气相臭受体活化的实时体外监测

我们的协议能够测量和通过气味受体面板的挥发性气味的检测和歧视。这种方法为开发基于气味受体的生物传感器开辟了可能性。该技术允许实时体外监测气味受体在蒸汽相中气味分子的激活。

它填补了体外和体内方法之间的空白。此方法可用于了解导致气味感知的事件的动力学，包括粘膜代谢酶的作用。首先，根据手稿准备 M10 和 M10 PSF。

细胞在37摄氏度和5%的二氧化碳下在10毫升M10PSF中培养。在相对比显微镜下观察培养皿。当它达到100%汇合时，通过吸气介质和用10毫升PBS轻轻清洗细胞，将细胞分裂到较低的浓度。

然后吸气PBS，并添加三毫升的尝试素-EDTA。让它反应大约一分钟，直到细胞与盘子分离。加入五毫升的M10来灭活三辛，并上下移液器分离连接到盘子的细胞。

将8毫升的细胞悬浮液从培养皿转移到15毫升的管子中，并在200次-G下离心管5分钟。吸升液，通过上下移液，将细胞重新注入M10 PSF的5毫升，以分解任何细胞质量。避免在管子中产生气泡。

为了获得20%的细胞汇合，在1000毫米新的细胞培养盘中加入9毫升M10PSF，并转移1毫升的再增细胞溶液。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育。这道菜，坐20%汇合，将在48小时内达到100%汇合。

将盘子放在相对比显微镜下观察。服用1/10的100%细胞汇合培养皿。吸气介质，用 10 毫升 PBS 轻轻清洗细胞。

然后用 trypsin-EDTA 和 M10 离心机处理细胞，然后像以前一样使用 M10 PSF 再次治疗。要实现一个96井板，从5毫升的再增电池中加入500微升至5.5毫升的新鲜M10PSF。

使用多通道移液器将稀释悬浮细胞的移液器 50 微升放入 96 井板的每个井中。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育过夜。首先，将96井板在相位对比显微镜下进行过夜培养，观察细胞汇合，并确保其在30%至50%之间，在1.5毫升的管中准备第一个转染混合物，该管包含整个板中常见的质粒。

Rho-pCi 是一种空向量阴性对照，Olfr1377 是已知对测试的醋酸酯反应的阳性对照。将混合物分成两个包含控制质粒的转染混合物。准备含有500微升 MEM 和 20 微升脂氨胺 2000 试剂的第二个转染混合物。

将第二个混合物的一半添加到每个储液罐中，然后通过上下移液轻轻混合。在室温下孵育管子15分钟。为一个96井板添加5毫升M10。

在每个储液罐中加入2.5毫升，轻轻混合。用最终转染介质的 50 微升替换以前镀 96 井板中的 M10 PSF。在37摄氏度和5%的二氧化碳下孵育过夜。

然后打开发光计的门，插入连接到真空泵的管子。将发光计的室真空一夜。转染后，在相对比显微镜下观察96井板，确保细胞汇合60%至100%，准备汉克平衡盐溶液的刺激溶液，其中含有10毫摩尔的海、5毫摩尔的D-葡萄糖。

从96井板中去除转染介质，通过向每井添加50微升新鲜刺激溶液来清洗细胞。稀释GloSensor cAMP试剂溶液，将刺激溶液的移液器2.75毫升放入5毫升管中，并加入75微升的CAMP试剂溶液。从油井中去除刺激溶液，并在每口井中加入25微升稀释的CAMP试剂溶液。

在室温下孵育96井板，在无异味的环境中孵育两小时。首先，将异味醋酸酯稀释至10毫升矿物油，并盖住管。在CAMP试剂孵育时间结束之前，在一个新的96井板中，将25微升的臭味溶液添加到每一个井中。

然后将这种气味板放在发光仪室中五分钟，使室与挥发性气味分子平衡。设置亮度计以在 90 秒板测量的 20 个周期中以零秒的延迟记录亮度，周期间隔为 0.7 秒。在阅读板之前，从腔室中取下异味板。

在含有转染细胞的96孔板中，在孔之间的空间中加入25微升气味，并迅速将该板放回腔室。在 30 分钟内开始所有油井的发光测量 20 个周期。在发光测量后，通过广泛吸尘读室内的除臭剂，清除发光仪内剩余的气味至少两个小时。

在孵育下一个气味剂之前，先将压缩空气送五分钟，以替代新鲜空气，以避免异味挥发物的交叉污染。要开始数据分析，请从亮度计软件导出数据。平均每个录制时间相同 OR 的复制。

要计算对任何最终控件的规范化 OR 响应，请将空矢量平均值除以每次记录时 OR 平均值。通过将平均 OR 响应以零秒划分到每个记录时间响应，使每个 OR 响应标准化其基底活动。要获取每个 OR 曲线的单个 OR 响应值，请求和每个 OR 的每个记录时间的所有发光值，以便获取曲线下的区域。

在这个实验中，对20个测量周期的蒸汽气味刺激对小鼠的ORs进行实时激活。使用空病媒控制来确保被测试的 ORs 的异味引起的活动是具体的。每一井的数据首先归一化为每个周期的空矢量控制平均值。

然后，为了比较不同的 OR 响应，数据被规范化为此测定中基底活动的 OR 级别。通过计算每个 OR 的曲线下面积，通过求和所有测量周期的发射值来计算每个 OR 的单激活值。此外，剂量依赖性反应可以通过增加的异味剂量来衡量。

Olfr1377对五浓度的乙酰苯酮刺激的反应被记录下来。只有三个浓度较高的能激活Olfr1377。纯化合物刺激显示随着时间的推移，OR反应呈下降趋势，可能是由于细胞毒性。

在步骤中，您应该在井之间添加稀释的异味，并准备快速开始记录板。应尽量减少添加异味与监测之间的时间，并缩短两个实验之间的时间。在阿片细胞是生物危害物质，所以提醒在适当的药房处置细胞。