この方法は、大腸創傷治癒および損傷後に起こる分子および組織学的変化を研究するための理想的なアプローチを提供する。この方法はまた、IBDの病因に光を当てることができます。この技術の主な利点は、傷害の位置と創傷治癒プロセスのタイミングを正確に制御することです。
この方法を初めて行う個人は、マウスの結腸に大腸内視鏡を挿入し、一貫した創傷を作成することが困難である可能性があります。これらの技術を繰り返し練習することは、これらの問題を克服する必要があります。この手順に関連する複数の手順とニュアンスを考えると、このメソッドの視覚的なデモンストレーションは重要です。
処置を始める前に、1.9ミリメートルの硬質ボア内視鏡を内視鏡の鞘に挿入する。そして、組み立てた内視鏡を、メーカーの指示に従って光源とビデオイメージングデバイスに取り付けます。提供されたチューブを使用して、作業チャネルの横にあるシースの左側のガスバルブにエアポンプを取り付けます。
作業チャネルがオープン位置にあることを確認し、作業チャネルを介して3つのフランスの生検鉗子を挿入します。鞘から突き出さずに、鉗子をシースの端まで進めます。次に、麻酔マウスを腹側の内視鏡的ステージングプラットフォームに置き、ペダル反射への応答の欠如によって適切なレベルのセドレーションを確認します。
眼軟膏を塗布した後、3ミリリットルの注射器に、取り付けられたラットギャベージ針を室温PBSで充填する。そして、針をマウスのアヌスに約1センチ挿入します。便の材料が取り除かれるまでPBSを穏やかに注入する。
いくつかの便ペレットは、注入されたPBSと一緒にマウスを出る必要があります。組み立てた内視鏡を0.5センチメートルをアヌスに挿入し、鉗子の完全な顎が鞘の端を越えるまで、直腸のクリアされた内腔に生検鉗子を進める。鉗子を90度回して、顎が東西方向に開き、先端を開き、鉗子を約1センチメートル進め、鉗子を1つの滑らかで素早く引き込んで生検を収穫するようにします。
生検を行っている間に結腸を完全に膨らまないように、ガス弁の右側を開いたままにしておきます。生検直後、大腸内視鏡記録装置に取り付けられたフットペダルを押し下げ、ビデオ記録を開始する。そして、ガスバルブの右側に人差し指をしっかりと押し付けて開口部を完全に覆い、内視鏡に空気を押し込み、ひもで結腸に空気を押し込みます。
閉じた位置にある間、鉗子を鞘から後方に引き戻し、直腸内腔に入れ替え。そして、顎の基部が視野の上端に揃えられるまで、直腸壁に対して巻のすぐ上に鉗子を置きます。創傷の明確なビューが観察されるまで、結腸を完全に拡大し続けます。
創傷床の最良の測定を得るために、忍耐強く、傷のベッドのあなたの最高のイメージを得るように正確な角度で大腸内視鏡を置く。適切なソフトウェアプログラムでビデオを開き、傷のベッドを簡単に視覚化できる時点を示すフレームにビデオを進めます。そして、閉じた鉗子が創傷床の上にあり、直腸壁に対して、そして壁が緊張している。
各時点で、このフレームのスナップショットを取得し、ファイル名をコーディングして、傷のベッドの測定がブラインドで行われるようにします。創傷床のサイズを定量化するには、ImageJ で画像を開き、フリーハンド選択ツールを使用して、傷の周囲に周囲を描画します。[分析] で、[測定] を選択します。
その測定値の値は、[結果] ウィンドウに自動的に入力されます。すべての測定値が取得されたら、スプレッドシートのゼロ日のサイズを基準に、その後の日の巻き上がりのサイズを計算します。適切な実験エンドポイントで、皮膚および腹筋層を開いて実験動物の体腔を露出させ、結腸の下に閉じた鉗子を置く。
穏やかに下層の腸間から解放するために結腸を持ち上げ、マウスからそれを収集するために、その中間点とアヌスで組織を切断します。氷冷PBSで満たされ、便の内容物を洗い流すためにラットガベージ針を装備した20ミリリットルの注射器を使用してください。そして、クリアしたコロンをフィルターペーパーの上に置きます。
結腸側が濾紙に対して下向きになっていることを注意して、結腸を縦方向に開きます。そして、パスツールピペットを使用して、粘膜を0.2%メチレンブルーで覆います。数秒後、余分な汚れを排出し、解剖顕微鏡の下で結腸を見て、創傷床を見つけます。
4インチのマイクロアイリスはさみを使用してベッドの端を切り回し、筋肉層に切り込まないように注意してください。そして、細かい点ピンセットを使用して、解剖された組織をチューブに移して凍結および貯蔵をスナップします。適切な実験エンドポイントで、収穫した結腸を濾紙の一部に縦方向に開け、腸間膜側を下にして下に置く。
そっとあなたの好みの固定剤で組織をカバーします。70%エタノールに貯蔵する前に4〜6時間密封された容器の中にパラフィルムで組織を覆う。処理の日に、パラフィルムを取り除き、示されるように、組織に0.2%メチレンブルーを加えます。
過剰な汚れを排出した後、組織を解剖顕微鏡の下に置き、創傷床を見つける。10本の刃を持つメスを使用して、創傷床の中央を直接切断し、結腸の残りの部分を直線で切断し続け、結腸を半分の縦に切断する。凍結切断のために、メスによって切断された側が組織凍結培地で半分充填されたベースモールドに下向きになるように結腸片を埋め込む。
細かいピンセットで所定の位置に組織を固定し、凍結媒体を硬化させるために、金属板または厚いアルミ箔の上にベースモールドを置きます。培地の底部が凍結したら、基材の残量を室温で凍結媒体で満たします。そして、組織ブロック全体が凍結するまで、金型をドライアイスに戻します。
その後、切断するまで80°Cの冷凍庫に金型を移します。ここでは、創傷床のサイズと創傷の閉鎖率を正確に定量するための創傷床の許容可能な図の代表的な画像が示されている。創傷床のこの元生体外図では、創傷床の周囲の指標と、断面時に創傷床の視覚化を可能にするために組織を切断する場所が観察される。
この代表的な画像では、創傷床のHおよびE染色部が明確に観察できる。創傷治癒率の正確な評価を確実にするために、すべての時間ポイントで創傷床のインスタント画像を取得することが重要です。ピンチ生検に続いて、目的の異なる薬剤を創傷床に注入して創傷治癒率に及ぼす影響を試験することができる。
