Questo protocollo è progettato per determinare la localizzazione sottocondriale delle proteine mitocondriali del lievito, che è considerata un passo fondamentale durante la delucidazione della funzione proteica mitocondriale. Il protocollo è adatto per i nostri ceppi di lievito mantenuti in diverse condizioni di crescita. Rappresentare un potente strumento per la ricerca come lo studio dei mitocondri.
Per cominciare, le cellule di striscia dal brodo di glicerolo immagazzinato a 80 C, su una piastra di agar YPD per isolare singole colonie dal ceppo di interesse. E incubare la piastra a 30 C per 2 o 3 giorni. Preparare una coltura iniziale inoculando da 2 a 3 colonie individuali dalla piastra di agar YPD in un matraccio Erlenmeyer da 100 ml contenente da 10 a 30 ml di mezzo YPGal.
Incubare il matraccio a 30 C per 24 ore con agitazione vigorosa a 180-200 giri/min. Diluire la coltura iniziale in 1 L di mezzo YPGal fresco a una densità ottica inferiore a 0,1 a 600 nm. Coltivare le cellule a 30 C con agitazione vigorosa a 180-200 giri/min per circa 12 ore, fino a raggiungere la densità ottica da 1 a 1,5.
Eseguire l'isolamento di mitocondri altamente purificati come descritto nel testo. E determinare la concentrazione proteica del preparato mitocondriale altamente purificato, utilizzando il test Bradford, seguendo le istruzioni del produttore. Regolare la concentrazione proteica a 10 mg/ml con tampone SEM ghiacciato.
Trasferire 40 l di mitocondri altamente purificati in quattro tubi di microcentrifuga pre-refrigerati ed etichettati da 1,5 ml. Aggiungere 360 l di buffer SEM nel primo e nel secondo tubo. E 360 l di buffer EM nel terzo e quarto tubo.
Utilizzando lo schema di pipettaggio, come da testo, aggiungere 4 L di proteinasi K appena preparata nel secondo e quarto tubo. Dopo aver mescolato delicatamente tutti i tubi, incubare su ghiaccio per 30 minuti con miscelazione occasionale. Per fermare l'attività della proteinasi K aggiungere 4 L di 200 mM PMSF a tutti e quattro i tubi.
Centrifugare i tubi a 20.000 x g per 30 minuti a 4 C.E raccogliere il surnatante, senza disturbare il pellet, in un nuovo tubo microcentrifuga etichettato pre-refrigerato da 1,5 ml. Quindi, risospesciare il pellet in 400 l di tampone SEM ghiacciato. Per inattivare le possibili tracce di proteinasi K, precipitare il surnatante raccolto e risospesere il pellet con acido tricloroacetico ad una concentrazione finale del 10%Incubare i tubi su ghiaccio per 10 minuti.
Centrifugare i campioni trattati con acido tricloroacetico per 10 minuti a 12.000 x g a 4 C.E dopo aver rimosso il surnatante, risospesere il pellet in 200 l di tampone campione. Se il blu bromofenolo diventa giallo, aggiungere da 1 a 5 l di base Tris 1 M, fino a quando non diventa blu. Aggiungere 4 l di PMSF da 200 mM a tutti i tubi.
Conservare i campioni a 80 C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot. Trasferire 200 l di mitocondri altamente purificati in un tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml. Mitocondri diluiti di una volta con tampone SEM ghiacciato.
Utilizzando un sonicatore compatibile con piccoli volumi, sonicare i mitocondri 3 volte per 30 secondi sul ghiaccio. Centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 C.E raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml. Dopo aver etichettato il tubo come S"per la frazione proteica solubile, tenere il tubo sul ghiaccio.
Risospesciare il pellet della fase precedente in 400 l di tampone SEM ghiacciato. Trasferire 100 l del pellet risospeso in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml. Etichettare il tubo come SMP" per la frazione di particelle submitocondriali e mantenere il tubo sul ghiaccio.
Diluire i restanti 300 l di pellet risospeso una volta con carbonato di sodio da 200 mM appena preparato. E incubare il campione diluito sul ghiaccio per 30 minuti. Quindi, centrifugare il campione per 30 minuti a 100.000 x g a 4 C.Raccogliere il surnatante in un nuovo tubo microcentrifuga pre-refrigerato da 1,5 ml.
Etichettare il campione come CS" per la frazione surnatante carbonatica e mantenere il tubo sul ghiaccio. Risospesciare il pellet della fase precedente in 400 l di tampone SEM ghiacciato. E nominare il campione come CP"per la frazione precipitata carbonatica.
Precipitare tutti i campioni con acido tricloroacetico ad una concentrazione finale del 10% e incubare le provette sul ghiaccio per 10 minuti. Quindi, centrifugare i campioni per 10 minuti a 12.000 x g a 4 C.Dopo aver rimosso il surnatante, risospesare ogni pellet nel tampone del campione. Se il buffer del campione diventa giallo, aggiungere da 1 a 5 l di base Tris da 1 M fino a quando non diventa blu.
Aggiungere 1 l di PMSF da 200 mM a tutti i tubi e conservare a 80 C fino a ulteriori analisi da parte di SDS-PAGE e western blot. La frazione mitocondriale grezza è stata purificata mediante centrifugazione con gradiente di densità di saccarosio ed è stata osservata una riduzione di altri contaminanti cellulari. La conversione da mitocondri a mitoplasto è stata monitorata dalla scomparsa della proteina spaziale intermembrana citocromo b2 nel pellet.
Con la comparsa concomitante nel surnatante. La degradazione mediata dalla proteinasi K della proteina intermembrana Sco1 è stata osservata a causa della rottura della membrana esterna da shock osmotico. L'integrità della membrana mitocondriale esterna è stata confermata dalla protezione del citocromo b2 e sco1 contro la degradazione della proteinasi K nella frazione del pellet.
Allo stesso modo, la protezione della proteina solubile della matrice KGD ha confermato l'integrità della membrana mitocondriale interna. Il profilo Western blot di Prx1 ha suggerito una doppia localizzazione mitocondriale nello spazio intermembrana e nella matrice. I mitocondri sono stati sottoposti a sonicazione ed estrazione di carbonato per studiare la topologia delle proteine di membrana.
Il versamento della proteina di membrana integrale è rimasto nelle frazioni del pellet. Il KGD è stato rilevato nella frazione surnatante. Il rilevamento della proteina KGD nel pellet era dovuto alle variazioni dei parametri di sonicazione che influenzavano la formazione di SMP.
Dopo il trattamento con carbonato di sodio, la frazione KGD e SMP è stata solubilizzata e trovata nella frazione surnatante. Il profilo western blot di Prx1 suggeriva un'associazione con la periferia della membrana. Per il successo del protocollo di frazionamento sottocondria, è importante interrompere l'attività della proteinasi K dopo gonfiore ipotonico aggiungendo PMSF ai campioni.
I siti forniscono informazioni sulla localizzazione della proteina submitocondriale. Questo protocollo può anche essere utilizzato per verificare l'integrità dei preparati mitocondriali, che è fondamentale durante gli studi proteomici dei sottocompartimenti mitocondriali.
