CYIY is supported by FAPESP (2012/14421-5) and FMV is supported by a fellowship from FAPESP (2009/53695-0). We thank the DNA Technologies Core at University of California, Davis for preparation and sequencing of the RNA-Seq libraries used in this work, the Galaxy team for providing an excellent and free interface for high-throughput sequencing data analysis tools and Dr. Marianne Bronner for allowing us to film in her laboratory space.

1.エレクトロポ卵内 HH12-13鶏胚の神経管への関心のコンストラクトトランスフェクションの満足できるレベルを有する個体の迅速な同定を可能にするために、好ましくはシストロン性転写物に、蛍光レポーターを使用するか、またはインターカレーウイルス2Aペプチド11で目的のタンパク質に融合した。注：この段階のための典型的なインキュベーション時間は37.8℃で、周りの48時間である。 <ol><li> ×1 1/2針18のGに結合された注射器でアルブミンの3ミリリットルを取り除いた後、卵に小さなウィンドウを開きます。胚の可視化を強化するために、胚1-4の下の滅菌リンゲル液中で1:50に希釈インド少量のインクを噴射する。 </li><li>無菌のリンゲル液で胚をカバーした後、それが満杯になるまで神経管の後端を通しての2.5μg/μlのDNAを含む10mMのTris-HCl、pHが8.2と0.1％の食品色素（F、D＆C）溶液を注入後脳領域まで。 、腹部に沿って4ミリメートル1離れた位置の白金電極（直径0.5mm）をエレクトロポレーションし、それら4の間に100ミリ秒の間隔で5〜50ミリ秒のパルス及び20 Vを送達する。 </li><li>エレクトロポレーション後、彼らはステージHH23に達するまでより48時間操作された胚をインキュベートし、蛍光実体顕微鏡下に横腹領域において、トランスフェクションの高いレベルを提示する個人を識別する。 注：エレクトロポレーション後のインキュベーションの持続時間は、実験の目的に依存します。電気穿孔プラスミドは2時間2の後に有意な発現レベルを生成することができる。関心が早期発症遺伝子である場合にはこのように、電気穿孔後の潜伏期間を短縮することができる。 </li></ol> 2.収穫が正常胚をトランスフェクトし、エレクトロポ脊髄の半分を解剖注：この手順は、それぞれ10胚および利回りのために2〜3時間から続く1胚あたり-2μgの全RNA。神経管の解剖は、微細な動きを必要とし、いくつかの練習セッションは、実験試料に適用する前に必要になることがあります。 <ol><li>のRNase汚染除去溶液で、または4時間12 150℃で焼成することにより、金属解剖ツールを除染し、DEPC処理PBSを準備します。唯一の新しい認定RNaseフリープラスチック製品を使用してください。 NOTE：収穫した後、それは切開中のRNaseの混入を防ぐために、標準治療に従うことが重要である。 </li><li>細かい解剖ハサミと篩い分けコレクションスプーンを使って胚を収穫。 100ミリメートルペトリ皿に冷たいDEPC処理PBSに胚を保つ。 </li><li>細かいピンセットで、（前部肢芽と後肢芽の前方限界の後方限界の間）全体腹部を切り出し、冷たいDEPC処理PBSを含む新しい皿にこのセクションを転送します。 </li><li>異なる3で穿孔する2本の細いガラス針を使用して、神経管と近軸中胚葉の間の胚の各背外側側に指摘している。 </li><li>中央穿孔2枚のガラス針を導入し、ゆっくりと神経管前後軸に沿ってそれらのいずれかを離れて移動。最初の動きが到達していなかった穿孔のためにこれを繰り返します。細かいピンセットで取り外した近軸中胚葉を削除します。 </li><li> 、横向きに胚を回し神経管と脊索の間ピンセットの先端を挿入し、二つの構造を分離する前後軸に沿って反対方向でそれらをスライドさせます。 注：これは、まだ神経管に取り付けられた中胚葉のほとんどを除去する必要があります。 </li><li>必要であれば、軽くピンセットの別のペアで神経管を保持しながら、ピンセットで引っ張ることにより、付着したままで中胚葉組織のいずれかの大きな部分を削除します。終了したら、そっと用いた冷DEPC処理PBSを含む別の皿に神経管を転送RNaseフリーのガラスパスツールピペット手動ピペットポンプに結合され、すべての管を解剖するまで氷上に保つ。 </li><li> 2半分に神経管を分割。このために、内腔にピンセットの閉じたペアの鋭い先端を挿入し、それを介してピンセットを移動することにより、屋根板を開く。この後、ピンセットの先端で床板を切断して半分を分ける。 </li><li>替えの氷冷DEPC処理PBSで満たし1.5mlチューブに蛍光解剖スコープと転送の下で非エレクトロポ半分からエレクトロポレーション。必要であれば、プラスチック壁に取り付けられた任意の組織を解放するために、チューブの沈降を促進するために穏やかにマイクロチューブをフリック。 </li><li> 3秒間100×gでスピンし、1mlのマイクロピペットで非常にゆっくりと、できるだけ多くのPBSを取り除く。どんな胚性物質がピペットチップに吸引されるかどうかを監視するためにマイクロチューブを通して輝く光源を見ながら、これを行う。これが発生した場合には、ゆっくりと放電しcentrifugaを繰り返する。 </li><li>神経管の半分あたりのRNA抽出のための溶解液70μlのを追加し、内容物を混合するチューブをフリック。 5分間激しくボルテックス、室温でインキュベートする。 5分のインキュベーションを繰り返し、さらに2回ボルテックスする。 -80℃で保存してください。 </li><li>次のステップのための十分な収量を確保するために、サンプルごとに少なくとも8神経管の半分を収集します。いくつかのエレクトロポレーション/切開セッションは神経管の十分な数を蓄積する必要がある場合に小さいサンプルをプールする。各条件について、重複や三連のために十分なサンプルを格納。 </li></ol> 3. R​​NAを精製し、イルミナシーケンシング用のライブラリを準備<ol><li> -80℃の貯蔵からのサンプルを取り出し、15〜30分間氷上に置きます。完了するまで室温で解凍を再開します。 </li><li>渦ウェルと5分間室温で残す。 1分間15000×gで再びボルテックスと遠心機は、不溶性物質をペレット化する。 </li><li>上清を新しいチューブに移し、総RNA単離キット取扱説明書に従ってRNA抽出に進む。濃度を高めるために推奨される最小ボリュームで溶出する。 注：クリーンアップ後のDNase処理はRNA-配列のデータセット中のゲノムDNA配列の潜在的な汚染を回避するために推奨される。 </li><li>内容物を混合し、品質管理分析のための5μlを除去するためにチューブをフリック。ライブラリの準備まで-80℃で残ったサンプルを保存する。これらの試料は、RNAの分解を避けるために一回だけ解凍されるべきである。 </li><li> RNA 6000ナノキットを使用して、バイオアナライザー機器で精製RNAを実行する。 RIN値は続行するには、少なくとも7以上でなければならない。 </li><li>イルミナ互換性RNA-のSeqライブラリ調製キットを使用してライブラリを生成し、単一の読み取りは100bpを生成するように設定HiSeq器具の1レーンに4図書館まで多重化する。可能な場合は、潜在的な技術的なアーティファクトを最小化するために、同じランですべてのサンプルが含まれています。 注：これは、最大5000万Rが得られるはずですほとんどの遺伝子13のカバレッジを得るために十分以上のものですサンプルあたりEADS、。 </li></ol> 4.ギャラクシー公開サーバ10においてRNA-配列データセットを比較してください。 NOTE：Serverストレージスペースが限られており、多数の試料を比較する実験では、フィルタリングステップで生成された中間ファイルの削除を要求することができる。 <ol><li> （ギャラクシー公開サーバにユーザーアカウントを作成し<a href="https://usegalaxy.org/">https://usegalaxy.org</a> ）とFTPはFASTQ形式でイルミナデータセットをアップロードします。 </li><li> NGS下FastqGroomer 14ツールでアップロードされたファイルを準備します。QCと操作メニュー 。品質スコアが既にのPhred + 33（サンガー）でエンコードされている場合、単純に各データセットの属性の下fastqsangerにファイルの種類を変更することで、このステップをスキップします。 </li><li> NGSの下FastQCツールを使用して各データセットの一般的な品質を分析：QCと操作私をNU。 注：これらの読み取りの端部をトリミングするために使用されるパラメータの推定値を提供するように特別な注意が、塩基配列の質ごとおよび塩基配列の含有量の結果のグラフィックスに与えられるべきである。 </li><li> QCと操作メニュー：トリムがNGSの下にツールFASTQ品質トリマー 14を用いて低品質データで終わる3 &#39;を破棄するように読み取ります。唯一の3 &#39;が20以下の品質スコアのために終了処理するためのツールを設定します。 </li><li> クリップツール（使用して読み取ってから、アダプター配列を除去<a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/を</a> QCと操作メニュー：NGSの下）。左未満45 bpの、入力に使用されるアダプタのシーケンスで読み込んで破棄し、両方のクリッピングおよび非クリッピング配列を含むよう出力を選択するためのツールを設定してください。さらに、ほとんどの低品質の塩基は既に最後の工程で除去されたため、未知の塩基とのシーケンスを破棄しないように選ぶ。 </lI&gt; <li>ツールトリム配列 （使用して<a href="http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/">http://hannonlab.cshl.edu/fastx_toolkit/</a> NGS下）：FastQCによって検出された5 &#39;配列バイアス（通常は10）を除去するために読み込んでのQCと操作メニューを、最初の拠点をトリミング。 注：この時点で、それは再びFastQCを実行し、データセットの品質が向上したかどうかを判断するために以前の分析と比較することをお勧めします。 </li><li>ダウンロードして、イルミナiGenomesからUCSCゲノムブラウザの最新のニワトリゲノムアセンブリをアンパック（ <a href="http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn">http://support.illumina.com/sequencing/sequencing_software/igenome.ilmn</a> ）および全ゲノムFASTA形式ファイルと遺伝子注釈GTF形式のファイルをアップロードする銀河の歴史にGETデータ]メニューの下にツールのアップロードファイルを使用して。 </li><li>マップはTopHat2 15歳未満のアライナーを使用したニワトリゲノムに各サンプルについて読み取っNGS：RNA分析メニュー 。履歴からゲノムを使用することを選択し（ ステップ4.7でアップロードFASTAファイルを選択します）。 </li><li> RNA分析メニュー：NGSの下カフス 16を使用して、各サンプルの予測トランスクリプトームを構築します。 （歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、ガイドとして参照アノテーションを使用するかを選択します（ ステップ4.7でアップロードGTFファイルを選択します）とオプションをオンにしてください。 </li><li> RNA分析メニュー：NGSの下Cuffmerge 16を使用して、すべてのサンプルの予測トランスクリプトームをマージします。 （歴史、ステップ4.7からFASTAファイルから）とシーケンスデータ（ ステップ4.7からGTFファイル）参照アノテーションを使用するかを選択します。 </li><li> RNA分析メニュー：NGSの下Cuffdiff 16を用いて、各サンプルについてTopHat2によって生成されたBAMファイルを比較。分野では転写物は私を選択Cuffmergeによって生成されたトランスクリプトームをrgedと（歴史、 ステップ4.7からFASTAファイルから） バイアス補正を実行し、 正しいマルチリードを使用して、オプションをオンにします。 </li><li>ソート差動式はフィルターの下のツールを使って数値的にソート列13（q値）で昇順のテーブルをテストして、メニューをソートします 。 注：実験条件の間に有意な差発現を示す遺伝子/転写物は最も低いQ値を紹介します。 </li><li>カバレッジグラフで視覚的に結果を確認するには、最初のツールはBEDToolsメニューの下ゲノムカバレッジ 17 のBedGraphを作成し使用してbedGraph形式にBAMファイルを変換する。報道せずに地域の報告を無効にするには、明確な区間としてスプライスされたエントリを治療し、比較されているすべてのデータセットのためのシーケンシングの深さを正規化係数によってカバレッジを拡大することを選択した。 </li><li>使用して大物形式に結果のbedGraphファイルを変換するツールウィッグ/ BedGraph·ツー·大物 （ <a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> ） 変換フォーマットメニューの下。 UCSCゲノムブラウザ（でカスタムトラックとして大物ファイルをアップロード<a href="http://www.genome.ucsc.edu/">http://www.genome.ucsc.edu/</a> galGal4アセンブリ用）とデータセット内のカバレッジを可視化するために目的の遺伝子を検索します。 </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

ここでは、鶏脊髄のエレクトロポレーション後の効果を分析するためのガイドラインを提供する。 DNAベクターのエレクトロポレーションは、より頻繁に目的の遺伝子を過剰発現するために使用されるが、一方はまた、遺伝子機能のノックダウン条件19-21を生成するために、siRNAのためのドミナントネガティブ、quimericタンパク質または前駆体をコードする構築物を使用することができ?...

OVOエレクトロポレーションで部分的にDNAが1-5を構築して、in vivoでの胚の構造をトランスフェクトするための迅速かつ安価な方法を表しているので、ライブ生物に関する遺伝学的研究は、頻繁にモデルとしてニワトリ胚を使用しています。このようpCIG 6または7のPMEとして目的の遺伝子と一緒に蛍光レポーターを含むもの転写物をコードするシストロン性発現ベクターは、下流の分析のための胚を処理する前に、立体顕微鏡下で所望の領域でのトランスフェクションの質の迅速な検証を可能にする。 DNA配列決定における最近の進歩により、これは、RNA配列8,9を用いて、RNAサンプルからデジタル全トランスクリプトーム発現プロファイルを得ることが可能である。したがって、代わりにそのようなin situハイブリダイゼーション 、免疫組織化学および定量PCR、cDNAライブラリーの調製のためのように並列に少数の遺伝子産物の解析を可能にする時間のかかる方法のハイスループットシークエンシングは、全トランスクリプトームの情報を提供することができる。一つ一つの遺伝子の発現レベルに対する影響の実験的観察は、次に使用される構築物によって改変経路に対する強力な洞察を提供してもよい。使用される生物ゲノムアセンブリが​​利用可能である場合、これは、このように、ニワトリ胚を再度適切なモデルであり、特に容易である。 ユーザが信頼できるゲノム配列決定センターへのアクセス権がある場合、主な問題は、高品質のRNAサンプルを得ることである。この研究は、RNA-配列に適したトランスフェクトされた神経管、ならびに得られたデータセットのインシリコ分析における下流の工程からのRNAサンプルを得るための方法を示す。 48時間のインキュベーションに続いてHH12-13でエレクトロポレーション後、トランスフェトランク脊髄の半分は、リボヌクレアーゼを含まない条件下で解剖直後に溶解し、さらにRNA精製およびライブラリpreparatまで超低凍結による分解から保護されていたイオン。 ギャラクシー公開サーバ10は、ハイスループット配列決定データを分析するための空きリソースへのアクセスを提供する。登録ユーザーのために提供スペースの量は、このようにローカルな計算インフラの必要性を排除し、小規模な実験のために十分である。 RNA-配列データ解析、フィルタリング、整列および遺伝子発現の定量/比較を含む。 RNA-配列データ解析のための一般的なガイドラインがあるが、フィルタリングパラメータは、配列決定の品質に大きく依存し、生データの品質管理分析の後に決定されるべきである。 このプロトコルは、入手して、in vivoでトランスフェクトしたニワトリ胚性脊髄からRNA-配列プロファイルを比較する手順について説明します。代表的な結果として、空のベクターでトランスフェクトした二つの独立した対照試料から得られたデータセットの比較は、方法は、再現性があり、示差的EXPRESの同定を可能にするはずであることを示した実験試料におけるSEDの転写産物。従って、この方法の適用は大きく一つの実験後の発見の数を増加させ、したがって、その後の調査のために、大量のデータセットを提供する可能性を有する。

<table><tbody><tr><td>Indian ink</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>18G x 1 1/2 needle</td><td>BD</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>3 ml syringe</td><td>BD</td><td>309657</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>MP Biomedicals</td><td>819620</td><td></td></tr><tr><td>F D &amp;amp; C Blue 1</td><td>Spectra Colors Corporation</td><td>5.FC.0010P0</td><td>Food Dye used to visualize DNA injection</td></tr><tr><td>Ringer&#039;s solution (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 7.2 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.37 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.225 g CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;#8226;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>10043-52-4</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.217 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;.7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.02 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 800 ml and adjust pH to 7.4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Filter and autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Solution) (1 L)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 8 g NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9888</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.2 g KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-4504</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 1.15 g Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;#8226;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-9390</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 0.2 g KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5379</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 800 ml and adjust pH to 7.2</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - ddH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O to 1 L and filter</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - 1 ml DEPC (Diethylpyrocarbonate)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-5758</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Shake vigorously and let stand overnight at room temperature</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; - Autoclave</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sieved spoon</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile 60 x 15 mm polystirene Petri dishes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>RNaseZap RNase decontamination solution</td><td>Life Technologies</td><td>AM9780</td><td></td></tr><tr><td>Fine point surgical scissors</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Straight fine point tweezers</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pulled glass needle made from 1.1 x 75 mm glass capillary tubes</td><td>Kimble Chase</td><td>40A502</td><td></td></tr><tr><td>9&#039;&#039; glass Pasteur pipette</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Manual pipette pump</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Clear 1.5 ml microcentrifuge polypropilene tubes</td><td>Corning Life Sciences</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNAlater solution for RNA stabilization</td><td>Life Technologies</td><td>AM7020</td><td></td></tr><tr><td>RNAqueous total RNA isolation kit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1912</td><td></td></tr><tr><td>Molecular Biology Grade Ethanol</td><td>Any supplier</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RNA 6000 Nano Kit</td><td>Agilent Technologies</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>2100 Electrophoresis Bioanalyzer Instrument</td><td>Agilent Technologies</td><td>G2939AA</td><td></td></tr><tr><td>Truseq RNA Sample Preparation Kit v2</td><td>Illumina</td><td>RS-122-2001/RS-122-2002</td><td></td></tr></tbody></table>

rna-seq analysis of differential gene expression in electroporated chick embryonic spinal cord

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome wide analysis of differentially expressed transcripts after such an experimental manipulation has the potential to uncover an almost complete picture of the downstream effects caused by the transfected construct. This work describes a simple method for comparing transcriptomes from samples of transfected embryonic spinal cords comprising all steps between electroporation and identification of differentially expressed transcripts. The first stage consists of guidelines for electroporation and instructions for dissection of transfected spinal cord halves from HH23 embryos in ribonuclease-free environment and extraction of high-quality RNA samples suitable for transcriptome sequencing. The next stage is that of bioinformatic analysis with general guidelines for filtering and comparison of RNA-Seq datasets in the Galaxy public server, which eliminates the need of a local computational structure for small to medium scale experiments. The representative results show that the dissection methods generate high quality RNA samples and that the transcriptomes obtained from two control samples are essentially the same, an important requirement for detection of differential expression genes in experimental samples. Furthermore, one example is provided where experimental overexpression of a DNA construct can be visually verified after comparison with control samples. The application of this method may be a powerful tool to facilitate new discoveries on the function of neural factors involved in spinal cord early development.

記載された方法を検証するために、2つの対照サンプルは、空のベクターのPME 7とインサートニワトリSCRT2 18のジンクフィンガードメインをコードSCRT2-ZNFの構築を含む同じベクターでトランスフェクトされた胚から1つのサンプルを用いてエレクトロポレーション胚から生成した。各11-22μgのトータルRNAを得た試料は、8〜12の胚のプールから得た。すべての3つのサンプルは、高品...

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RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

エレクトロポひよこ胚脊髄における遺伝子発現差のRNA-配列解析

In ovo electroporation of the chick neural tube is a fast and inexpensive method for identification of gene function during neural development. Genome ...

rna-seq-analysis-differential-gene-expression-electroporated-chick

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

14.5K ビュー.  Universidade de São Paulo. This video shows the basic steps for performing whole transcriptome analysis on dissected chick embryonic spinal cord samples after transfection with in ovo electroporation.

ビデオ: RNA-Seq Analysis of Differential Gene Expression in Electroporated Chick Embryonic Spinal Cord

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, transcription factors, or chromatin-modifying enzymes at a given locus or on a genome-wide scale. The combination of ChIP assays with next-generation sequencing (i.e., ChIP-Seq) is a powerful approach to globally uncover gene regulatory networks and to improve the functional annotation of genomes, especially of non-coding regulatory sequences. ChIP protocols normally require large amounts of cellular material, thus precluding the applicability of this method to investigating rare cell types or small tissue biopsies. In order to make the ChIP assay compatible with the amount of biological material that can typically be obtained in vivo during early vertebrate embryogenesis, we describe here a simplified ChIP protocol in which the number of steps required to complete the assay were reduced to minimize sample loss. This ChIP protocol has been successfully used to investigate different histone modifications in various embryonic chicken and adult mouse tissues using low to medium cell numbers (5 x 104 - 5 x 105 cells). Importantly, this protocol is compatible with ChIP-seq technology using standard library preparation methods, thus providing global epigenomic maps in highly relevant embryonic tissues.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP Protocol for Low-abundance Embryonic Samples

Here, we describe a chromatin immunoprecipitation (ChIP) and ChIP-seq library preparation protocol to generate global epigenomic profiles from low-abundance chicken embryonic samples.

クロマチン免疫沈降 (チップ) プロトコル低豊富な胚サンプル

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a widely-used technique for mapping the localization of post-translationally modified histones, histone variants, ...

遺伝学

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

2および3次元の胚様体中のマウス胚性幹細胞のレチノイン酸誘発神経分化の分析

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

発生生物学

Direct Gene Knock-out of Axolotl Spinal Cord Neural Stem Cells via Electroporation of CAS9 Protein-gRNA Complexes

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) throughout life, which proliferate to reform the ependymal tube and differentiate into lost neurons after spinal cord injury. Deciphering how these NSCs retain pluripotency post-development and proliferate upon spinal cord injury to reform the exact pre-injury structure can provide valuable insight into how mammalian spinal cords may regenerate as well as potential treatment options. Performing gene knock-outs in specific subsets of NSCs within a restricted time period will allow study of the molecular mechanisms behind these regenerative processes, without being confounded by development perturbing effects. Described here is a method to perform gene knock-out in axolotl spinal cord NSCs using the CRISPR-Cas9 system. By injecting the CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation, target genes are knocked out in NSCs within specific regions of the spinal cord at a desired timepoint, allowing for molecular studies of spinal cord NSCs during regeneration.

Presented here is a protocol to perform time- and space-restricted gene knock-out in axolotl spinal cords by injecting CAS9-gRNA complex into the spinal cord central canal followed by electroporation.

CAS9タンパク質-gRNA複合体のエレクトロポレーションによるアクソロトル脊髄神経幹細胞の直接遺伝子ノックアウト

The axolotl has the unique ability to fully regenerate its spinal cord. This is largely due to the ependymal cells remaining as neural stem cells (NSCs) ...

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are located in the dorsal spinal cord and send their axons along stereotyped trajectories. Commissural axons initially project ventrally towards and then across the floorplate. After crossing the midline, these axons make a sharp rostral turn and project longitudinally towards the brain. Each of these steps is regulated by the coordinated activities of attractive and repulsive guidance cues. The correct interpretation of these cues is crucial to the guidance of axons along their demarcated pathway. Thus, the physiological contribution of a particular molecule to commissural axon guidance is ideally investigated in the context of the living embryo. Accordingly, gene knockdown in vivo must be precisely controlled in order to carefully distinguish axon guidance activities of genes that may play multiple roles during development.
Here, we describe a method to knockdown gene expression in the chicken neural tube in a cell type-specific, traceable manner. We use novel plasmid vectors3 harboring cell type-specific promoters/enhancers that drive the expression of a fluorescent protein marker, followed directly by a miR30-RNAi transcript4 (located within the 3'-UTR of the cDNA encoding the fluorescent protein) (Figure 1). When electroporated into the developing neural tube, these vectors elicit efficient downregulation of gene expression and express bright fluorescent marker proteins to enable direct tracing of the cells experiencing knockdown3. Mixing different RNAi vectors prior to electroporation allows the simultaneous knockdown of two or more genes in independent regions of the spinal cord. This permits complex cellular and molecular interactions to be examined during development, in a manner that is fast, simple, precise and inexpensive. In combination with DiI tracing of commissural axon trajectories in open-book preparations5, this method is a useful tool for in vivo studies of the cellular and molecular mechanisms of commissural axon growth and guidance. In principle, any promoter/enhancer could be used, potentially making the technique more widely applicable for in vivo studies of gene function during development6.
This video first demonstrates how to handle and window eggs, the injection of DNA plasmids into the neural tube and the electroporation procedure. To investigate commissural axon guidance, the spinal cord is removed from the embryo as an open-book preparation, fixed, and injected with DiI to enable axon pathways to be traced. The spinal cord is mounted between coverslips and visualized using confocal microscopy.

In ovo Electroporation of miRNA-based Plasmids in the Developing Neural Tube and Assessment of Phenotypes by DiI Injection in Open-book Preparations

A method by which gene expression in the neural tube can be downregulated in a cell type-specific, traceable manner is described. We demonstrate how in ovo electroporation of microRNA-based plasmids that elicit spatiotemporally controlled RNA interference can be used to investigate commissural axon guidance in the developing neural tube.

オープンブックの準備におけるDiIを注入による開発神経管と表現型の評価におけるmiRNAベースのプラスミドのインオボエレクトロで

Commissural dI1 neurons have been extensively studied to elucidate the mechanisms underlying axon guidance during development1,2. These neurons are ...

神経科学

Electroporation of the Hindbrain to Trace Axonal Trajectories and Synaptic Targets in the Chick Embryo

Electroporation of the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient for the expression of foreign genes into neuronal cells. In this manuscript we provide a method that demonstrates uniquely how to electroporate DNA into the avian hindbrain at E2.75 in order to specifically label a subset of neuronal progenitors, and how to follow their axonal projections and synaptic targets at much advanced stages of development, up to E14.5. We have utilized novel genetic tools including specific enhancer elements, Cre/Lox - based plasmids and the PiggyBac-mediated DNA transposition system to drive GFP expression in a subtype of hindbrain cells (the dorsal most subgroup of interneurons, dA1). Axonal trajectories and targets of dA1 axons are followed at early and late embryonic stages at various brainstem regions. This strategy contributes advanced techniques for targeting cells of interest in the embryonic hindbrain and for tracing circuit formation at multiple stages of development.

How neuronal networks are established in the embryonic brain is a fundamental question in developmental neurobiology. Here we combined an electroporation technique with novel genetic tools, such as Cre/Lox&#x2013;plasmids and PiggyBac-mediated DNA transposition system in the avian hindbrain to label dorsal interneurons and track their axonal projections and synaptic targets at various developmental stages.

ニワトリ胚における軸索軌道とシナプスターゲットを追跡する後脳のエレクトロ

Electroporation of  the chick embryonic neural tube has many advantages such as being quick and efficient  for the expression of foreign genes into ...

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking axonal projection of spinal interneurons in vertebrates, germ line-targeted reporter genes yield bilaterally symmetric labeling. Therefore, it is hard to distinguish between the ipsi- and contra-laterally projecting axons. Unilateral electroporation into the chick neural tube provides a useful means to restrict expression of a reporter gene to one side of the central nervous system, and to follow axonal projection on both sides 1 ,2-5. This video demonstrates first how to handle the eggs prior to injection. At HH stage 18-20, DNA is injected into the sacral level of the neural tube, then tungsten electrodes are placed parallel to the embryo and short electrical pulses are administered with a pulse generator. The egg is sealed with tape and placed back into an incubator for further development. Three days later (E6) the spinal cord is removed as an open book preparation from embryo, fixed, and processed for whole mount antibody staining. The stained spinal cord is mounted on slide and visualized using confocal microscopy.

Deciphering Axonal Pathways of Genetically Defined Groups of Neurons in the Chick Neural Tube Utilizing in ovo Electroporation

This video demonstrates how to visualize axonal pathways of genetically defined groups of neurons in the embryonic chick spinal cord utilizing in ovo electroporation of reporter genes under the control of specific enhancer elements.

活用チック神経管の神経細胞の遺伝的に定義されたグループの軸索経路の解読卵のエレクトロポレーション

Employment of enhancer elements to drive expression of reporter genes in neurons is a widely used paradigm for tracking axonal projection. For tracking ...

生物学

Multiplexed Single Cell mRNA Sequencing Analysis of Mouse Embryonic Cells

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental biology. It has been successfully used to identify rare cell populations, discover novel marker genes, and decode spatial and temporal developmental information. The single cell method has also evolved from the microfluidic based Fluidigm C1 technology to the droplet-based solutions in the last two to three years. Here we used the heart as an example to demonstrate how to profile the mouse embryonic tissue cells using the droplet based scRNA-Seq method. In addition, we have integrated two strategies into the workflow to profile multiple samples in a single experiment. Using one of the integrated methods, we have simultaneously profiled more than 9,000 cells from eight heart samples. These methods will be valuable to the developmental biology field by providing a cost-effective way to simultaneously profile single cells from different genetic backgrounds, developmental stages, or anatomical locations.

Here we presented a multiplexed single cell mRNA sequencing method to profile gene expression in mouse embryonic tissues. The droplet-based single cell mRNA sequencing (scRNA-Seq) method in combination with multiplexing strategies can profile single cells from multiple samples simultaneously, which significantly reduces reagent costs and minimizes experimental batch effects.

マウス胚細胞の多重化単細胞mRNAシーケンシング解析

Single cell mRNA sequencing has made significant progress in the last several years and has become an important tool in the field of developmental ...

Differentiation and Characterization of Neural Progenitors and Neurons from Mouse Embryonic Stem Cells

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays to characterize the differentiated cells. The E14 mouse embryonic stem cells were used to form embryoid bodies through the hanging drop method, and then induced to differentiate into neural progenitor cells by retinoic acid, and finally differentiated into neurons. Quantitative&#160;reverse transcription&#160;polymerase chain reaction (RT-qPCR) and immunofluorescence experiments revealed that the neural progenitors and neurons exhibit corresponding markers (nestin for neural progenitors and neurofilament for neurons) at day 8 and 12 post-differentiation, respectively. Flow cytometry experiments on an E14 line expressing a Sox1 promoter-driven GFP reporter showed that about 60% of cells at day 8 are GFP positive, indicating the successful differentiation of neural progenitor cells at this stage. Finally, RNA-seq analysis was used to profile the global transcriptomic changes. These methods are useful for analyzing the involvement of specific genes and pathways in regulating the cell identity transition during neuronal differentiation.

We describe the procedure for the in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells into neuronal cells using the hanging drop method. Furthermore, we perform a comprehensive phenotypic analysis through RT-qPCR, immunofluorescence, RNA-seq, and flow cytometry.

マウス胚性幹細胞からの神経前駆細胞とニューロンの分化と特徴付け

We describe the step-by-step procedure for culturing and differentiating mouse embryonic stem cells into neuronal lineages, followed by a series of assays ...

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing (Frog) Embryo

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design efficient remedies for diseases. Technologies enabling accurate identification and quantification of diverse types and large numbers of proteins would provide still missing information on molecular mechanisms orchestrating tissue and organism development in space and time. Here, we present a mass spectrometry-based protocol that enables the measurement of thousands of proteins in identified cell lineages in Xenopus laevis (frog) embryos. The approach builds on reproducible cell-fate maps and established methods to identify, fluorescently label, track, and sample cells and their progeny (clones) from this model of vertebrate development. After collecting cellular contents using microsampling or isolating cells by dissection or fluorescence-activated cell sorting, proteins are extracted and processed for bottom-up proteomic analysis. Liquid chromatography and capillary electrophoresis are used to provide scalable separation for protein detection and quantification with high-resolution mass spectrometry (HRMS). Representative examples are provided for the proteomic characterization of neural-tissue fated cells. Cell-lineage-guided HRMS proteomics is adaptable to different tissues and organisms. It is sufficiently sensitive, specific, and quantitative to peer into the spatio-temporal dynamics of the proteome during vertebrate development.

Cell-Lineage Guided Mass Spectrometry Proteomics in the Developing Frog Embryo

Here we describe a mass spectrometry-based proteomic characterization of cell lineages with known tissue fates in the vertebrate Xenopus laevis embryo.

発生中の(カエル)胚における細胞系譜ガイド質量分析プロテオミクス

Characterization of molecular events as cells give rise to tissues and organs raises a potential to better understand normal development and design ...

化学

Chromatin Immunoprecipitation Assay for Tissue-specific Genes using Early-stage Mouse Embryos

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This technique has been widely exploited in tissue culture cells, and to a lesser extent, in primary tissue. The application of ChIP to rodent embryonic tissue, especially at early times of development, is complicated by the limited amount of tissue and the heterogeneity of cell and tissue types in the embryo. Here we present a method to perform ChIP using a dissociated embryonic day 8.5 (E8.5) embryo. Sheared chromatin from a single E8.5 embryo can be divided into up to five aliquots, which allows the investigator sufficient material for controls and for investigation of specific protein:chromatin interactions.
We have utilized this technique to begin to document protein:chromatin interactions during the specification of tissue-specific gene expression programs. The heterogeneity of cell types in an embryo necessarily restricts the application of this technique because the result is the detection of protein:chromatin interactions without distinguishing whether the interactions occur in all, a subset of, or a single cell type(s). However, examination of tissue-specific genes during or following the onset of tissue-specific gene expression is feasible for two reasons. First, immunoprecipitation of tissue specific factors necessarily isolates chromatin from the cell type where the factor is expressed. Second, immunoprecipitation of coactivators and histones containing post-translational modifications that are associated with gene activation should only be found at genes and gene regulatory sequences in the cell type where the gene is being or has been activated. The technique should be applicable to the study of most tissue-specific gene activation events.
In the example described below, we utilized E8.5 and E9.5 mouse embryos to examine factor binding at a skeletal muscle specific gene promoter. Somites, which are the precursor tissues from which the skeletal muscles of the trunk and limbs will form, are present at E8.5-9.54,5. Myogenin is a regulatory factor required for skeletal muscle differentiation 6-9. The data demonstrate that myogenin is associated with its own promoter in E8.5 and E9.5 embryos. Because myogenin is only expressed in somites at this stage of development 6,10, the data indicate that myogenin interactions with its own promoter have already occurred in skeletal muscle precursor cells in E8.5 embryos.

We demonstrate a chromatin immunoprecipitation (ChIP) method to identify factor interactions at tissue-specific genes during or after the onset of tissue-specific gene expression in mouse embryonic tissue. This protocol should be widely applicable for the study of tissue-specific gene activation as it occurs during normal embryonic development.

初期段階のマウス胚を用いて組織特異的遺伝子のためのクロマチン免疫沈降アッセイ

Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a powerful tool to identify protein:chromatin interactions that occur in the context of living cells 1-3. This ...