アラビドプシスタリアナにおけるパターン誘発酸化バーストと苗成長抑制アッセイ

これらのアッセイは、異なる植物遺伝子型の免疫出力を評価し、比較するために使用することができる。これらの技術の主な利点は、迅速で信頼性が高く、一般的な実験装置を使用することです。成長阻害アッセイのために、同じ大きさと年齢の苗を移植し、変動を制限するために計量する前に乾燥して完全にブロットする必要があります。

発芽後4~5週間で、鋭い4ミリメートルの生検パンチを使用して、シロイヌナズナズナの植物ごとに1枚の葉ディスクを取り除き、中静脈を避け、傷を制限するように注意してください。乾燥を防ぐために、1ウェルあたり100マイクロリットルの二重蒸留水を含む未使用の96ウェルのルミノメータープレートの個々の井戸にディスクを収集し、adaxial側を上にして下さい。複数のイリシターを評価する場合は、各エレシター処理のために同じ葉から2番目の葉ディスクを取り出し、蓋でプレートを覆い、葉ディスクが室温で一晩回復できるようにします。

翌朝、マイクロプレートリーダーパラメータを、40~60分の間隔で2分間隔で1,000ミリ秒の統合時間に設定し、動的酸化バーストをキャプチャします。次に、マルチチャネルピペットを使用して、各ウェルの水を、コントロールを含む、各遺伝子型に対する誘発反応を含む100マイクロリットルの新しい反応溶液で交換し、引き出しがない場合の基底反応酸素種レベルを評価する。そして、マイクロプレートリーダー上の可視スペクトルにおける全ての波長の発光を直ちに測定する。

発芽後4日間で、500マイクロリットルのMS培地を含む48ウェルプレートの各ウェルを、引き出しペプチドの希釈を添加した。次に、滅菌鉗子を用いて、各ペプチド希釈液に6~8種の苗を慎重に移植し、根に苗や破損に損傷がなく、根が培地に沈んでいるのに注意する。すべての苗をめっきしたら、プレートをマイクロポアテープで密封し、8〜12日間、標準的な短い日の条件の下で植物を置きます。

成長阻害率を決定するには、各ウェルから苗を慎重に除去する前に、成長阻害を視覚的に記録するために写真を撮ります。その後、ペーパータオルに根をささげ、分析スケールで各苗の重量を量ります。この代表的な実験では、多動性免疫シグナル伝達を有する変異植物は、野生型のアラビナズナズナズ植物と比較して高い累積および平均酸化バーストを示し、一方、免疫シグナル伝達障害を有する変異植物は10〜1,000ナノモルの間の濃度で減少した酸化バーストを示した。

苗の成長阻害の予想される違いは、100と1,000ナノモルエリシターペプチド濃度で成長したすべての遺伝子型の間で識別することもできます。1,000ナノモルペプチド希釈で増殖すると、多動性免疫シグナル伝達を有する変異体は、同じ条件下で成長した野生型植物よりも著しく小さかったが、免疫シグナル伝達障害を有する変異体は野生型植物に対する成長の弱い阻害を示した。これらの方法は、早期および後期の免疫応答の証拠を提供する。

MAPキナーゼアッセイ、病原体誘発遺伝子発現、および感染アッセイを含む他のいくつかの技術は、これらの経路を描くために使用することができる。これらの技術は、病原体受容体タンパク質および他のいくつかのシグナル伝達成分を同定することに成功した大規模スクリーンでの使用のために変更されています。