この方法論は、ニワトリの網膜発達の研究のための機能喪失アプローチを提供します。この技術は、網膜の特定の領域における標的遺伝子の迅速かつ持続的な抑制をサポートします。このアプローチは、神経組織と非神経組織の両方を含む、ニワトリ胚の他の部分にも適用できます。
インオボエレクトロポレーションでは、25ミリグラムのファストグリーンFCFを10ミリリットルのPBSに溶解して0.25%ファストグリーン溶液を調製し、0.2ミクロンのシリンジフィルターを使用して溶液をろ過します。次に、マイクロRNAエメラルドGFPプラスミドとTol2トランスポザーゼ発現プラスミドとを2対1の比率で混合してDNAカクテル注入液を調製する。次に、注入された領域を視覚化するために、調製したファストグリーン溶液を1対10の比率でDNAカクテルに加えます。
次に、マイクロインジェクション装置を設置した。この装置は、ハミルトンシリンジ、18ゲージの2インチ針、長さ2センチメートルのポリ塩化ビニルチューブ、およびマイクロピペット針で構成されています。ハミルトンシリンジに重鉱物油を充填し、次に18ゲージの針をシリンジに取り付け、シリンジプランジャーを押し下げて針の内部空間をオイルで満たします。
次に、ポリ塩化ビニルチューブを針の端に取り付け、チューブにオイルを充填します。引っ張ったマイクロピペット針をチューブに取り付けます。次に、細かい鉗子を使用して解剖顕微鏡の下で、針の先端を直径10〜20マイクロメートルに折って小さな開口部を作ります。
針全体をオイルで満たします。次に、5マイクロリットルの着色されたDNAカクテルをペトリ皿に入れます。解剖顕微鏡下で、マイクロピペット針の先端をペトリ皿のDNA溶液に入れ、溶液をゆっくりと針に引き込みます。
針の内側と外側の圧力が平衡になったら、針の先端をDNA溶液から取り出し、注射するまで小さなビーカー内の滅菌PBSに沈めたままにします。次にエレクトロポレーション装置を設置し、マイクロマニピュレーター上に電極ホルダーで一対の白金電極を強固にセットする。電極の先端の間隔を2ミリメートルに調整し、電極をケーブルで矩形波パルス発生器に接続します。
次に、DNAマイクロインジェクションのために、インキュベーターから受精したホワイトレグホン卵を取り出し、70%エタノールに浸したティッシュペーパーで卵の表面を拭きます。次に、18ゲージの針を10ミリリットルの注射器に取り付け、卵黄を傷つけないように下向きに傾けた卵の鈍い端に針を挿入します。卵から2〜3ミリリットルのアルブミンを引き出した後、スコッチテープで穴を塞ぎ、卵を光でろうそくにして、胚と硝子膜が殻から外れていることを確認します。
次に、鉗子を使用して、卵の上から卵殻を取り除き、胚を露出させます。エレクトロポレーション中の胚の乾燥を防ぐために、一度に5個を超える卵を窓に入れないでください。針の先端を近位側から視小胞に45度の角度で挿入し、青色の溶液が内腔を満たすまでプランジャーをゆっくりと押し下げてDNAカクテルを注入します。
針を引き出し、その先端をPBSに戻します。エレクトロポレーションの場合は、パルス電圧を15ボルト、パルス長を15ミリ秒、パルス間隔を915ミリ秒、パルス数を5に設定します。胚の上の硝子膜に数滴のHBSSを加えた後、マイクロマニピュレーターを使用して電極を胚の前後軸に垂直なHBSSに下げます。
視静脈胞の両側に電極を置き、電極が胚や血管に触れないようにしてから、パルス電界を印加します。エレクトロポレーションが完了したら、電極を取り外し、アルブミンの蓄積を防ぐために、水に浸した滅菌綿棒で電極をそっと洗浄します。スコッチテープで窓を密封し、目的の発達段階まで胚を再インキュベートします。
個々のプレマイクロRNA配列をNel AP発現細胞にトランスフェクションするとHEK293Tヌクレオチド482〜502、910〜930、および2461〜2481に対するコンストラクトによるNel発現の有意な抑制がもたらされました。2つのマイクロRNA配列を連鎖させることで、ノックダウン効率が大幅に向上しました。3つの組み合わせはすべて、非鎖の個々のプレマイクロRNA配列と比較して、強化された抑制活性を示しました。
トランスフェクションの少なくとも13日後に強力な抑制が観察されました。ヌクレオチド482〜502および2461〜2481を標的とするNelプレマイクロRNA構築物をトランスポザーゼ発現ベクターとニワトリ網膜に同時トランスフェクトすると、胚4.5日目にエメラルドGFP発現細胞において網膜色素上皮におけるNel発現が有意に減少した。8日齢の胚では、網膜神経節細胞でもNel発現が減少しました。
対照的に、網膜におけるNel発現は、対照マイクロRNAの導入によって影響を受けなかった。この手順に続いて、細胞の増殖と分化、細胞死、細胞と軸索のトレースなどのさまざまな方法を使用して、標的遺伝子抑制への影響を調べることができます。
