A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

当研究室では、まれな脳腫瘍であるびまん性低悪性度神経膠腫に着目しています。これらの神経膠腫はしばしば若年成人に影響を及ぼし、IDH-1と呼ばれる遺伝子の突然変異によって特徴付けられます。神経膠腫の分野における主な進歩は、第一に、腫瘍様やオルガノイドなどの3Dモデルの使用、第二に、神経膠腫を移植したマウスの脳に直接イメージングすること、第三に、特殊なトランスクリプトームおよび単一細胞RNAの使用です。

IDH-1変異型神経膠腫に取り組む際に直面する主な課題は、これらの細胞の増殖が少なく、培養で維持することが難しいことです。そのため、細胞を生かすためのプロトコルを導き出し、定義し、そのうちのいくつかについては、細胞株を導出することができました。 しかし、すべての患者に当てはまるわけではありません。IDH-1変異細胞をin vitroだけでなくin vivoでも研究することにより、これらの細胞は非常に可塑性があり、アストロサイト様または楕円形の2つの細胞の運命を受け入れることができることを発見しました。この新しい外植片プロトコルにより、IDH-1変異細胞をin vitroで数週間、さらには数ヶ月間維持することができ、患者で発見したように、さまざまな種類の腫瘍細胞が存在することを示しました。

また、ミクログリア細胞のように、腫瘍細胞とその環境との相互作用を研究することを可能にする腫瘍環境細胞が存在することもわかりました。したがって、これらのモデルは、腫瘍に見られる生物学的多様性をより正確に表現しています。まず、ワークスペースを準備し、滅菌されたすべてのツールを配置します。腫瘍切除を氷上に移し、培養のための組織の生存率を維持します。

腫瘍切除のサイズと不均一性を調べます。灰色で柔らかく、またはゼリー状の質感の部分を選択します。これらの領域は腫瘍細胞が豊富であるためです。選択した腫瘍サンプルを1.5ミリリットルのマイクロチューブまたはクライオバイアルに移し、1ミリリットルの培地を追加します。

滅菌ハサミを使用して、サンプルを1〜2立方ミリメートルの小片に切り刻みます。次に、滅菌ハサミで、直径約3〜4ミリメートルの広い開口部を作るために、1, 000マイクロリットルのピペットチップの端を切り取ります。100〜200マイクロリットルのミンチ組織片を、先端をカットしてプレートのウェルにピペットで入れます。

懸濁液を穏やかに再均質化して均一な分布を確保します。これは、小さな断片が急速に沈降する傾向があるためです。プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、湿度100%のインキュベーターに置きます。腫瘍の代謝活性が急速な黄変を引き起こす場合、またはフラグメント密度がそれを必要とする場合は、毎日培地を交換してください。

まず、ミンチ腫瘍組織懸濁液を入手します。凍結培地の調製には、8ミリリットルの細胞培養培地に2ミリリットルのDMSOを添加します。1容量のミンチ腫瘍懸濁液と等量の調製した20%DMSO凍結培地を組み合わせます。

混合物を慎重にピペットで上下させて、完全にブレンドします。クライオバイアルを極低温容器に迅速に移して徐々に温度を下げ、マイナス80°Cで一晩インキュベートしてから、液体窒素に移して長期保存します。解凍するには、液体窒素からクライオバイアルを取り出し、すぐに摂氏37度の水浴に入れます。

細胞の約80%が解凍するまで温めます。DMSOを除去するには、懸濁液を5ミリリットルの予熱した1X PBSが入った15ミリリットルの遠心分離チューブにすばやく移し、チューブを300Gで5分間遠心分離します。上清を取り除き、PBS洗浄を繰り返し、続いて遠心分離します。

上清を吸引し、ペレットが邪魔されないようにします。ペレットを適量の培地に再懸濁し、プレコートされたPDL Laminin 24ウェルプレートに移します。プレートを摂氏37度でインキュベートします。

細長い、双極性、または多極性の形態を示す細胞は、4週間の最小培養期間後にウェル表面に付着した腫瘍外植片から増殖することが観察されました。腫瘍由来細胞は、複雑なネットワークを形成する細長い双極性の外観によって示されるように、3つのケースにわたって新鮮腫瘍と凍結保存された腫瘍の間で同等の形態を示しました。腫瘍由来細胞の線維に沿った半径方向の移動が明確に観察されました。

失敗した外植片の培養では、非接着性の断片と多数のギッター細胞が示され、自家蛍光と脂質含量によって特徴付けられました。