現在、肝臓のマラリア原虫感染の生物学の理解は限られています。このプロトコルは、生物の生物学に関するいくつかの重要な質問に答えるのに役立った多くのトランスジェニック系統を生成するのに役立ちました。マラリアの感染と闘うための新しいツールとアプローチを開発するには、寄生虫とその生物学の基本的な理解が必要です。
ここで説明しているトランスジェネシスの方法は、生物と宿主のいくつかの重要で複雑な生物学を解読するのに役立ちました。この手順を実演するのは、私の研究室長であるカーソン・バウワーズです。P.Bergeheiに感染したマウスを作製し、安楽死させた後、無菌環境で2匹の感染マウスから2ミリリットルの血液を採取し、5ミリリットルのエルゼビア溶液に入れます。
血液を450gで室温で8分間遠心分離します。上清を廃棄し、細胞ペレットを10ミリリットルの完全RPMI培地に再懸濁します。細胞懸濁液を再度遠心分離し、ペレットを25ミリリットルの完全RPMI培地に再懸濁します。
細胞懸濁液をフィルターキャップ付きのT75培養フラスコに移し、穏やかに振とうしてインキュベートし、細胞を懸濁液状態に保ちます。インキュベーションの最後に、500マイクロリットルのサンプルを回収します。ペレットを遠心分離し、10マイクロリットルの完全なRPMI培地に再懸濁します。
次に、薄い血液塗抹標本を準備します。血液塗抹標本をギムザ染色で染色し、統合失調症の頻度を決定します。最適なトランスフェクション効率を得るには、寄生虫の60〜70%がシゾント段階にある必要があります。
50 mmリットルの遠心チューブに13 mLの密度勾配ストック培地を再溶解して、グラジエント遠心分離バッファーを調製します。25ミリリットルの血液培養液を新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに移します。次に、20 mmリットルのグラジエント遠心分離バッファーを遠心分離チューブの底に慎重に層状にし、細いガラスピペットを使用してグラジエントカラムを作成し、バッファーと培地を明確に分離します。
調製したバッファーと培地を、室温で中断することなく、450 Gで20分間遠心分離します。牧草地のピペットを使用して、培地とグラジエント遠心分離バッファーの界面にあるシゾント層を慎重に除去します。新しい50ミリリットルの遠心分離チューブに入れます。
単離したシゾントを完全なRPMI培地に再懸濁し、総容量を40ミリリットルに増やします。遠心分離して上清を廃棄した後、10ミリリットルの完全RPMI培地にシゾントを再懸濁します。次に、トランスフェクションごとにこの溶液1ミリリットルを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、16、000Gで5秒間遠心分離して感染細胞をペレット化します。
次に、室温で100マイクロリットルのエレクトロポレーションバッファーと5マイクログラムのターゲットプラスミドDNAを1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに入れて混ぜ合わせます。感染細胞を遠心分離した後、上清を除去し、調製したヌクレオエフェクト溶液とプラスミドDNAに細胞を慎重に再懸濁します。次に、懸濁液をエレクトロポレーション、キュベットに移し、適切なヌクレオフェクタープログラムを使用してトランスフェクトします。
次に、100マイクロリットルの完全なRPMI培地をキュベットに加えます。溶液全体を1.5ミリリットルのマイクロ遠心チューブに移し、氷上に置きます。接種後2日から毎日、トランスフェクションされたシゾントを接種したマウスの寄生虫血症レベルを確認します。
感染が確認されたら、薬を経口投与し、水を自由に飲むことで薬の選択を開始します。ピロメチミン治療開始から6日後から始まる血液塗抹標本を使用して寄生虫血症を監視します。.寄生虫が1%以上に達したら、その寄生虫をナイーブなB6マウスに移し、血液期の寄生虫ストックを作ります。
寄生虫が2%から5%に達すると、ストックを生成して凍結保存します。蚊に感染する前日には、雌雄の蚊が入ったケージの上に、37°Cに温めた水を入れた手袋を置いて、雌の蚊を分離します。昆虫吸引器を使用して、熱源に引き寄せられた雌の蚊を取り除き、感染のために小さなケージに移します。
蚊の摂食と感染の日に、感染したB6マウスの寄生虫血症を決定します。2%から5%の寄生虫血症は蚊の感染に最適です。寄生虫を確認した後、胸骨横臥位下でケージに入れた雌の蚊に麻酔マウスを置き、雌の蚊に感染を移します。
前脚と後脚を手動で広げて、蚊の餌付けに最大の表面積を提供します。感染したマウスを各ケージに15分間放置し、5分ごとにマウスが目を覚ましていないことを確認します。給餌が完了し、マウスが安楽死したら、施設のガイドラインに従って安全に処分します。
蚊への感染が成功したことを確認するには、感染後10日後に鉗子で腹末端部分を切除し、蚊の中腸を分離します。次に、偏光の下で中腸を観察して、オーシストの存在を検出します。感染後18日目に、5〜10匹の蚊を解剖して、存在するスポロゾイトの数を評価します。
胞子嚢を分離して数えるには、鉗子または細かい解剖針で胸部に圧力をかけながら、蚊の頭を慎重に取り除きます。唾液腺は、切除された頭部に付着したままになります。次に、唾液腺から追加の蚊の破片を取り除き、400マイクロリットルの蚊解剖培地を含むマイクロ遠心チューブに入れます。
次に、分離された唾液腺を30ゲージの針シリンジに15〜20回通して破壊し、その後、破壊された唾液腺の10マイクロリットルを蚊の解剖培地に血球計算盤に入れてカウントします。最後に、マウスへの注射または長期凍結保存のために、唾液腺を所望の濃度の蚊解剖培地またはPBSに再懸濁します。顕微鏡のように、寄生マウスの血液培養における成熟したP.berghei schizontと未成熟なP.berghei schizontを描写した画像が提示されます。
解剖中に唾液腺が無傷のままの蚊の頭の顕微鏡画像のように、解剖された唾液腺を低倍率と高倍率で表示します。PB、GFP 11に感染したHEPA GFP 1〜10個の宿主細胞における緑色蛍光シグナルの生成は、寄生胞胞の溶解を示した。グラジエント界面を乱すことなく、チェイソン層を慎重に除去することが重要です。
また、胞子の光の分離中に頭部と一緒に唾液腺を確実に除去するには、少し練習が必要です。単離後、トランスジェニックスポロゾイトは凍結保存するか、in vivoまたはin vitro感染研究に新鮮に使用することができます。
