the composition of lipid polymers in species not previously analyzed, but also as an analytical tool in forward and reverse genetic approaches to assess candidate gene function.

Lipid polyesters constitute the structural components of two cell wall modifications, the plant cuticle and suberin-containing diffusion barriers. In this video, we describe a method to depolymerize cutin from whole delipidated leaves. The method can be applied to investigating mutants compromised in either cutin or suberin biosynthesis.

식물 표피 지질 폴리 에스테르 단량체의 분리 및 성분 분석

Terrestrial plants produce extracellular aliphatic biopolyesters that modify cell walls of specific tissues. Epidermal cells synthesize cutin, a polyester ...

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix containing polysaccharides that include cellulose microfibrils that form both crystalline structures and cellulose chains of amorphous organization. The orientation of the cellulose fibers and their concentrations dictate the mechanical properties of the cell. Several methods are used to determine the levels of crystalline cellulose, each bringing both advantages and limitations. Some can distinguish the proportion of crystalline regions within the total cellulose. However, they are limited to whole-organ analyses that are deficient in spatiotemporal information. Others relying on live imaging, are limited by the use of imprecise dyes. Here, we report a sensitive polarized light-based system for specific quantification of relative light retardance, representing crystalline cellulose accumulation in cross sections of Arabidopsis thaliana roots. In this method, the cellular resolution and anatomical data are maintained, enabling direct comparisons between the different tissues composing the growing root. This approach opens a new analytical dimension, shedding light on the link between cell wall composition, cellular behavior and whole-organ growth.

High Resolution Quantification of Crystalline Cellulose Accumulation in Arabidopsis Roots to Monitor Tissue-specific Cell Wall Modifications

Crystalline cellulose is an important constituent of the plant cell wall. However, its quantification at a cellular resolution is technically challenging. Here, we report the use of polarized light technology and root cross sections to obtain information of cell wall composition at a spatiotemporal resolution.

에서 결정 셀룰로오스 축적의 높은 해상도 정량<em&gt; 애기 장대</em&gt; 뿌리 조직 특이 세포 벽 수정을 모니터링하는

Plant cells are surrounded by a cell wall, the composition of which determines their final size and shape. The cell wall is composed of a complex matrix ...

Microarray Polymer Profiling을 사용한 Glycan 구조 및 발생 규명

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

저자 스포트라이트: MAPP 프로토콜 – 글라이칸 분석의 발전 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

고처리량 글라이칸 분석을 위한 마이크로어레이 폴리머 프로파일링(MAPP)

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...