JALはNIH助成金K08EY030923によってサポートされました。CMCは、NIH国立関節炎・筋骨格疾患研究所のK01助成金(5K01AR060169)と、ルプス研究同盟の新しい研究助成金(637405)によって支援されました。

すべての手続きは、ノースウェスタン大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。C57BL/6マウスは、ノースウェスタン大学比較医学センター(イリノイ州シカゴ)のバリア施設に収容された。すべての動物は、食料と水への無料アクセスで12/12時間の明暗サイクルに収容されました。
1. 眼組織の採取
<ol><li>マウスが反応せず、もはや吸入しなくなるまで、二酸化炭素の調節された投与を使用して、いずれかの性別の10-12週齢のC57BL/ 6Jマウスを犠牲にする。頸部脱臼または他の承認された二次的方法を行い、安楽死を確実にする。 注:経心筋灌流は、眼組織にない循環性白血球を除去するために行うことができる。この実験では、全身灌流は、ミクログリア、単球、マクロファージ、またはレーザー処理された全眼で検出された樹状細胞の数を減らさない。したがって、これらの細胞タイプの大部分は眼組織に位置しており、このステップは任意である。</li>
	<li>目を引き起動させるには、ソケットの外に出ると、湾曲した鉗子を目の下にそっと置きながら、目のソケットの近くを押し下げます。実際の目を絞らずに目の下に閉じたピンチ鉗子。周囲の結膜から眼を取り除く(事前の出版物を参照してください)23.</li>
	<li>視神経が目を切り離す唯一の残りの接続になるまで、横に目を引きます。視神経はしばしば緊張で切断するが、視神経を切るために小さいはさみが必要な場合もある。1.7 mLマイクロ遠心分離チューブにカルシウムとマグネシウムを入れたコールド1xハンクの緩衝生理液(HBSS)に目を入れます。</li>
</ol>2. 眼組織の消化
<ol><li>0.1 mg/mL消化酵素と0.2 mg/mL DNaseを含む消化バッファーを冷たいHBSSで調製します。最初は滅菌水の2 mLで5mgの消化酵素を再構成する。HBSSで10mg/mL DNaseの初期希釈を準備します。消化バッファーの10 mL(3匹分の十分)ごとに、9.4mLの冷たいHBSSを0.4 mLの再構成消化酵素と希釈DNase Iを混ぜます。 注:これらの濃度は、細胞死を減らしながら、単一細胞の抗体染色の最適なレベルを提供するために、複数の実験で経験的に決定されました。コラゲナーゼDは、細胞生存率を低下させ、CD45+細胞を減少させた消化酵素の代替として試みた。消化を最適化するための反復プロセスの詳細については、議論を参照してください。</li>
	<li>全拡大率10倍の解剖顕微鏡の下で、冷たいHBSSで微細な鉗子とスプリングハサミを使用して残りの結膜と視神経を取り除きます。</li>
	<li>きれいな目を乾燥した解剖皿または小さな重量を量るボートに移しなさい。視覚軸を通して目に2つの穿ファリング創傷が作られ、消化バッファー出口のためのこの最初の創傷から90°離れた後、30 G針を取り付けた注射器を介して0.15-0.20 mL/目の消化バッファーを眼窩腔に注入します。</li>
	<li>0.5 mm x 0.5 mm 未満のすべての部分を持つスプリングハサミと細かい鉗子を使用して目全体をミンチ。後のステップでピペットの先端を詰まらせないように鉗子を介して鈍い機械的破壊とレンズティッシュを解体する。各サンプルに対して、0.75 mLの消化バッファーを小皿に洗い換えます。サンプルごとに新しい料理を使用します。</li>
	<li>ピペット移動で材料を失わないように注意してP1000ピペットを使用して氷上の解離チューブに皿の内容物を移します。さらに1.5 mLの消化バッファーで皿をリンスし、解離管の総容積を3.25〜3.50 mLにします。</li>
	<li>解離管を電子解離器に反転させ、サイクル「m_brain_03_01」を実行し、200rpmで1minの単方向回転を室温で構成し、プリロードプログラムです。すべての組織が消化バッファーとこれおよびすべての残りのステップのためのローターと接触している解離管の底にあることを確認してください。</li>
	<li>37°Cで200rpmで30分間揺れるインキュベーターに解離管を置きます。</li>
	<li>ステップ 2.6 と 2.7 を 1 回繰り返します。2回目の30分インキュベーションに続いて、ステップ2.6のように電子解離器を使用して1つの最終的な機械的消化を行う。</li>
	<li>10 mLのコールドフローバッファーを加えて反応を停止し、チューブを氷の上に置きます。</li>
</ol>3. 細胞懸濁液の調製
<ol><li>単一細胞懸濁液を作成するには、50 mL円錐形遠心分離管の上部に配置された40 μmフィルターを介して停止した眼の消化反応を注ぎます。2.5 mLの注射器からプランジャーを使用して、残りの未消化眼組織をフィルターに押し込みます。</li>
	<li>同じプランジャーを使用して再び未消化の眼組織片をフィルターに通す前に、フローバッファーとリンスフィルターの10 mLで解離チューブを洗浄します。</li>
	<li>5 mL のフローバッファを使用して、ステップ 3.2 を繰り返します。</li>
	<li>解離管を洗浄し、フローバッファーの最後の 10 mL でフィルターします。 注:消化およびフローバッファの総量は、各サンプルで約38〜40 mLです。</li>
	<li>円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。</li>
	<li>滅菌水に10倍溶解溶液を加えて1x溶解液を調製します。別のチューブにチューブをフリックしてペレットを分割します。赤血球を溶解するには、室温(RT)で渦巻く30 sの1x溶解溶液の1mLを加える。</li>
	<li>20 mLのフローバッファで反応を停止します。</li>
	<li>円錐管を4°Cで10分間 400xg で遠心する。細胞ペレットを乱さずに上清をデカントする。</li>
	<li>別のチューブにチューブをフリックしてペレットを解化します。チューブあたり5 mLのコールド1x HBSSを追加します。</li>
	<li>遠心管 400xg で4°Cで10分間。吸気上清。</li>
</ol>4. 単核食細胞の細胞懸濁液の染色
<ol><li>冷たいHBSSでライブ/デッド染料1:500を希釈することにより、サンプルごとに0.5 mLのライブ/デッド染色を準備してください。</li>
	<li>P1000ピペットを使用して各サンプルにライブ/デッド染色を加え、ペレットを完全に解約してください。サンプルを1.2 mLマイクロ価器チューブに移します。</li>
	<li>小さなアリコート(10 μL)を取り、ヘモサイトメーターまたは自動セルカウンター(4.4参照)を使用して細胞を数えます。暗闇の中で室温で15分間、ライブ/デッド染色でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>Trypan ブルーを使用してセル数をカウントし、サンプルあたりのライブ セル数を決定します。 注:通常、10-12週齢のC57BL/6Jマウスの2つの目は、2 x 106個 の生細胞未満を含んでいます。</li>
	<li>400 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。</li>
	<li>500 μL のコールド フロー バッファで細胞を完全に再懸濁します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。</li>
	<li>Fcブロックの50 μL(精製ラット抗マウスCD16/CD32のコールドフローバッファーでの1:50希釈)で最大5 x 106の生細胞をブロックします。5 x 106個以上の細胞の場合は、ボリュームを適宜増やしてください。</li>
	<li>サンプルを完全に解体するようにペレットにFc ブロックを加えます。4°Cで20分間インキュベートします。</li>
	<li>50 μLの抗体染色溶液(溶液に含まれる各抗体の選択量については表1を参照)を、生細胞あたり5 x 106の細胞を直接Fcブロック内の細胞に加え、完全に混合します。4°Cで30分間インキュベートします。 注:抗体量はフローサイトメーターの構成に依存し、各ラボと機器に対して個別に滴定する必要があります。フィルターとミラーのインストゥルメント構成については、 表 2 を参照してください。抗体を評価するには、メーカーの推奨から始め、染色指数を計算します。様々な抗体濃度(メーカーの推奨値の上下)の試験実行を行い、染色指数が維持される抗体の最低濃度を選択します。また、単色コントロールよりも明るい正の染色を確認してください。負の染色されたセルがスケールで、1 x 102未満のピークを持つことを確認するために、染色されていないセルを使用します。正に染色された細胞を定義するには、蛍光から 1 つのコントロールを引いたものを使用します。</li>
	<li>700 μL のコールド フロー バッファを加えてサンプルを洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱さずに上清を吸引する。</li>
	<li>場合によっては、抗体染色後、フローバッファー内のパラホルムアルデヒドを500 μLの2%で固定できます。室温で15分間サンプルを固定します。次に、4.10に記載のとおり1回の洗浄を行う。4 °Cで固定サンプルを保管してください。カウントビードは、フローサイトメトリーデータ収集の日に追加する必要があります。固定サンプルは、1〜2日でフローサイトメーターで実行する必要があります。 注意:パラホルムアルデヒドは腐食性および健康上の危険である。</li>
	<li>500 μL のコールド フロー バッファを使用して、サンプルを再度洗浄します。400 x g のマイクロ力器管ラック内の遠心管を4°Cで10分間用いた。細胞ペレットを乱すことなく上清の半分を吸引する。</li>
	<li>ペレットを再懸濁し、96ウェルのUボトムアッセイプレートに移します。遠心板 400xg で5分4°Cで。上清をデカントするには、プレートをひっくり返し、1つの強いシェイクでペレットを乱すことなく、液体をシンク盆地に取り除きます。</li>
	<li>新しい1.2 mLマイクロ・トイターチューブに、50 μLのウェルボルテックス・カウントビーズを配置します。</li>
	<li>200 μL のコールド フロー バッファで 96 ウェル プレートにペレットを再懸濁します。前のステップからビーズの上に細胞混合物を追加します。250 μL/マイクロ力さチューブの総容積でフローサイトメーターで実行します。</li>
</ol>5. フローサイトメトリーデータの収集
<ol><li>オンにして、フローサイトメーターを準備します。ここに記載されている指示は、修正された4つのレーザーサイトメーターのためのものです(表2)。</li>
	<li>各サンプルの小さなアリコートを含むテストサンプルを実行し、各検出器のすべてのセルがスケールであることを確認します。すべてのセルがスケールになるように電圧を調整します。</li>
	<li>染色カクテルに使用されるフルオロフォアごとに単一のカラーコントロール(SCC)を実行する(表3)。マイクロ力価チューブを大きな5 mLポリスチレンチューブに入れ、フローサイトメーターステージに配置します。 注:BV421(パシフィックブルー)、FITC、PE、Alexa647(APC)、Alexa700などの根管内フルオロフォアは、カクテルと同じ抗体を必要としません(CD64 PEのCD19 PE)。しかし、PE-CF594、PE-Cy7、またはAPC-Cy7のようなタンデムフルオロフォアは、コンジュゲートフルオロフォアの解離の可能性があるため、カクテルと同じSCC抗体を必要とします。<ol>
<li>1.2 mLのタイターチューブに2滴の補償ビーズを加え、ハムスターアンチマウスCD11c BV421を1μLと一緒に追加して、BV421用のSCCを作成します。補正ビーズは、CD11c BV421が5.3.3で説明したようにカッパではなくIgGラムダサブタイプであるため使用されます。4°Cで15分間インキュベートします。0.2 mL のフロー バッファを追加します。</li>
		<li>アミン反応性ビーズから正の染色ビーズ(グリーンキャップ)を1滴加え、その後1 μLのライブ/デッド染料を追加して、ライブ/デッド染料用のSCCを作成します。暗闇の中で室温で15分間インキュベートします。アミン反応性ビーズからマイナスビーズ(白キャップ)を1滴追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。</li>
		<li>抗ラットおよび抗ハムスターIgカッパビーズセットから正の染色ビーズ(緑色のキャップ)を1滴加え、続いて1.2 mLの塊茎チューブに記載されている抗体量(表3)を加えて、残りのSCCを作成します。4°Cで15分間インキュベートします。アンチラットとアンチハムスターIgカッパビーズセットからマイナスビーズ(白キャップ)の1滴を追加します。0.2 mL のフロー バッファを追加します。</li>
		<li>渦は完全にすべてのビーズ混合物。SCCは4°Cで3日間保存します。 注:蛍光レポーターマウスのSCCは、染色されていない細胞です。</li>
		<li>SCCを実行する場合、SCCサンプルが同じ検出器チャネル内の細胞のサンプルに対してどの蛍光よりも大きいピークを有するような電圧を設定する。さらに、任意のSCCが、対象チャネルのヒストグラムピークと他のチャンネルとの間に少なくとも0.5のログ差を持たるように電圧を設定する必要があります(図1)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>「低」でサンプルを実行し、イベント/秒を4000以下に抑えます。流量を適切に下げることができない場合は、追加のコールドフローバッファでサンプルを希釈します。カウント計算に必要となるように、追加されたボリュームを記録します (代表結果を参照)。</li>
	<li>サンプルごとに少なくとも 3 x 106 のイベントを収集します。これは、あなたのサイトメーター上のイベントとしてカウントされる顔料顆粒や破片のために細胞数よりも高い可能性があります。</li>
	<li>セクション6.4の適切な格言戦略のために、ライブ/デッド以外の蛍光性マイナス1(FMO)を記録します。FMOは、1つを除くすべてのフルオロフォアで染色されたサンプルです。</li>
	<li>製造元または施設の指示に従ってフローサイトメーターを清掃し、シャットダウンします。</li>
</ol>6. フローサイトメトリーデータのアノテーション
<ol><li>分析ソフトウェアを使用して新しいワークシートを開きます。すべてのサンプルと単色コントロールのサイトメーターからFCSファイルをインポートします。</li>
	<li>SCC を使用して、報酬マトリックスを作成します。</li>
	<li>補正マトリックスを染色したサンプルと MMO に適用します。</li>
	<li>FMOを使用して、ゲートを描画するための正の染色を決定します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Chinnery, H. R., McMenamin, P. G., Dando, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+physiology+in+the+eye.">Macrophage physiology in the eye.</a> Pflugers Archiv: European Journal of Physiology. 469 (3-4), 501-515 (2017).</li><li>Droho, S., Cuda, C. M., Perlman, H., Lavine, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte-Derived+Macrophages+Are+Necessary+for+Beta-Adrenergic+Receptor-Driven+Choroidal+Neovascularization+Inhibition.">Monocyte-Derived Macrophages Are Necessary for Beta-Adrenergic Receptor-Driven Choroidal Neovascularization Inhibition.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 60 (15), 5059-5069 (2019).</li><li>O'Koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+Function+Is+Distinct+in+Different+Anatomical+Locations+during+Retinal+Homeostasis+and+Degeneration.">Microglial Function Is Distinct in Different Anatomical Locations during Retinal Homeostasis and Degeneration.</a> Immunity. 50 (7), 723-727 (2019).</li><li>Kratofil, R. M., Kubes, P., Deniset, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monocyte+Conversion+During+Inflammation+and+Injury.">Monocyte Conversion During Inflammation and Injury.</a> Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 37 (1), 35-42 (2017).</li><li>Zimmermann, H. W., Trautwein, C., Tacke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+role+of+monocytes+and+macrophages+for+the+inflammatory+response+in+acute+liver+injury.">Functional role of monocytes and macrophages for the inflammatory response in acute liver injury.</a> Frontiers in Physiology. 3, 56 (2012).</li><li>Gautier, E. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-expression+profiles+and+transcriptional+regulatory+pathways+that+underlie+the+identity+and+diversity+of+mouse+tissue+macrophages.">Gene-expression profiles and transcriptional regulatory pathways that underlie the identity and diversity of mouse tissue macrophages.</a> Nature Immunology. 13 (11), 1118-1128 (2012).</li><li>Sutti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CX3CR1+Mediates+the+Development+of+Monocyte-Derived+Dendritic+Cells+during+Hepatic+Inflammation.">CX3CR1 Mediates the Development of Monocyte-Derived Dendritic Cells during Hepatic Inflammation.</a> Cells. 8 (9), 1099 (2019).</li><li>Liu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myeloid+Cells+Expressing+VEGF+and+Arginase-1+Following+Uptake+of+Damaged+Retinal+Pigment+Epithelium+Suggests+Potential+Mechanism+That+Drives+the+Onset+of+Choroidal+Angiogenesis+in+Mice.">Myeloid Cells Expressing VEGF and Arginase-1 Following Uptake of Damaged Retinal Pigment Epithelium Suggests Potential Mechanism That Drives the Onset of Choroidal Angiogenesis in Mice.</a> PLoS One. 8 (8), 72935 (2013).</li><li>Satpathy, A. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zbtb46+expression+distinguishes+classical+dendritic+cells+and+their+committed+progenitors+from+other+immune+lineages.">Zbtb46 expression distinguishes classical dendritic cells and their committed progenitors from other immune lineages.</a> The Journal of Experimental Medicine. 209 (6), 1135-1152 (2012).</li><li>Krause, T. A., Alex, A. F., Engel, D. R., Kurts, C., Eter, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF-Production+by+CCR2-Dependent+Macrophages+Contributes+to+Laser-Induced+Choroidal+Neovascularization.">VEGF-Production by CCR2-Dependent Macrophages Contributes to Laser-Induced Choroidal Neovascularization.</a> PLoS One. 9 (4), 94313 (2014).</li><li>Lin, W., Liu, T., Wang, B., Bi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+ocular+dendritic+cells+in+uveitis.">The role of ocular dendritic cells in uveitis.</a> Immunology Letters. 209, 4-10 (2019).</li><li>Ginhoux, F., Schultze, J. L., Murray, P. J., Ochando, J., Biswas, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+multidimensional+concept+of+macrophage+ontogeny,+activation+and+function.">New insights into the multidimensional concept of macrophage ontogeny, activation and function.</a> Nature Immunology. 17 (1), 34-40 (2016).</li><li>O'Koren, E. G., Mathew, R., Saban, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fate+mapping+reveals+that+microglia+and+recruited+monocyte-derived+macrophages+are+definitively+distinguishable+by+phenotype+in+the+retina.">Fate mapping reveals that microglia and recruited monocyte-derived macrophages are definitively distinguishable by phenotype in the retina.</a> Science Reports. 6, 20636 (2016).</li><li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS.">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 113 (12), 1738-1746 (2016).</li><li>M&#252;ller, A., Brandenburg, S., Turkowski, K., M&#252;ller, S., Vajkoczy, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resident+microglia,+and+not+peripheral+macrophages,+are+the+main+source+of+brain+tumor+mononuclear+cells.">Resident microglia, and not peripheral macrophages, are the main source of brain tumor mononuclear cells.</a> International Journal of Cancer. 137 (2), 278-288 (2014).</li><li>McHarg, S., Clark, S. J., Day, A. J., Bishop, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-related+macular+degeneration+and+the+role+of+the+complement+system.">Age-related macular degeneration and the role of the complement system.</a> Molecular Immunology. 67 (1), 43-50 (2015).</li><li>Nozaki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drusen+complement+components+C3a+and+C5a+promote+choroidal+neovascularization.">Drusen complement components C3a and C5a promote choroidal neovascularization.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U.S.A. 103 (7), 2328-2333 (2006).</li><li>Tsutsumi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+critical+role+of+ocular-infiltrating+macrophages+in+the+development+of+choroidal+neovascularization.">The critical role of ocular-infiltrating macrophages in the development of choroidal neovascularization.</a> Journal of Leukocyte Biology. 74 (1), 25-32 (2003).</li><li>Subhi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+CD11b++Monocytes+and+Anti&#8211;Vascular+Endothelial+Growth+Factor+Injections+in+Treatment+of+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration+and+Polypoidal+Choroidal+Vasculopathy.">Association of CD11b +Monocytes and Anti&#8211;Vascular Endothelial Growth Factor Injections in Treatment of Neovascular Age-Related Macular Degeneration and Polypoidal Choroidal Vasculopathy.</a> JAMA Ophthalmology. 137 (5), 515-518 (2019).</li><li>Singh, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+Expression+of+CD46+and+CD59+on+Leukocytes+in+Neovascular+Age-Related+Macular+Degeneration.">Altered Expression of CD46 and CD59 on Leukocytes in Neovascular Age-Related Macular Degeneration.</a> AJOPHT. 154 (1), 193-199 (2012).</li><li>Kwak, N., Okamoto, N., Wood, J. M., Campochiaro, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=VEGF+is+major+stimulator+in+model+of+choroidal+neovascularization.">VEGF is major stimulator in model of choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 41 (10), 3158-3164 (2000).</li><li>Shah, R. S., Soetikno, B. T., Lajko, M., Fawzi, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mouse+Model+for+Laser-induced+Choroidal+Neovascularization.">A Mouse Model for Laser-induced Choroidal Neovascularization.</a> Journal of Visualized Experiments. (106), e53502 (2015).</li><li>Mahajan, V. B., Skeie, J. M., Assefnia, A. H., Mahajan, M., Tsang, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Eye+Enucleation+for+Remote+High-throughput+Phenotyping.">Mouse Eye Enucleation for Remote High-throughput Phenotyping.</a> Journal of Visualized Experiments. (57), e3814 (2011).</li><li>Makinde, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Novel+Microglia-Specific+Transcriptional+Signature+Correlates+with+Behavioral+Deficits+in+Neuropsychiatric+Lupus.">A Novel Microglia-Specific Transcriptional Signature Correlates with Behavioral Deficits in Neuropsychiatric Lupus.</a> Frontiers in Immunology. 11, 338-419 (2020).</li><li>Sakurai, E., Anand, A., Ambati, B. K., van Rooijen, N., Ambati, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+depletion+inhibits+experimental+choroidal+neovascularization.">Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization.</a> Investigative Ophthalmology &amp; Visual Science. 44 (8), 3578-3585 (2003).</li><li>Murray, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+activation+and+polarization:+nomenclature+and+experimental+guidelines.">Macrophage activation and polarization: nomenclature and experimental guidelines.</a> Immunity. 41 (1), 14-20 (2014).</li><li>Liyanage, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+cytometric+analysis+of+inflammatory+and+resident+myeloid+populations+in+mouse+ocular+inflammatory+models.">Flow cytometric analysis of inflammatory and resident myeloid populations in mouse ocular inflammatory models.</a> Experimental Eye Research. 151, 160-170 (2016).</li><li>Schmutz, S., Valente, M., Cumano, A., Novault, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Cell+Suspensions+Isolated+from+Solid+Tissues+by+Spectral+Flow+Cytometry.">Analysis of Cell Suspensions Isolated from Solid Tissues by Spectral Flow Cytometry.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55578 (2017).</li></ol>

著者らは開示するものは何もない。

マルチパラメータフローサイトメトリーは、複雑な組織における複数の細胞タイプの定量分析を可能にします。本報告では、マウス眼でのレーザー損傷後の単球、樹状細胞、マクロファージサブセットを含む単核食細胞集団のフローサイトメトリック検出について述べた。Liyanageらは最近、好中球、好酸球、リンパ球、DC、マクロファージ、マクロファージ、および単球27を?...

自然免疫系には、補体の活性化および炎症を刺激する複数の細胞タイプが含まれる。自然免疫細胞には、ナチュラルキラー(NK)細胞、肥満細胞、好塩基球、好酸球、好中球、および単核食細胞が含まれる。単球、マクロファージ、樹状細胞からなる単核食細胞は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症(AMD)1を含む複数の眼科病態の病態生理に関与している。このプロトコルでは、新血管AMD2のマウスモデルにおける多パラメータフローサイトメトリック解析を用いた単核食細胞の同定に焦点を当てる。このプロトコルは、糖尿病性網膜症および/またはuveitisのマウスモデルに適応可能であるが、これらの疾患の全身的な性質のために、より広範な眼解剖が推奨される。
単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現する。長期にわたる組織居住マクロファージおよびミクログリアは、黄身嚢由来のエリスロメロイド前駆体3に由来し、一方、マクロファージおよび樹状細胞を骨髄由来のマクロファージ樹状細胞前駆細胞4から分化した。単球に共通するマウス細胞表面マーカーは、マクロファージ、および樹状細胞、CD45、CD11b5、F4/806、Cx3cr17、および細胞内マーカーIba1 8を含む。この課題を克服するために、複数の組織からマクロファージ、単球、および樹状細胞のトランスクリプトーム解析は、CD64をマクロファージ特異的細胞表面マーカー6と定義する。マクロファージは、虹彩、脈絡膜、毛様体、及び健康眼における視神経3に記載されている。あるいは、樹状細胞の識別がより困難である。樹状細胞同定の最も具体的な方法は、Zbtb46-GFPレポーターマウス9を使用して運命マッピングを必要とします。このレポーターラインとは無関係に、CD64の存在と併せてCD11cおよびMHCIIの発現は、潜在的な樹状細胞6,10を同定することができる。樹状細胞は正常眼11において角膜、結膜、虹彩、および脈絡膜で同定されている。ミクログリアは、そのレチナに位置する特殊なマクロファージであり、血液-腎障害によって保護され、黄身嚢前駆細胞12に由来する。その結果、レチナルミクログリアは、CD45発現13のそれらの薄暗いレベルと高レベルのTmem119によって単球由来マクロファージと区別することができ、これはフローサイトメトリー抗体14として利用可能である。しかし、ミクログリアの活性化時には、CD45はアップレギュレーション15、Tmem119はダウンレギュレート3となり、ミクログリア生物学の複雑さを示し、AMDとそのマウスモデルの両方に関連する可能性があります。最後に、単球は、古典と非古典的を含む少なくとも2つのサブタイプに分けることができます。古典的な単球ディスプレイCCR2+Ly6C高CX3CR1低発現、および非古典的単球はCCR2-Ly6C低CX3CR1ハイマーカー5を実証する。
マーカー発現の定量的分析、すなわち、高いレベルと低/薄暗いレベルの必要性により、多パラメータフローサイトメトリーは、眼および他の組織における単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞間の識別に理想的な方法である。その他の利点としては、サブ集団の同定、蛍光活性化細胞分類(FACS)を使用して、転写またはプロテオミクス解析のために細胞集団を分類する能力、および運命マッピングが含まれる。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な欠点は、組織アーキテクチャの欠如です。これは、角膜、結膜、虹彩、レンズ、失膜、および脈絡膜-スクレラ複合体:様々な眼部区画への眼圧解剖によって克服することができる。さらに、確認免疫蛍光イメージングを行うことができますが、マーカーの数と堅牢な定量の欠如によって制限されます。
ゲノムワイド関連研究は、複数の補体遺伝子をAMD16と結合している。補体活性化はアナフィラトキシン産生、白血球のリクルート、および結果として生じる炎症をもたらす。補体受容体欠損マウスにおいて、レーザー傷害は、単核食細胞の動員およびレーザー誘導脈絡膜新血管化(CNV)領域17を減少させる。同様に、C-Cモチーフケモカイン受容体2(CCR2)ノックアウトマウスは、組織への単球募集に欠損しており、単核食細胞のリクルートとレーザー誘導CNV領域18の両方を示す。これらのデータは、実験的CNVおよびおそらく新血管AMDを有する単核食細胞を補完する。この関連を支持して、補体受容体は、新血管AMD19,20の患者において末梢血単球に対して調節不全である。これらのデータは、AMDと単核食細胞との間の強い関連を示す。
本稿では、実験レーザー誘導CNVモデルを用いて、マルチパラメータフローサイトメトリーを用いてマウスアイ中の単核食細胞集団を特徴付ける。レーザー誘導CNVは、新血管AMDの標準的なマウスモデルであり、現在の第1線新幹線AMD療法21の有効性を実証した。このプロトコルは、マウスの目の核形成、眼解剖、単一細胞懸濁液への消化、抗体染色、単色制御を用いたレーザー電圧の決定、および蛍光マイナス1(FMO)制御を用いた測定戦略について説明する。レーザー誘発CNVモデルの詳細な説明については、前の出版物22を参照してください。このプロトコルを用いて、ミクログリア、単球、樹状細胞、マクロファージ集団を定義する。さらに、MHCIIとCD11cを用いて、レーザー誘導CNVモデル内のマクロファージサブセットをさらに定義します。

<table><tbody><tr><td>0.6 ml microcentrifuge tubes</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-120</td><td></td></tr><tr><td>1.7 ml microcentrifuge tubes</td><td>Costar</td><td>3620</td><td></td></tr><tr><td>10 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431031</td><td></td></tr><tr><td>15 ml conicals</td><td>ThermoFisher</td><td>339650</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>2.5 ml syringe</td><td>Henke Sass Wolf</td><td>7886-1</td><td></td></tr><tr><td>20% paraformaldehyde solution</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15713-S</td><td></td></tr><tr><td>25 ml pipettes</td><td>Fisher Scientific</td><td>431032</td><td></td></tr><tr><td>30 G needle</td><td>Exel</td><td>26437</td><td></td></tr><tr><td>3ml luer lock syringe</td><td>Fisher Scientific</td><td>14955457</td><td></td></tr><tr><td>41 x 41 x 8 mm polystyrene weigh dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-732-112</td><td></td></tr><tr><td>50 ml conicals</td><td>Falcon</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96-well, U-bottom assay plate without lid</td><td>Falcon</td><td>353910</td><td></td></tr><tr><td>Amine reactive beads</td><td>ThermoFisher</td><td>A10628</td><td></td></tr><tr><td>Analysis software</td><td>FlowJo</td><td>v 10</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rat and anti-hamster Ig kappa bead set</td><td>BD Biosciences</td><td>552845</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>664</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter</td><td>Invitrogen</td><td>AMQAX1000</td><td></td></tr><tr><td>Cell counter slides</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>Compensation beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1111-42</td><td></td></tr><tr><td>Count beads</td><td>ThermoFisher</td><td>01-1234-42</td><td></td></tr><tr><td>Curved forceps</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-123</td><td></td></tr><tr><td>Digestion enzyme</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401020001</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting microscope</td><td>National Optical and Scientific Instruments, Inc.</td><td>DC3-420T</td><td></td></tr><tr><td>Dissociation tubes</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Electronic dissociator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-095-937</td><td></td></tr><tr><td>FACS Diva software</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fc block, rat anti-mouse CD16/CD32</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td></td></tr><tr><td>Fine forceps</td><td>Integra Miltex</td><td>17035X</td><td></td></tr><tr><td>Flow buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flow tubes</td><td>Falcon</td><td>352008</td><td></td></tr><tr><td>Hamster anti-mouse CD11c BV421</td><td>BD Biosciences</td><td>562782</td><td></td></tr><tr><td>Ice bucket</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-123</td><td></td></tr><tr><td>Live/Dead dye</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0866-14</td><td></td></tr><tr><td>Lysing solution, 10x solution</td><td>BD Biosciences</td><td>555899</td><td></td></tr><tr><td>Micro titer tube and rack</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-681-380</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse CD64 PE</td><td>BioLegend</td><td>139304</td><td></td></tr><tr><td>Mouse anti-mouse NK1.1 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562864</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2404</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10006M</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipet tips</td><td>eppendorf</td><td>22491806</td><td></td></tr><tr><td>P2 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10001M</td><td></td></tr><tr><td>P20 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10003M</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipet tips</td><td>Denville Scientific</td><td>P2401</td><td></td></tr><tr><td>P200 pipettor</td><td>Gilson</td><td>FA10005M</td><td></td></tr><tr><td>Pipet man</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB14955202</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse B220 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562313</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD11b APC-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>557657</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 AlexaFluor 700</td><td>BD Biosciences</td><td>557958</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD19 PE</td><td>BD Biosciences</td><td>553786</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD4 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562314</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 FITC</td><td>ThermoFisher</td><td>11-0451-82</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD45 PE-Cy7</td><td>BD Biosciences</td><td>552848</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse CD8 PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562315</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6C</td><td>BD Biosciences</td><td>561085</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Ly6G PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562700</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse MHC II AlexaFluor 700</td><td>BioLegend</td><td>107622</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Siglec F PECF594</td><td>BD Biosciences</td><td>562757</td><td></td></tr><tr><td>Rat anti-mouse Tim4 AlexaFluor647</td><td>BD Biosciences</td><td>564178</td><td></td></tr><tr><td>Shaking incubator</td><td>Labnet</td><td>311DS</td><td></td></tr><tr><td>Spring scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15024-10</td><td></td></tr><tr><td>Sterile cell strainer, 40 mm nylon mesh</td><td>Fisher Scientific</td><td>22363547</td><td></td></tr><tr><td>Sterile water, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A12873-01</td><td></td></tr><tr><td>Swinging bucket centrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5910 R</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue, 0.4% solution</td><td>Gibco</td><td>15250061</td><td></td></tr></tbody></table>

digestion of whole mouse eyes for multi-parameter flow cytometric analysis of mononuclear phagocytes

自然免疫系は、ブドウ膜炎、糖尿病性網膜症、加齢黄斑変性症を含む眼部病態生理学において重要な役割を果たしている。自然免疫細胞、特に単核食細胞は、重なり合う細胞表面マーカーを発現し、これらの集団を同定することが課題となる。マルチパラメータフローサイトメトリーは、マウス目の単球、マクロファージ、ミクログリア、樹状細胞を区別するために、複数の細胞表面マーカーの同時定量分析を可能にします。このプロトコルは、マウスの目全体の核分裂、眼圧解剖、単一細胞懸濁液への消化、および骨髄細胞マーカーに対する単一細胞懸濁液の染色について説明する。また、単色制御を用いて電圧を決定する方法や、蛍光から1つの制御を使用して正のゲートを引いた正のゲートを引いたものを解法するための適切な方法を説明します。マルチパラメータフローサイトメトリーの主な制限は、組織アーキテクチャの欠如です。この制限は、個々の眼区画のマルチパラメータフローサイトメトリーまたは無料の免疫蛍光染色によって克服することができる。しかし、免疫蛍光は、定量分析の欠如とほとんどの顕微鏡の蛍光体の数の減少によって制限されます。レーザー誘導脈絡膜新血管化における単核食細胞の定量的分析を提供するマルチパラメトリックフローサイトメトリーの使用について述べた。さらに、マルチパラメータフローサイトメトリーは、マクロファージサブセットの同定、運命マッピング、およびトランスクリプトームまたはプロテオミクス研究のための細胞分類に使用することができる。

図1 は、赤レーザーのSCCとセルの無補償周波数ヒストグラムを示しました:Alexa647、Alexa700、およびAPC-Cy7。 図1Aでは、マゼンタ線はAlexa647のSCCのピークを表し、シアンラインは意図された0.5ログの違いを示しました。Alexa700とAPC-Cy7のピークはシアンラインの左(明るさが低い)であることに注意してください。また、セルはすべてマゼンタラインの左側?...

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Digestion of Whole Mouse Eyes for Multi-Parameter Flow Cytometric Analysis of Mononuclear Phagocytes

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。

The innate immune system plays important roles in ocular pathophysiology including uveitis, diabetic retinopathy, and age-related macular degeneration. ...

digestion-whole-mouse-eyes-for-multi-parameter-flow-cytometric

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

4.8K ビュー.  Northwestern University. このプロトコルは、単球、ミクログリア、マクロファージ、樹状細胞を含む特定の眼単核貪食集団を同定するために、多パラメータフローサイトメトリック分析を目的として、目全体を単一細胞懸濁液に消化する方法を提供する。

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Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

Angiogenesis is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting of new blood vessels from a pre-existing vessel network. Angiogenesis plays a key role not only in normal development of organs and tissues, but also in many diseases in which blood vessel formation is dysregulated, such as cancer, blindness and ischemic diseases. In adult life, blood vessels are generally quiescent so angiogenesis is an important target for novel drug development to try and regulate new vessel formation specifically in disease. In order to better understand angiogenesis and to develop appropriate strategies to regulate it, models are required that accurately reflect the different biological steps that are involved. The mouse neonatal retina provides an excellent model of angiogenesis because arteries, veins and capillaries develop to form a vascular plexus during the first week after birth. This model also has the advantage of having a two-dimensional (2D) structure making analysis straightforward compared with the complex 3D anatomy of other vascular networks. By analyzing the retinal vascular plexus at different times after birth, it is possible to observe the various stages of angiogenesis under the microscope. This article demonstrates a straightforward procedure for analyzing the vasculature of a mouse retina using fluorescent staining with isolectin and vascular specific antibodies.

Whole Mount Immunofluorescent Staining of the Neonatal Mouse Retina to Investigate Angiogenesis In vivo

The neonatal murine retina provides a well characterized physiological model of angiogenesis, which permits investigations of the roles of different genes or drugs that modulate angiogenesis in an in vivo context. Immunofluorescent staining to accurately visualize the vascular plexus is pivotal to the success of these types of studies.

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色<em生体内で&gt;</em

Angiogenesis  is the complex process of new blood vessel formation defined by the sprouting  of new blood vessels from a pre-existing vessel network. ...

神経科学

An Engulfment Assay: A Protocol to Assess Interactions Between CNS Phagocytes and Neurons

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and subsequently digests this material, commonly through lysosomal degradation. Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) whose phagocytic function has been described in a broad range of conditions from neurodegenerative disease (e.g., beta-amyloid clearance in Alzheimer&#8217;s disease) to development of the healthy brain (e.g., synaptic pruning)1-6. The following protocol is an engulfment assay developed to visualize and quantify microglia-mediated engulfment of presynaptic inputs in the developing mouse retinogeniculate system7. While this assay was used to assess microglia function in this particular context, a similar approach may be used to assess other phagocytes throughout the brain (e.g., astrocytes) and the rest of the body (e.g., peripheral macrophages) as well as other contexts in which synaptic remodeling occurs (e.g. ,brain injury/disease).

Microglia are the resident immune cells of the central nervous system (CNS) with a high capacity to phagocytose or engulf material in their extracellular environment. Here, a broadly applicable, reliable, and highly quantitative assay for visualizing and measuring microglia-mediated engulfment of synaptic components is described.

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

Phagocytosis is a process in which a cell engulfs material (entire cell, parts of a cell, debris, etc.) in its surrounding extracellular environment and ...

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, including phagocytosis of damaged synapses or cells, debris, and/or invading pathogens. Impaired phagocytic function has been implicated in the pathogenesis of diseases such as Alzheimer's and age-related macular degeneration, where amyloid-&#946; plaque and drusen accumulate, respectively. Despite its importance, microglial phagocytosis has been challenging to assess in vivo. Here, we describe a simple, yet robust, technique for precisely monitoring and quantifying the in vivo phagocytic potential of retinal microglia. Previous methods have relied on immunohistochemical staining and imaging techniques. Our method uses flow cytometry to measure microglial uptake of fluorescently labeled particles after intravitreal delivery to the eye in live rodents. This method replaces conventional practices that involve laborious tissue sectioning, immunostaining, and imaging, allowing for more precise quantification of microglia phagocytic function in just under six hours. This procedure can also be adapted to test how various compounds alter microglial phagocytosis in physiological settings. While this technique was developed in the eye, its use is not limited to vision research.

Assessing Retinal Microglial Phagocytic Function In Vivo Using a Flow Cytometry-based Assay

Microglial phagocytosis is critical for the maintenance of tissue homeostasis and inadequate phagocytic function has been implicated in pathology. However, assessing microglia function in vivo is technically challenging. We have developed a simple but robust technique for precisely monitoring and quantifying the phagocytic potential of microglia in a physiological setting.

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します<em&gt;インビボ</em&gt;フローサイトメトリーベースのアッセイを使用しました

Microglia are the tissue resident macrophages of the central nervous system (CNS) and they perform a variety of functions that support CNS homeostasis, ...

免疫・感染学

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main macrophage populations in the CNS: (i) the microglia, which are the resident macrophages of the CNS and are derived from yolk sac progenitors during embryogenesis, and (ii) the monocyte-derived macrophages (MDM), which can infiltrate the CNS during disease and are derived from bone marrow progenitors. The roles of each macrophage subpopulation differ depending on the pathology being studied. Furthermore, there is no consensus on the histological markers or the distinguishing criteria used for these macrophage subpopulations. However, the analysis of the expression profiles of the CD11b and CD45 markers by flow cytometry allows us to distinguish the microglia (CD11b+CD45med) from the MDM (CD11b+CD45high). In this protocol, we show that the density gradient centrifugation and the flow cytometry analysis can be used to characterize these CNS macrophage subpopulations, and to study several markers of interest expressed by these cells as we recently published. Thus, this technique can further our understanding of the role of macrophages in mouse models of neurological diseases and can also be used to evaluate drug effects on these cells.

This protocol provides an analysis of the macrophage subpopulations in the adult mouse central nervous system by flow cytometry and is helpful for the study of multiple markers expressed by these cells.

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and temporal specificity2. Chemotaxis is a critical function of lymphocytes and other immune cells that can be quantitatively assessed in vitro. This manuscript describes methods that permit the evaluation of chemotaxis, both in vitro and in vivo, for diverse cell types including cell lines and native cells. The in vitro, plate-based format permits the comparison of several conditions simultaneously in real-time, and can be completed within 1-4 h. In vitro assay conditions can be manipulated to introduce agonists and antagonists, as well as differentiate chemotaxis from chemokinesis, which is random movement. For in vivo trafficking assessments, immune cells can be labeled with multiple fluorescent dyes and used for adoptive transfer. The differential labeling of cells allows for mixed cell populations to be introduced into the same animal, thereby decreasing variance and reducing the number of animals required for an adequately powered experiment. Migration into lymphoid tissue occurs in as little as 1 h, and multiple tissue compartments can be sampled. Flow cytometry following tissue harvest allows for a rapid and quantitative analysis of the migratory patterns of multiple cell types.

Quantifying Human Monocyte Chemotaxis In Vitro and Murine Lymphocyte Trafficking In Vivo

Protocols for quantitative assessment of lymphocyte chemotaxis and migration are important tools for immunology research. Here, an in vitro protocol is described that permits real-time, multiplexed evaluation of cell migration, as well as a complementary in vivo technique enabling tracking of native cells to spleen.

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

Chemotaxis is migration along a specific chemical gradient1. Chemokines are chemotactic cytokines that promote cellular trafficking with anatomic and ...

Retinal Pericytes Visualization Using Tissue-Clearing and Fluorescent Labeling

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal vasculature. To provide a detailed view of the morphological characteristics of pericytes, this study described a new approach combining the retro-orbital injection of a fluorescent agent, immunofluorescent-staining, and tissue-clearing treatment. Firstly, the fluorescent tomato lectin was injected into the retro-orbital sinus of the live mouse to label the retinal vasculature. After 5 min, the mouse was sacrificed, and its intact retina was carefully removed from the retinal cup and immunofluorescently stained with platelet-derived growth factor receptor &#946; to reveal the pericytes. Additionally, the stained retina was treated with tissue-clearing reagent and whole mounted on the microscope slide. Through these approaches, the retinal vasculature and pericytes were clearly observed in the transparent retina. Under a confocal microscope, we obtained more opportunities to take high-resolution images for further reconstructing and analyzing the morphological characteristics of pericytes along the retinal vascular tree in a three-dimensional view. Methodologically, this protocol offers an effective approach for visualizing pericytes within the retinal vasculature, providing valuable insights into their role under both physiological and pathological conditions.

The pericytes in retinal vasculature were examined by immunofluorescent staining with platelet-derived growth factor receptor &#946; after retro-orbital injection of fluorescent tomato lectin. The labeled retina was further treated with the tissue-clearing method and whole mounted for visualizing the three-dimensional views of pericytes surrounding retinal vasculature under a confocal microscope.

Retinal pericytes are essential for vascular development and stability of the retina, playing a key role in maintaining the integrity of the retinal ...

生化学

Time-lapse 3D Imaging of Phagocytosis by Mouse Macrophages

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of the actin cytoskeleton to capture, envelop and engulf large particles. Although phagocytic receptors, downstream signaling pathways, and effectors, such as Rho GTPases, have been identified, the dynamic cytoskeletal remodeling of specific receptor-mediated phagocytic events remain unclear. Four decades ago, two distinct mechanisms of phagocytosis, exemplified by Fc&#947; receptor (Fc&#947;R)- and complement receptor (CR)-mediated phagocytosis, were identified using scanning electron microscopy. Binding of immunoglobulin G (IgG)-opsonized particles to Fc&#947;Rs triggers the protrusion of thin membrane extensions, which initially form a so-called phagocytic cup around the particle before it becomes completely enclosed and retracted into the cell. In contrast, complement opsonized particles appear to sink into the phagocyte following binding to complement receptors. These two modes of phagocytosis, phagocytic cup formation and sinking in, have become well established in the literature. However, the distinctions between the two modes have become blurred by reports that complement receptor-mediated phagocytosis may induce various membrane protrusions. With the availability of high resolution imaging techniques, phagocytosis assays are required that allow real-time 3D (three dimensional) visualization of how specific phagocytic receptors mediate the uptake of individual particles. More commonly used approaches for the study of phagocytosis, such as end-point assays, miss the opportunity to understand what is happening at the interface of particles and phagocytes. Here we describe phagocytic assays, using time-lapse spinning disk confocal microscopy, that allow 3D imaging of single phagocytic events. In addition, we describe assays to unambiguously image Fc&#947; receptor- or complement receptor-mediated phagocytosis.

Here we describe methods using spinning disk confocal microscopy to image single phagocytic events by mouse resident peritoneal macrophages. The protocols can be extended to other phagocytic cells.

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

Phagocytosis plays a key role in host defense, as well as in tissue development and maintenance, and involves rapid, receptor-mediated rearrangements of ...

Digestion of the Murine Liver for a Flow Cytometric Analysis of Lymphatic Endothelial Cells

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the lymph nodes where cellular debris and antigens can be surveyed. We are very interested in understanding how the lymphatic vasculature might be involved in inflammation and immune cell function within the liver. However, very little has been published establishing digestion protocols for the isolation of lymphatic endothelial cells (LECs) from the liver or specific markers that can be used to evaluate liver LECs on a per cell basis. Therefore, we optimized a method for the digestion and staining of the liver in order to evaluate the LEC population in the liver. We are confident that the method outlined here will be useful for the identification and isolation of LECs from the liver and will strengthen our understanding of how LECs respond to the liver microenvironment.

The goal of this protocol is to identify lymphatic endothelial cell populations within the liver using described markers. We utilize collagenase IV and DNase and a gentle mincing of tissue, combined with flow cytometry, to identify a distinct population of lymphatic endothelial cells.

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

Within the liver, lymphatic vessels are found within the portal triad, and their described function is to remove interstitial fluid from the liver to the ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウスホールマウント網膜におけるRGCの免疫染色とAIベースのカウント

Whole-Mount Immunostaining and Automatic Counting of Mouse Retinal Ganglion Cells

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve as valuable animal models for studying the pathogenesis and treatment of glaucoma due to their relatively homogenous genetic background and retinal ganglion cells (RGCs), which structurally resemble those in humans. Accurate assessment of RGC damage and treatment outcomes in mouse glaucoma models requires determining the RGC number across the entire retina. This protocol outlines a comprehensive method involving the isolation of the whole retina, labeling RGCs with specific antibodies, and rapid, accurate automatic counting of RGCs using an AI-based program. The streamlined approach allows for efficient and precise quantification of RGC numbers in mouse retinas, facilitating the evaluation of RGC degeneration and potential therapeutic interventions. By enabling researchers to assess the extent of RGC damage, this protocol contributes to a deeper understanding of glaucoma pathogenesis and aids in developing effective treatment strategies to manage and prevent vision loss.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:治療評価のための緑内障マウスモデルにおける効率的な網膜神経節細胞カウント

This protocol describes the procedure for isolating the whole-mount mouse retina and performing immunostaining to label all retinal ganglion cells (RGCs). The process is followed by imaging and automatically counting RGCs using AI-based software, providing a simple, fast, and accurate method for quantifying RGCs in the entire mouse retina.

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

Glaucoma is a leading cause of blindness globally, characterized by a complex pathogenic mechanism that makes vision restoration challenging. Mice serve ...

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

要約

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この動画の章

血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

単核食細胞の多パラメータフローサイトメトリック解析のためのマウス全体の眼の消化

要約

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血管新生を調査するために新生児マウス網膜の全体のマウント免疫蛍光染色

貪食アッセイ：CNS食細胞と神経細胞間の相互作用を評価するためのプロトコル

網膜ミクログリアの貪食機能を評価します

フローサイトメトリーによる中枢神経系からのミクログリアおよび単球由来マクロファージの解析

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウス リンパ球の定量化

3D Visualization of Retinal Vascular Pericytes in Mice by Immunostaining

マウスのマクロファージによる貪食のコマ撮りの 3 D イメージング

リンパ管内皮細胞のフローサイトのマウス肝臓の消化

緑色蛍光タンパク質-表現する拡張を使用するマウス腹腔マクロファージの貪食能を評価するために大腸菌

マウス網膜神経節細胞のホールマウント免疫染色および自動計数(英語)

ひと単球走化性の in VitroおよびIn Vivoマウスリンパ球の定量化