この方法は、ATP産生速度のような細胞エネルギーを決定するのに役立ち、また、特定の代謝産物に対する細胞の嗜好をリアルタイムで決定するのに有用である。まず、200マイクロリットルのXFキャリブラントを添加し、アッセイの前にユーティリティプレートを少なくとも1時間インキュベートします。補充されたXF DMEMを用いて80ミリリットルのXFアッセイ培地を調製する。
氷上でオリゴマイシンA、ロテノン、およびアンチマイシンAを解凍する。使用前に化合物を上下にピペットで溶かします。26.4マイクロリットルの2.5ミリモルオリゴマイシンAをチューブAに、3.1マイクロリットルの12.67ミリモルロテノンに、4.1マイクロリットルの9.4ミリモルアンチマイシンAに、30マイクロリットルのフックの染色をチューブBに3ミリリットル加え、チューブBに30マイクロリットルのフック染色剤を充填する。
そして最後に、20マイクロリットルのこれらの化合物を、200マイクロリットルのアッセイ培地中の細胞に装填する。細胞培養用マイクロプレートを摂氏37度の培養器から取り出し、顕微鏡下で細胞を観察した。アッセイ培地を水浴から除去する。
予め加温したアッセイ培地200マイクロリットルで細胞を2回穏やかに洗浄し、ウェル当たり200マイクロリットルのアッセイ培地を加える。顕微鏡下で細胞をチェックして、細胞がウェルに接着したままであることを確認します。D5およびE8ウェル内の細胞が一貫した単分子膜で接着され、洗浄ステップ中に洗い流されなかったことを確認する。
細胞イメージングソフトウェアは、オートフォーカスと自動露出を設定するためにこれら2つのウェルを使用します。機器の横にあるコンピューターでデスクトップソフトウェアを開きます。コントローラソフトウェアの左下隅にある接続ステータスを確認します。
テンプレートに移動し、XF ATP 率アッセイテンプレートまたは適切なアッセイテンプレートを選択します。画面上部の [グループ定義] を選択し、グループを定義します。プレートマップレイアウトを選択し、定義されたグループに応じてウェルを割り当てます。
計測器プロトコルを確認します。追加したコンパウンドが正しくリストされていることを確認し、今後の参照用にプロジェクト情報を含めます。「アッセイの実行」をクリックします。
これにより、結果ファイルの保存場所の選択が促されます。結果ファイルを保存する場所を選択します。アッセイ日を含むファイルを保存し、[実行の開始]をクリックします。
センサーカートリッジとユーティリティプレートをトレイに置き、[準備完了]をクリックしてキャリブレーションを開始します。コンピュータ上の細胞イメージングソフトウェアを開きます。マイクロプレートイメージャの電源が入っていて、ポートがコンピュータに接続されていることを確認します。
画面の左下にあるステータスバーをチェックして、温度が摂氏37度に設定されていること、および接続ステータスが準備完了として緑色で強調表示されていることを確認します。プレートのバーコードをスキャンして、イメージングプロセスを開始します。セルプレートに名前を入力し、[保存]をクリックします。
明視野と蛍光画像がここに保存されます。[明視野スキャンの実行]をクリックすると、次の画面の[プレートとスキャン]メニューにイメージングのオプションが表示されます。アッセイの前に、[明視野スキャンの開始] を選択します。
細胞培養マイクロプレートとプレートカバーをトレイホルダーの上に置き、A1ウェルをA1マークに合わせます。[トレイを閉じる]をクリックします。明視野画像取得は、プレートマップとともに次の画面に表示されます。
[すべての井戸をスキャン]をクリックし、30〜35分間スキャンします。キャリブレーションが完了すると、ソフトウェアはロードセルプレートダイアログボックスを表示します。次に、[トレイを開く]をクリックして、ユーティリティトレイを細胞培養マイクロプレートに置き換えます。
なお、細胞培養プレートはマイクロプレートイメージャにある。スキャン後、細胞培養マイクロプレートを取り出し、分析装置に入れてアッセイを行う。次に、ロードセルプレートをクリックしてアッセイを開始します。
アッセイが開始されるまで待ち、推定完了時間を表示します。アッセイが完了すると、ソフトウェアは「センサーカートリッジのアンロード」ダイアログボックスと「セルプレート」を表示します。「取り出し」をクリックし、細胞培養マイクロプレートを分析装置から取り外します。
センサーカートリッジを慎重に取り外し、セルプレートの蓋を取り付けます。アッセイ完了ダイアログボックスが表示されます。次に、[結果の表示]をクリックしてアッセイ結果ファイルを開くか、データを正規化します。
アッセイ終了後、ハンドヘルドバーコードリーダーでプレートバーコードをスキャンします。プレートが既にイメージ化されている場合は、新しい名前は必要ありません。蛍光と細胞数を選択します。
セルプレートをトレイホルダーに置き、「トレイを閉じる」をクリックします。画像取得ウィンドウで、[すべてのウェルをスキャン]を選択してイメージングを開始します。イメージングおよび細胞イメージングアプリケーションで蛍光画像と細胞数を確認するには、いくつかのウェルをランダムにクリックします。
蛍光イメージングが完了したら、追加の参照用に画像をエクスポートします。イメージングと細胞数が完了したら、結果ファイルを開き、[正規化]をクリックします。インポートをクリックし、デスクトップソフトウェアの適用を選択して、アッセイを細胞数で自動的に正規化します。
オリゴマイシンAおよびFCCPストレッサー混合注射は、対照群のベースライン活性を増加させた。ストレッサーは、対照および処置1群において有意に高いエネルギーレベルを示した。一方、治療2はベースライン活性が比較的低く、細胞はより好気的になった。
この図は、対照細胞および実験細胞の両方が、ATP生成のために解糖系およびミトコンドリア酸化的リン酸化を使用することを示している。実験グループは、解糖系を介したATP生成の減少とミトコンドリア呼吸の増加を示した。治療群の基礎呼吸数は対照群よりも比較的少ない。
両群の呼吸およびATP産生速度は、プロトンリークに続いてオリゴマイシンA注射とともに減少する。細胞の呼吸数は、FCCPの注射後に再び最大呼吸に戻る。ロテノンおよびアンチマイシンAの最終注射は、OCRを再び減少させる。
3回目の注射後、ミトコンドリア呼吸はロテノンとアンチマイシンAの組み合わせによってシャットダウンされます.対照群と比較して、治療群の基礎呼吸および最大呼吸は比較的変化がありません。図は、対照群がグルコース経路に大きく依存しているのに対し、対照群ではグルタミン酸化が効率的であったことを示している。脂肪酸経路は、治療が細胞の全体的な容量を増加させたことを示す。
酸性プレート上の複数の注入口の利用可能性は、単一の時点で細胞エネルギーに対する複数の薬物の効果を決定するのに役立ちます。
