この方法は、高純度のヒト肝芽前駆細胞および肝細胞様細胞の多数の生成を可能にする。これらの肝細胞を生成する能力は、再生医療や他の分野のために重要である可能性があります。.この方法は、肝臓の分化を促進し、望ましくない細胞タイプの形成を抑制するための発達シグナル伝達経路を制御することにより、ヒト肝芽前駆細胞および肝細胞様細胞を6日および18日分化することによって効率的に生成することを可能にする。
この技術の主な利点は、生成されたヒト肝細胞の高純度である。この手順であることに、 50 ミリリットル IMDM を攪拌棒を含む円錐形フラスコに加えます。培地を摂氏50度に加熱し、0.5グラムのPVAを加え、連続的に攪拌しながら、1ミリリットル当たり10ミリグラムの濃度でPVAストックを調製します。
この後、加熱パッドからPVA溶液を取り出し、室温まで冷却します。溶液が冷却されたら、滅菌、0.2マイクロメートルのフィルターを通してそれをフィルタリングします。テキストプロトコルの表1に示すように、フィルタされたPVAと他の試薬を組み合わせてCDM2とCDM3を準備します。
滅菌、0.2マイクロメートルのフィルターを使用して、すべての媒体をフィルタリングします。次に、テキストプロトコルの表1に概説されているように、残りのベースメディアであるCDM4とCDM5を準備します。分化培地を調製するために、まず凍結した小分子や成長因子を室温で解凍する。
アリコートは、必要量の塩基媒質を出し、適切な濃度で塩基培地に指定された小分子および成長因子を加える。使用前日に、4°Cでマトリックスを解凍します。翌日、500マイクロリットルのマトリックスを50ミリリットルの冷たいDMEMに加えて1~100の比率でマトリックスを希釈します。
希釈マトリックスを必要な数のウェルにピペット化し、十分な量の溶液を使用してウェルの表面を覆います。マトリックスコーティングされたプレートを摂氏37度のインキュベーターに少なくとも60分間移します。播種の直前に、コーティングされたウェルから残りのマトリックス溶液を吸引する。
次に、大部分のコンフルエントhPSC培養プレートから培地を吸引し、商業的に購入した解離剤を添加し、細胞が成長している表面を覆うのに十分な量を使用することを確認する。解離剤中のhPSCを摂氏37度で5分間、または一部のコロニーが剥離し始めるまでインキュベートする。次にDMEMとF-12を加え、解離剤を希釈する。
5ミリリットルの血清ピペットを使用して、井戸の表面からすべての細胞を洗い流すために何度も何度もピペットを軽くピペットします。再懸濁した単一細胞を50ミリリットルの円錐管に集め、必要に応じてDMEMとF-12で希釈します。このチューブを350倍gで、摂氏4度で細胞をペレット化する遠心分離器を採取した。
遠心分離を待っている間に、hPSCが播種されるプレートからマトリックスを吸引する。それらをカバーするために受取人の井戸に十分な量のmTeSRメディアを追加します。遠心分離が完了したら、上清を慎重に吸引し、ペレット化したhPSCを円錐管の底部に残す。
mTeSR中の細胞ペレットを再懸濁し、市販のチアゾビビンの1つのマイクロモルを補充する。P1000ピペットを使用し、2〜3回穏やかにトリチュレートし、細胞ペレットを単一の細胞懸濁液に均等に再懸濁させる。直ちに10マイクロリットルの細胞懸濁液をヘモサイトメーターにピペットし、細胞数をカウントする。
チアゾビビン補充mTeSRで再懸濁されたhPSCの体積を調整して、メッキに対する所望の細胞濃度を達成します。次に、プレートを十字型で数回振って、細胞が均等に分布していることを確認します。hPSCが少なくとも24時間めっきされた後、位取りhPSCコロニーの直径に特に重点を置いて細胞の形態を確認するために位相対数顕微鏡を使用する。
次に、テキストプロトコルの表2に示すように、1日目のAPS分化媒体を準備します。播種した翌日、メッキされたhPSCからチアゾビビン補充mTeSRを吸引し、IMDM培地で短時間洗浄する。この後、hPSC に 1 日目のメディアを追加します。
時間を記録し、セルを摂氏37度でインキュベーターに戻します。必要な分化培地を調製し、同じ時間の分化の各日に細胞に追加することによって、その後の分化ステップを続けます。本研究では、肝臓芽前駆細胞の濃縮集団とその後の肝細胞様細胞がhPSCから生成される。
分化の2日目までに、原始的なストリーク細胞は2日目の決定的な内胚葉細胞に分化した。これらの細胞の大部分はSOX17およびFOXA2を発現する。分化の3日目までに、内胚葉細胞は形で多角形に見える前駆細胞に分化した。
その後、6日目までに、前駆者は肝芽前駆物質に分化した。これらの肝芽前駆物質は、AFP、TPX3、およびHNF4αを発現する。3つのhPSCラインにわたって、この方法は、約89%の効率で6日目のAFP陽性肝前駆細胞を生成し、最後に、hPSCからの肝臓分化の18日後に、アルブミン陽性肝細胞様細胞が現れる。
形態学的には、これらの細胞は上皮に現れ、胆汁カナリクリを連想させる明るい境界を形成する。この段階では、18日目の細胞質は、核よりも暗く見える。ヒト多能性幹細胞を播種して分化する場合、適切な密度で播種し、プレートを振って井戸全体に分配することが不可欠です。
ヒト肝細胞を体外で産生する能力は、科学者が肝臓開発の基礎となるメカニズムを調査することを可能にする技術です。この方法は、肝機能と病気を調査し、最終的に肝不全のための新しい治療法を可能にするために使用することができ、インビトロでヒト肝細胞の多数を生成します。
