気相で、嗅覚による嗅覚受容体活性化の In Vitro モニタリング リアルタイム

当社のプロトコルは、臭気受容体のパネルで揮発性臭気の検出と識別を測定することができます。この方法は、臭気受容体ベースのバイオセンサーを開発する可能性を開きます。この技術により、気相の臭気分子に対する臭気受容体活性化のリアルタイムインビトロモニタリングが可能になります。

それはインビトロとインビボアプローチの間のギャップを埋める。この方法は、粘膜代謝酵素の役割を含む、臭気知覚につながる事象の運動学を理解するために使用することができる。まず、原稿に従ってM10とM10 PSFを準備します。

細胞は、摂氏37度および5%の二酸化炭素でM10 PSFの10ミリリットルで培養される。位相コントラスト顕微鏡で培養皿を観察します。合流率が100%に達したら、培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を穏やかに洗浄することによって、細胞を低濃度に分割する。

その後、PBSを吸引し、トリプシン-EDTAの3ミリリットルを追加します。細胞が皿から解離するまで約1分間反応させます。M10を5ミリリットル加えてトリプシンを不活性化し、ピペットを上下に加えて皿に取り付けられた細胞を取り外します。

8ミリリットルの細胞懸濁液を皿から15ミリリットルのチューブに移し、チューブを200倍Gで5分間遠心分離します。上清を吸引し、任意の細胞質量を分解するために上下にピペットを行うことによって、M10 PSFの5ミリリットルで細胞を再懸濁します。チューブに泡を作成しないでください。

細胞の20%の合流を得るために、新しい1,000ミリメートルの細胞培養皿にM10 PSFの9ミリリットルを加え、再懸濁細胞溶液の1ミリリットルを移す。摂氏37度と5%の二酸化炭素でインキュベートする。この皿は20%合流に着席し、48時間で100%の合流に達する。

皿を位相コントラスト顕微鏡の下に置き、観察します。100%細胞合流培養皿の1/10を取る。培地を吸引し、10ミリリットルのPBSで細胞を穏やかに洗います。

次にトリプシン-EDTAおよびM10、遠心分離機で細胞を処理し、以前に行われたようにM10 PSFで再治療する。1つの96ウェルプレートを実現するには、5ミリリットルの再懸濁セルから5.5ミリリットルの新鮮なM10 PSFに500マイクロリットルを加え、気泡を発生させることなく細胞とM10 PSFを混合します。

希釈した懸濁液のピペット50マイクロリットルを、マルチチャネルピペットを用いて96ウェルプレートの各ウェルに入れた。摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベート。まず、フェーズコントラスト顕微鏡で一晩培養した96ウェルプレートを置き、細胞合流を観察し、原稿に従ってプレート全体に共通するプラスミドを含む1.5ミリリットルチューブに最初のトランスフェクションミックスを準備します。

Rho-pCiは、空のベクター陰性対照であり、Olfr1377は、試験された臭気アセトフェノンに応答することが知られている陽性対照である。1つのコントロールプラスミドを含む2つのトランスフェクションミックスにミックスを分割します。MEMの500マイクロリットルと20マイクロリットルのリポフェクタミン2000試薬を含む第2のトランスフェクションミックスを調製する。

2番目のミックスの半分を各貯水池によく加え、上下にピペットで軽く混ぜます。チューブを室温で15分間インキュベートします。1つの96ウェルプレートにM10を5ミリリットル加えます。

各貯水池によく2.5ミリリットルを加え、穏やかに混ぜます。前にめっきした96ウェルプレートのM10 PSFを、最終的なトランスフェクション媒体の50マイクロリットルに交換してください。摂氏37度と5%の二酸化炭素で一晩インキュベート。

次に、ルミノメーターのドアを開け、真空ポンプに接続されたチューブを挿入します。一晩照明計のチャンバーを掃除機をかけ。トランスフェクション後、96ウェルプレートを位相コントラスト顕微鏡で観察し、HEPESの10ミリモルとD-グルコース5ミリモルを含むハンクのバランス塩溶液の刺激溶液を60%から100%の間で細胞合流を確保します。

96ウェルプレートからトランスフェクション媒体を取り出し、各ウェルに50マイクロリットルの新鮮な刺激液を加えて細胞を洗浄します。GloSensor cAMP試薬溶液を希釈するために、ピペット2.75ミリリットルの刺激溶液を5ミリリットルチューブに入れ、75マイクロリットルのcAMP試薬溶液を加える。ウェルから刺激液を取り出し、希釈したcAMP試薬溶液を各ウェルに25マイクロリットル加えます。

暗くて無臭の環境で室温で96ウェルプレートを2時間インキュベートします。まず、10ミリリットルの鉱油で1%に臭気アセトフェノンを希釈し、チューブをキャップします。cAMP試薬のインキュベーション時間が終了する前に、新しい96ウェルプレートの各ウェルに25マイクロリットルの臭気溶液を加えます。

その後、この臭気板を照明計室に5分間置き、チャンバーを揮発性の臭気分子と平衡させます。90秒のプレート測定の20サイクルの間に0秒の遅延で発光を記録するルミネオメーターを設定し、サイクル間の間隔を0.7秒にします。プレートを読む直前に、チャンバーから臭い板を取り出します。

トランスフェクションされた細胞を含む96ウェルプレートに、ウェル間の空間に25マイクロリットルの臭気を加え、すぐにプレートをチャンバーに戻します。30分以内に20サイクルのすべてのウェルの発光測定を開始します。発光測定後、読解室内の臭気を少なくとも2時間広範囲に真空にして、照明計内部の残りの臭気を除去する。

新鮮な空気に交換し、次の臭気をインキュベートする前に5分間圧縮空気を送り、臭気揮発のクロスコンタミネーションを避けます。データ分析を開始するには、ルミノメーターソフトウェアからデータをエクスポートします。各記録時間に対して同じ OR の反復を平均します。

最終的なコントロールに対する正規化 OR 応答を計算するには、空のベクトル平均値を各記録時間で OR 平均値に割ります。各記録時間応答に対して 0 秒で平均 OR 応答を割り当て、基底活動に対する各 OR 応答を正規化します。各ORの曲線に対する単一のOR応答値を求めるために、各ORの各記録時間の発光値をすべて合計して、曲線下の領域を求める。

本実験では、気相臭刺激時のマウスのリアルタイム活性化を20回にわたってモニタリングした。空のベクター制御は、試験されたORsの臭気誘発活動が特異的であることを保証するために使用された。各ウェルのデータは、まず各サイクルの空のベクトル制御平均値に正規化されました。

次に、異なるOR'応答を比較するために、データをこのアッセイにおける基底活性のORレベルに正規化した。各ORの単一活性化値は、すべての測定サイクルの放出値を合計して、各ORの曲線下の面積を計算することによって計算した。さらに、用量依存性応答は、増え続ける臭気用量を用いて測定することができる。

5濃度でのアセトフェノン刺激に対するOlfr1377の応答を記録した。3つの高濃度だけがOlfr1377を活性化することができた。純粋な化合物刺激は、細胞毒性に起因する可能性が高い、時間の経過とともにOR応答を減少させる傾向を示す。

ステップ中に、あなたは、ウェルの間に希釈臭気剤を追加し、すぐにプレートの記録を開始する準備する必要があります。臭気の添加とモニタリングの間の時間は、2つの実験の間で最小限に抑え、一定であるべきである。アトリア細胞は生物危険物であるため、適切なディスペンサーに細胞を処分することを思い出してください。