Diese Methode bietet einen idealen Ansatz für die Untersuchung der Darmwundheilung und der molekularen und histologischen Veränderungen, die nach Verletzungen auftreten. Diese Methode kann auch Licht auf IBD Pathogenese werfen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, den Ort der Verletzung und den Zeitpunkt des Wundheilungsprozesses genau zu steuern.
Personen, die diese Methode zum ersten Mal durchführen, können Schwierigkeiten haben, das Kolonoskop in den Doppelpunkt der Maus einzufügen und konsistente Wunden zu erzeugen. Das wiederholte Üben dieser Techniken sollte diese Probleme lösen. Angesichts der mehrfach koordinierten Schritte und Nuancen, die mit diesem Verfahren verbunden sind, ist die visuelle Demonstration dieser Methode von entscheidender Bedeutung.
Bevor Sie mit dem Verfahren beginnen, legen Sie ein 1,9 Millimeter starres Lochendoskop in eine Endoskophülle ein. Und befestigen Sie das montierte Endoskop gemäß den Anweisungen des Herstellers an der Lichtquelle und dem Video-Imaging-Gerät. Verwenden Sie die mitgelieferten Schläuche, um die Luftpumpe am Gasventil auf der linken Seite des Mantels neben dem Arbeitskanal zu befestigen.
Stellen Sie sicher, dass sich der Arbeitskanal in der offenen Position befindet, und legen Sie drei französische Biopsiezangen durch den Arbeitskanal. Fördern Sie die Zange bis zum Ende des Mantels, ohne aus dem Mantel herauszuragen. Als nächstes legen Sie die anästhesierte Maus auf eine endoskopische Staging-Plattform auf ihrer ventralen Seite und bestätigen Sie das entsprechende Maß an Sedierung durch mangelnde Reaktion auf Pedalreflex.
Nach dem Auftragen der Augensalbe eine Drei-Milliliter-Spritze mit einer beigefügten Rattengavagenadel mit Raumtemperatur PBS füllen. Und legen Sie die Nadel etwa einen Zentimeter in den Anus der Maus. Befestig vorsichtig mit PBS einrühren, bis das Fäkalienmaterial gelöscht ist.
Mehrere Fäkalienpellets sollten die Maus zusammen mit dem PBS verlassen, das infundiert wurde. Setzen Sie das montierte Endoskop 0,5 Zentimeter in den Anus ein und leiten Sie die Biopsiezangen in das gereinigte Lumen des Rektums, bis die vollen Backen der Zange über das Ende der Hülle hinausgehen. Drehen Sie die Zange um 90 Grad, so dass sich die Backen in Ost-West-Ausrichtung öffnen und die Spitzen öffnen und die Zange etwa einen Zentimeter voranbringen, und schließen und ziehen Sie die Zange in einer glatten, schnellen Bewegung, um die Biopsie zu ernten.
Um zu vermeiden, dass der Dickdarm während der Biopsie vollständig aufgeblasen wird, lassen Sie die rechte Seite des Gasventils offen. Unmittelbar nach der Biopsie drücken Sie das am Kolonoskop befestigte Fußpedal, um die Videoaufnahme zu initiieren. Und drücken Sie fest einen Zeigefinger gegen die rechte Seite des Gasventils, um die Öffnung vollständig zu bedecken, Luft in das Endoskop und damit in den Dickdarm zu zwingen.
Ziehen Sie die Zange in geschlossener Position aus dem Mantel zurück in das rektale Lumen. Und legen Sie die Zange gegen die rektale Wand direkt über der Wunde, bis die Basis der Kiefer mit dem oberen Rand des Sichtfeldes ausgerichtet ist. Setzen Sie die vollständige Insufflatierung des Dickdarms fort, bis eine klare Sicht auf die Wunde beobachtet werden kann.
Um die besten Messungen des Wundbettes zu erhalten, seien Sie geduldig und legen Sie das Kolonoskop in einem genauen Winkel, damit Sie Ihr bestes Bild vom Wundbett erhalten. Öffnen Sie das Video in einem entsprechenden Softwareprogramm und bringen Sie das Video zu einem Frame vor, der einen Zeitpunkt zeigt, an dem das Wundbett leicht visualisiert werden kann. Und an dem die geschlossenen Zangen über dem Wundbett und gegen die Rektalwand sind, und die Wand ist straff.
Zu jedem Zeitpunkt erhalten Sie eine Momentaufnahme dieses Rahmens und kodieren Sie den Dateinamen, um sicherzustellen, dass die Messungen der Wundbetten in einer blinden Weise durchgeführt werden. Um die Größe des Wundbettes zu quantifizieren, öffnen Sie die Bilder in ImageJ und verwenden Sie das Werkzeug Freihandauswahl, um einen Umfang um die Wunde zu zeichnen. Wählen Sie unter Analysieren die Option Messen aus.
Und der Wert dieser Messung wird automatisch im Ergebnisfenster angezeigt. Wenn alle Messungen erfasst wurden, berechnen Sie die Größe der Wunde an den folgenden Tagen relativ zur Größe am Tag Null in einer Kalkulationstabelle. Öffnen Sie am entsprechenden experimentellen Endpunkt die Haut- und Bauchmuskelschichten, um die Körperhöhle des Versuchstiers freizulegen, und legen Sie geschlossene Zangen unter den Dickdarm.
Heben Sie den Dickdarm vorsichtig an, um ihn aus dem zugrunde liegenden Mesentery zu befreien und schneiden Sie das Gewebe an seinem Mittelpunkt und am Anus, um es von der Maus zu sammeln. Verwenden Sie eine 20-Milliliter-Spritze gefüllt mit eiskalten PBS und ausgestattet mit einer Rattengavage-Nadel, um den Fäkalieninhalt auszuspülen. Und legen Sie den geräumten Doppelpunkt auf ein Stück Filterpapier.
Öffnen Sie den Kolon längs, wobei Sie darauf achten, dass die mesenterische Seite mit dem Gesicht nach unten gegen das Filterpapier gerichtet ist. Und verwenden Sie eine Pasteur Pipette, um die Schleimhaut mit 0,2% Methylenblau abzudecken. Nach ein paar Sekunden den überschüssigen Fleck abtropfen lassen und den Dickdarm unter einem Sezierendes Mikroskop betrachten, um das Wundbett zu lokalisieren.
Verwenden Sie vier Zoll Micro Iris Schere um den Rand des Bettes zu schneiden, achten Sie darauf, nicht in die Muskelschicht zu schneiden. Und verwenden Sie Feine Punkt Pinzette, um das sezierte Gewebe in ein Rohr für Snap Freezing und oder Lagerung zu übertragen. Am entsprechenden experimentellen Endpunkt den geernteten Dickdarm längs auf einem Stück Filterpapier, mesenterer Seite nach unten, öffnen.
Bedecken Sie das Gewebe vorsichtig mit Ihrem Fixativ Ihrer Wahl. Das Gewebe 4 bis 6 Stunden vor der Lagerung in 70% Ethanol mit Parafilm in einem verschlossenen Behälter bedecken. Entfernen Sie am Tag der Verarbeitung den Parafilm und fügen Sie dem Gewebe 0,2% Methylenblau hinzu, wie gezeigt.
Nach dem Abtropfen des überschüssigen Flecks legen Sie das Gewebe unter ein Sezierendes Mikroskop, um das Wundbett zu lokalisieren. Mit einem Skalpell mit einer Klinge der Zahl 10, schneiden Sie direkt durch die Mitte des Wundbettes und weiter schneiden durch den Rest des Dickdarms in einer geraden Linie, so dass der Dickdarm in der Länge halbiert wird. Zum Kryosektionen die Doppelpunktstücke so einbetten, dass die Seite, die vom Skalpell geschnitten wurde, mit dem Gesicht nach unten in einer Basisform liegt, die halb mit Gewebegefriermedium gefüllt ist.
Sichern Sie das Gewebe mit einer feinen Pinzette an Ort und Stelle und legen Sie die Basisform auf eine Metallplatte oder dicke Aluminiumfolie auf trockenem Eis, um das Gefriermedium zu härten. Sobald der untere Teil des Mediums eingefroren ist, füllen Sie das restliche Volumen der Basisform mit Gefriermedium bei Raumtemperatur. Und geben Sie die Form in das Trockeneis zurück, bis der gesamte Gewebeblock eingefroren ist.
Dann übertragen Sie die Form in einen 80 Grad Celsius Gefrierschrank bis zum Schnitt. Hier werden repräsentative Bilder von akzeptablen Ansichten des Wundbettes zur genauen Quantifizierung der Größe des Wundbettes und der Verschlussrate der Wunde gezeigt. In dieser ex-vivo Ansicht eines Wundbettes können Indikatoren des Umfangs des Wundbettes und wo das Gewebe geschnitten werden können, um die Visualisierung des Wundbettes beim Schneiden zu ermöglichen.
In diesem repräsentativen Bild kann ein H- und E-Fleckenabschnitt eines Wundbettes deutlich beobachtet werden. Es ist wichtig, sofort Bilder des Wundbettes zu jeder Zeit zu erfassen, um eine genaue Beurteilung der Wundheilungsrate zu gewährleisten. Nach der Pinch-Biopsie können verschiedene Interessense in das Wundbett injiziert werden, um deren Auswirkungen auf die Wundheilungsrate zu testen.
