هذه الطريقة تمكن من توليد أعداد كبيرة من السلف برعم الكبد البشري وخلايا تشبه الكبد مع نقاء عالية. القدرة على توليد خلايا الكبد هذه يمكن أن تكون مهمة للطب التجديدي وغيرها من المجالات. من خلال التحكم في مسارات الإشارات التنموية لتعزيز تمايز الكبد وقمع تشكيل أنواع الخلايا غير المرغوب فيها ، تمكن هذه الطريقة من التوليد الفعال لذريات برعم الكبد البشري والخلايا الشبيهة بال الكبد من قبل ستة أيام و 18 يومًا من التمايز على التوالي.
الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي النقاء العالي لخلايا الكبد البشرية التي تولدت. إلى كونه هذا الإجراء، إضافة 50 ملليلتر من IMDM إلى قارورة مخروطية تحتوي على شريط ضجة. سخني متوسطة إلى 50 درجة مئوية وأضيف 0.5 جرام من PVA مع التحريك المستمر لإعداد مخزون PVA بتركيز 10 ملليغرام لكل ملليلتر.
بعد ذلك، قم بإزالة محلول PVA من وسادة التدفئة والسماح لها بالتهدئة إلى درجة حرارة الغرفة. بمجرد تبريد الحل، فلتره من خلال مرشح ميكرومتر معقمة، 0.2. إعداد آلية التنمية النظيفة 2 و CDM3 عن طريق الجمع بين PVA المصفاة مع الكواشف الأخرى على النحو المبين في الجدول الأول من بروتوكول النص.
استخدم فلتر ميكرومتر معقمة، 0.2 لتصفية جميع الوسائط. ثم إعداد الوسائط الأساسية المتبقية، CDM4 و CDM5، على النحو المبين في الجدول الأول من البروتوكول النصي. لإعداد التمايز المتوسط، أولاً ذوبان الجزيئات الصغيرة المجمدة و/ أو عوامل النمو في درجة حرارة الغرفة.
Aliquot خارج المبلغ المطلوب من متوسطة الأساس وإضافة الجزيئات الصغيرة المحددة وعوامل النمو إلى وسط القاعدة في التركيزات المناسبة. في اليوم السابق للاستخدام، ذوبان المصفوفة في أربع درجات مئوية. في اليوم التالي، تمييع المصفوفة بنسبة 1 إلى 100 عن طريق إضافة 500 ميكرولترات من المصفوفة إلى 50 ملليلتر من DMEM الباردة.
الماصات المصفوفة المخففة في العدد المطلوب من الآبار باستخدام كمية كافية من الحل لتغطية سطح البئر. نقل لوحة مكسوة بالمصفوفة إلى حاضنة في 37 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة على الأقل. مباشرة قبل البذر، الطامح حل المصفوفة المتبقية من الآبار المغلفة.
ثم، الطامح المتوسطة من لوحة ثقافة hPSC التقاء إلى حد كبير وإضافة وكيل تفكك اشترى تجاريا، مع التأكد من استخدام ما يكفي لتغطية السطح الذي تنمو الخلايا. احتضان hPSCs في وكيل تفكك في 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق أو حتى تبدأ بعض المستعمرات فصل. بعد ذلك، إضافة DMEM و F-12 لتمييع عامل الانفصام.
استخدام ماصة المصلية خمسة ملليلتر إلى ماص بلطف صعودا وهبوطا عدة مرات لغسل قبالة جميع الخلايا من سطح البئر. جمع الخلايا المفردة التي أعيد اعتمادها في أنبوب مخروطي 50 ملليلتر وتمييع مع DMEM وF-12 حسب الحاجة. أجهزة الطرد المركزي هذا الأنبوب من hPSCs التي تم جمعها في 350 مرات ز و4 درجات مئوية لمدة ثلاث دقائق ل بيليه الخلايا.
في انتظار الطرد المركزي، التبخر المصفوفة من لوحة التي سيتم بذر hPSCs. إضافة كمية كافية من الوسائط mTeSR إلى آبار المستلمين لتغطيتها. عندما يكون الطرد المركزي كاملاً، يُطلق التعرق بعناية، تاركاً الهدّانات المُتَركِة في الجزء السفلي من الأنبوب المخروطي.
Resuspend بيليه الخلية في mTeSR تكملها بميكروفولالار واحد من الثيازوفيفين التي تم الحصول عليها تجاريا. باستخدام ماصة P1000، triturate بلطف مرتين إلى ثلاث مرات لإعادة بوزن بالتساوي بيليه الخلية في تعليق خلية واحدة. على الفور ماصة 10 ميكرولترات من تعليق الخلية في قياس الهيموسيتات وعد عدد الخلايا.
ضبط حجم hpscs resuspended مع الثيازوفيين المكمل mTeSR لتحقيق التركيز المطلوب الخلية للطلاء. ثم، يهز لوحة في نمط الصليب عدة مرات للتأكد من أن يتم توزيع الخلايا بالتساوي. بعد أن تم مطلي hPSCs لمدة 24 ساعة على الأقل، استخدم مجهر النقيض المرحلة للتحقق من مورفولوجيا الخلايا مع التركيز بشكل خاص على قطر المستعمرات hPSC مطلي.
بعد ذلك، إعداد يوم واحد APS التمايز المتوسطة كما هو مبين في الجدول الثاني من بروتوكول النص. بعد يوم واحد من البذر، الطامح mTeSR ثيوزافيفين الملحق من hPSCs مطلي وغسلها لفترة وجيزة مع وسائل الإعلام IMDM. بعد ذلك، إضافة يوم واحد المتوسطة إلى hPSCs.
تسجيل الوقت ووضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة في 37 درجة مئوية. الاستمرار في خطوات التمايز اللاحقة من خلال إعداد وسيط التمايز المطلوب وإضافته إلى الخلايا في أيام التمايز الخاصة به في نفس الوقت من اليوم تقريبًا. في هذه الدراسة، يتم إنشاء مجموعات من النسل برعم الكبد والخلايا الشبيهة بال الكبد في وقت لاحق من hPSCs.
في اليوم الثاني من التمايز ، وقد تم تمييز الخلايا المتتالية البدائية في اليوم الثاني خلايا endoderm نهائية. الغالبية العظمى من هذه الخلايا تعبر عن SOX17 و FOXA2. بحلول اليوم الثالث من التمايز ، وقد تم تمييز الخلايا endoderm إلى السلف التي تظهر متعددة الأضلاع في الشكل.
في وقت لاحق، بحلول اليوم السادس، وقد تميز السلف foregut إلى السلف برعم الكبد. هذه السلف برعم الكبد التعبير عن وكالة فرانس برس, TPX3, وHNF4alpha. عبر ثلاثة خطوط hPSC، هذه الطريقة يولد اليوم ستة مستجدات الكبد الإيجابي AFP في كفاءة ما يقرب من 89٪ أخيرا، بعد 18 يوما من تمايز الكبد من hPSCs، الألبومين إيجابية خلايا تشبه الكبد تظهر.
مورفولوجيا، هذه الخلايا تظهر الظهارية، وتشكيل الحدود مشرق تذكرنا bile canaliculi. في هذه المرحلة، السيتوبلازم من اليوم 18 hPSC المشتقة خلايا الكبد يظهر أغمق من النواة. عند بذر الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات للتمايز ، لا بد من زرعها في الكثافة الصحيحة وكذلك توزيعها عبر البئر عن طريق هز الطبق.
القدرة على إنتاج الكبدات البشرية في المختبر هو التكنولوجيا التمكينية التي من شأنها أن تسمح للعلماء للتحقيق في الآليات الكامنة في تطوير الكبد. ينتج هذا الأسلوب أعداد كبيرة من خلايا الكبد البشرية في المختبر والتي يمكن استخدامها للتحقيق في وظائف الكبد والمرض وتمكين العلاجات الجديدة في نهاية المطاف لفشل الكبد.
