このプロトコルは、ミトコンドリアタンパク質機能解明の基本的なステップと考えられている酵母ミトコンドリアタンパク質のサブシリンダライゼーションを決定するように設計されています。プロトコルは異なった成長条件で維持される私達の酵母株のために適している。ミトコンドリア研究として研究のための強力なツールを表します。
まず、グリセロールストックから80Cに貯蔵されたストリーク細胞は、YPD寒天プレート上に、目的の株から単一コロニーを単一のコロニーを単離する。30°Cでプレートを2〜3日間インキュベートする。10〜30mlのYPGal培地を含む100mlのエルレンマイヤーフラスコにYPD寒天プレートから2〜3個のコロニーを接種してスターター培養を調製する。
フラスコを30°Cで24時間インキュベートし、180~200rpmで激しく揺れます。スターター培養液を新鮮なYPGal培地の1 Lに希釈し、600 nmで0.1未満の光学密度にします。光密度が1〜1.5に達するまで、180〜200rpmで180〜200rpmで激しく揺れ、30°Cで細胞を培養します。
テキストに記載されているように、高度に精製されたミトコンドリアの分離を行う。そして、高精製ミトコンドリア製剤のタンパク質濃度を決定し、ブラッドフォードアッセイを使用して、製造業者の指示に従う。氷冷SEMバッファーでタンパク質濃度を10 mg/mlに調整します。
高度に精製されたミトコンドリア40 lを4つの1.5 mlの予冷および標識されたマイクロ遠心分離管に移す。第1および第2の管にSEMバッファーの360 lを加える。そして3及び第4の管におけるEM緩衝液の360 lと。
ピペット化スキームを用いて、テキストに従って、第2および第4のチューブに4Lの新しく調製したプロテイナーゼKを加える。すべてのチューブを穏やかに混合した後、時折混合して30分間氷の上でインキュベートします。プロテナーゼK活性を停止するには、4つのチューブすべてに4Lの200 mM PMSFを加える。
4 C.で30分間チューブを20,000 x g遠心分離し、ペレットを邪魔することなく上清を新しい1.5mlの事前冷蔵ラベル付きマイクロ遠心チューブに集めます。次に、ペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁する。プロテイナーゼKの可能な痕跡を不活性化するには、収集した上清を沈殿させ、トリクロロ酢酸でペレットを10%氷上のチューブを10分間インキュベートする最終濃度に再懸濁します。
トリクロロ酢酸処理サンプルを4Cで12,000 x gで10分間遠心分離し、上清を除去した後、ペレットを200lのサンプルバッファーに再懸濁させる。ブロモフェノールブルーが黄色に変わったら、1 Mトリスベースの1〜5 lを加え、青色になるまで追加します。すべてのチューブに200 mM PMSFの4 lを追加します。
SDS-PAGEとウェスタンブロットによるさらなる分析まで、サンプルを80°Cで保管してください。高度に精製されたミトコンドリアの200 lを1.5mlの予冷したマイクロ遠心分離管に移す。ミトコンドリアを氷冷SEMバッファーで1倍希釈します。
少量と互換性のあるソニケーターを使用して、氷の上で30秒間ミトコンドリアを3回超音波処理します。サンプルを4°Cで30分間遠心し、新しい1.5mlのプレチルドマイクロ遠心分離チューブに上清を集めます。可溶性タンパク質画分のS"としてチューブを標識した後、氷の上にチューブを保持します。
前のステップからペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁します。再懸濁されたペレットの100 lを新しい1.5mlの予冷したマイクロ遠心分離管に移す。サブセクション粒子の分画の場合は、チューブに「SMP」というラベルを付け、チューブを氷の上に置きます。
残りの300lの再懸濁ペレットを、作りたての200mM炭酸ナトリウムで1倍に希釈します。希釈したサンプルを氷の上で30分間インキュベートします。次いで、サンプルを4 Cで100,000 x gで30分間遠心分離し、上清を新しい1.5mlのプレチルされたマイクロ遠心分離管に集める。
炭酸塩上清分の分率の場合はサンプルを「CS」とラベル付けし、チューブを氷の上に置きます。前のステップからペレットを氷冷SEMバッファーの400 lに再懸濁します。そして、炭酸塩析出画分のCP"としてサンプルに名前を付けます。
すべてのサンプルをトリクロロ酢酸で沈殿し、最終濃度の10%にし、氷上のチューブを10分間インキュベートします。次いで、4Cで12,000xgで10分間サンプルを遠心分離し、上清を除去した後、サンプルバッファー内の各ペレットを再懸濁する。サンプルバッファーが黄色になった場合は、1 M トリス ベースの 1 ~ 5 l を青色になるまで追加します。
200 mM PMSF の 1 l をすべてのチューブに加え、SDS-PAGE とウェスタンブロットによる分析が行なくなるまで 80°C で保管します。粗ミトコンドリア画分をスクロース密度勾配遠心分離で精製し、他の細胞汚染物質の減少が観察された。ミトコンドリアからミトプラストへの変換は、ペレット中の膜間空間タンパク質シトクロムb2の消失によって監視された。
上清に併せる外観で。膜間タンパク質Sco1のタンパク質K媒介分解は、浸透衝撃による外膜破壊のために観察された。外側ミトコンドリア膜の完全性は、ペレット画分におけるプロテナーゼK分解に対するシトクロムb2およびSco1の保護によって確認された。
同様に、マトリックス可溶性タンパク質KGDの保護は、内ミトコンドリア膜完全性を確認した。Prx1ウェスタンブロットプロファイルは、膜間空間およびマトリックスにおける二重ミトコンドリア局在化を示唆した。ミトコンドリアは、超音波処理と炭酸塩抽出を行い、膜タンパク質のトポロジーを調査した。
含分膜タンパク質はペレット画分に残った。上清画分でKGDが検出された。ペレット中のKGDタンパク質の検出は、SMPの形成に影響を与える超音波処理パラメータの変動によるものである。
炭酸ナトリウム処理後、KGDおよびSMP画分を可溶化し、上清画分中に見つかった。Prx1ウェスタンブロットプロファイルは、膜周辺との関連を示唆した。サブセクオンドリア分画プロトコルの成功のためには、PMSFをサンプルに添加することによって低血圧腫脹後のプロテアーゼK活性を停止することが重要である。
サイトは、サブソキアドリアルタンパク質の局在に関する情報を提供します。このプロトコルは、ミトコンドリアサブコンパートメントのプロテオーム研究中に基本的であるミトコンドリア製剤の完全性をチェックするためにも使用できます。
