私たちの知る限り、このプロトコルは胎児の骨格筋から脱細胞化マトリックスを生成する最初のプロトコルであり、子宮内で発症し始めるミオパチーを研究するための新しいアプローチを提供します。このプロトコルは、制御された環境で筋細胞の挙動および細胞外マトリックスとの相互作用を研究するために使用できる発生および組織固有のメトリックを生成します。LAMA2-CMDは、出生時に現れ始める先天性筋ジストロフィーです。
このモデルは、その発症に関与するパターンメカニズムを解明し、新しい標的療法につながるのに役立ちます。このプロトコルは、さまざまな組織や疾患モデルに適合させることができます。マトリックスとセルの種類に応じて異なる複雑さのレベルを達成でき、システムの多様性を実証します。
これは非常に簡単なプロトコルです。最も困難な部分は、サンプルの収集と取り扱いです。しかし、練習すれば、技術的なスキルを簡単に向上させることができます。
安楽死させた胎児を一度に1つずつ、氷のように冷たいPBSを含むペトリ皿に移すことから始めます。皮膚と手足を切除した後、胸郭の腹側を切ります。胸骨とその下にある臓器を取り除きます。
胎児の背側を上にして配置し、脊柱の頸部を取り除きます。次に、背側脂肪沈着物と深部背筋結合組織を切除します。次に、外科用鉗子を使用して胸郭を固定します。
マイクロメスで慎重にこすり、周囲の組織から背中の深い筋肉を切り離します。将来の使用のために、組織を摂氏4度の12ウェル細胞培養プレートのPBSに保管します。長期間、マイナス80°Cの空のマイクロ遠心チューブに組織を保管します。
初日に、上軸筋量全体を使用します。1%ペニシリンとストレプトマイシンを含む3ミリリットルの低張バッファーを12ウェルプレートの各ウェルに加えます。筋肉組織片を各ウェルに加え、攪拌しながら18時間一晩インキュベートします。
2日目に、細い先端ピペットでバッファーを取り除きます。次に、サンプルを3ミリリットルのPBSで3回洗浄し、毎回1時間攪拌します。PBSを廃棄した後、サンプルを3ミリリットルの0.05%SDS洗剤溶液中で24時間攪拌しながらインキュベートします。
3日目に、細かいチップピペットを使用してSDS洗剤を除去し、毎回20分間攪拌しながら、3ミリリットルの低張洗浄バッファーで断片を3回洗浄します。ウェルの溶液を2ミリリットルのDNase溶液に交換し、組織片を摂氏37度で3時間攪拌しながらインキュベートします。DNase溶液を除去した後、毎回20分間攪拌しながら3ミリリットルのPBSで断片を3回洗浄し、最後の洗浄を一晩放置します。
サブコンフルエントC2C12細胞を播種したT-25フラスコに、500マイクロリットルのトリプシンを加え、1ミリリットルの完全培地に再懸濁します。10マイクロリットルの懸濁液を10マイクロリットルのトリパンブルー色素と混合し、血球計算盤にロードして細胞数をカウントし、生存率を推定します。層流フード内で、1%ペニシリンとストレプトマイシンを含むPBSを含むペトリ皿に脱細胞化マトリックス(dECM)を入れます。
マイクロメスとピンセットを使用して、マトリックスを細かく分けます。断片を96ウェルプレートのウェルに移し、ウェルごとに3〜4個入れます。200マイクロリットルの予熱した完全培養培地を各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で2時間インキュベートします。
ウェルプレート内の培地を廃棄し、50, 000個の生存可能なC2C12細胞を含む200マイクロリットルの完全培養培地を各ウェルに加えます。ウェルプレートを2日間インキュベートします。細胞を含むdECMを、400マイクロリットルの完全培養培地を含む48ウェルプレートに移します。
マトリックスの剥離を防ぐために2日ごとに培地を注意深く吸引し、8日目まで新鮮な培地を補充します。分化のために、完全培養培地を分化培地に交換し、12日目まで4日間インキュベートします。筋肉組織は単離直後に赤みを帯び、低張緩衝液中でインキュベートした後の細胞溶解により白色に変色した。
SDSは筋肉を透明にします。DNase処理後、より小さく透明なdECMが得られた。DNA定量により、天然組織と比較してdECMがほぼ100%減少していることが明らかになりました。
dECMおよび天然組織は、ラミニンアルファ2およびラミニンタンパク質について同様の尿細管染色を示した。天然組織のウェスタンブロット分析では、ラミニンアルファ2サブユニットについて2つのバンドが示されましたが、dECMでは3つの小さなバンドが検出されました。総ラミニンについて、dECMサンプルは、天然組織と比較した場合にタンパク質断片化を示した。
フィブロネクチンおよびコラーゲンは天然組織とdECMsの細胞間質腔に存在した。同様のフィブロネクチンバンドが両方のサンプルに存在し、脱細胞化の影響を受けないことを示しています。dECMではコラーゲンIバンドが観察されませんでした。
IV型コラーゲンについては、両サンプルとも同様の管状染色を示した。しかしながら、dECMバンドの分子量は低かった。C2C12細胞はdECMにコロニーを形成して増殖し、多核筋管に融合しました。
これらは分化培地中で4日間インキュベートした後にミオシン重鎖タンパク質を発現させた。細胞内および細胞周囲染色は、ラミニンα二鎖、総ラミニン、およびフィブロネクチンについて観察された。脱細胞化マウス骨格足場は、共培養系で細胞を増殖させることで、in vivo環境に近づけることができるため、筋疾患の理解に貢献します。
