A Protocol for Explant Cultures of IDH1-mutant Diffuse Low-grade Gliomas

במעבדה שלנו, אנו מתמקדים בסוג הנדיר של גידולי מוח הנקרא גליומות מפוזרות בדרגה נמוכה. גליומות אלו משפיעות לעתים קרובות על מבוגרים צעירים, והן מאופיינות במוטציה בגן הנקרא IDH-1. ההתקדמות העיקרית בתחום הגליומות היא, ראשית, השימוש במודלים תלת מימדיים, כמו גידול או אורגנואיד, שנית, שימוש בהדמיה ישירות במוחם של עכברים שהושתלו בגליומה, ושלישית, שימוש ב-RNA מיוחד של טרנסקריפטומי ותא בודד.

האתגר העיקרי העומד בפנינו כאשר אנו עובדים על גליומות מוטנטיות IDH-1 הוא השגשוג הנמוך של תאים אלה והקושי לשמר אותם בתרבית, וכך גזרנו והגדרנו פרוטוקול לשמירה על התאים בחיים, ועבור חלקם הצלחנו לגזור קו תאים, אבל לא לכל המטופלים. על ידי חקר תאים מוטנטיים IDH-1 במבחנה, אך גם in vivo, מצאנו שתאים אלה הם די פלסטיים, והם יכולים לאמץ גורל של שני תאים, או דמויי אסטרוציטים או דמויי אליפסה, ומצאנו גם שדחיפה ממלאת תפקיד מרכזי בפלסטיות זו. עם פרוטוקול אקספלנט חדש זה, הצלחנו לשמור על התאים המוטנטיים IDH-1 במבחנה במשך שבועות, אך אפילו יותר, במשך חודשים, והראינו שיש סוגים שונים של תאים גידוליים, כפי שמצאנו בחולה.

מצאנו גם שישנם כמה תאי סביבה גידולית, כמו תאי מיקרוגליה, שמאפשרים לחקור את האינטראקציה בין תאי הגידול לסביבתם, כך שהמודלים האלה מציעים ייצוג מדויק יותר של המגוון הביולוגי שנמצא בגידולים. כדי להתחיל, הכינו את סביבת העבודה וסדרו את כל הכלים המעוקרים. העבירו את כריתת הגידול לקרח כדי לשמר את כדאיות הרקמה לתרבית.

לבחון את כריתת הגידול לגודל והטרוגניות. בחר חלקים המציגים צבע אפור עם מרקם רך או דמוי ג'לי, מכיוון שאזורים אלה עשירים בתאי גידול. העבירו את דגימות הגידול שנבחרו למיקרו-צינור או קריוביאל של 1.5 מיליליטר והוסיפו מיליליטר אחד של מדיה.

בעזרת מספריים סטריליים קוצצים את הדגימות לחתיכות קטנות בגודל של מילימטר עד שניים מעוקב. לאחר מכן, בעזרת מספריים סטריליים, חתוך את קצה הפיפטה של 1,000 מיקרוליטר ליצירת פתח רחב בקוטר של כשלושה עד ארבעה מילימטרים. פיפטה 100 עד 200 מיקרוליטר משברי הרקמה הטחונה עם קצה חתוך לבארות של צלחת.

הומוגניזציה עדינה של המתלים כדי להבטיח פיזור אחיד, מכיוון שהשברים הקטנים יותר נוטים להתיישב במהירות. מניחים את הצלחת באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני ו-100% לחות. החלף את המדיה מדי יום אם הפעילות המטבולית של הגידול גורמת להצהבה מהירה או אם צפיפות השבר דורשת זאת.

כדי להתחיל, השג את תרחיף רקמת הגידול הטחון. להכנת מדיום ההקפאה, הוסף שני מיליליטר DMSO לשמונה מיליליטר של מדיום תרבית תאים. שלב נפח אחד של תרחיף הגידול הטחון עם נפח שווה של מדיום ההקפאה המוכן של 20% DMSO.

פיפטה בזהירות את התערובת למעלה ולמטה כדי להבטיח ערבוב יסודי. העבירו במהירות את הקריובילים למיכל קריוגני כדי להקל על הפחתת טמפרטורה הדרגתית, ולאחר מכן דגרו למשך הלילה במינוס 80 מעלות צלזיוס לפני העברתם לחנקן נוזלי לאחסון לטווח ארוך. להפשרה, הסר את הקריוביאלים מחנקן נוזלי והניח אותם מיד באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס.

מחממים אותם עד שכ- 80% מהתאים מופשרים. כדי להסיר את ה-DMSO, העבירו במהירות את המתלה לצינור צנטריפוגה של 15 מיליליטר המכיל חמישה מיליליטר PBS 1X מחומם מראש וצנטריפוגה את הצינור ב-300 גרם למשך חמש דקות. הסר את הסופרנטנט וחזור על שטיפת ה-PBS, ולאחר מכן צנטריפוגה.

שאפו את הסופרנטנט, וודאו שהכדור יישאר ללא הפרעה. השעו מחדש את הגלולה בכמות מתאימה של מדיום והעבירו אותה לצלחת PDL Laminin מצופה מראש עם 24 בארות. דגרו את הצלחת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס.

תאים המציגים מורפולוגיות מוארכות, דו קוטביות או רב-קוטביות נצפו צומחים מצמחי גידול המחוברים למשטח הבאר לאחר משך תרבית מינימלי של ארבעה שבועות. תאים שמקורם בגידול הראו מורפולוגיה דומה בין גידולים טריים ומשומרים בהקפאה על פני שלושה מקרים, כפי שמוצג על ידי מראה מוארך ודו קוטבי היוצר רשתות מורכבות. נדידה רדיאלית של התא שמקורו בגידול לאורך הסיב נצפתה בבירור.

תרביות אקספלנט לא מוצלחות הראו שברים לא נדבקים ותאי גיטר רבים, המאופיינים באוטופלואורסצנטיות ותכולת שומנים.