この作品は、主任科学者のオフィス (TCS/16/37) と MRC 博士奨学金からの賞でサポートされていました。

1. ひと多能性幹細胞 (hPSCs) に 96 もプレートの肝細胞分化の播種
注: 試薬、このプロトコルで使用する機器は、表 1に記載されています。この実験で使用されるメディアは、生殖不能および細胞培養のため室温でにある必要があります。特に指定しない限り、プロトコルのこの部分に記載されているすべての試薬/ソリューション ボリュームは 96 ウェル プレートの単一の井戸に基づいています。
<ol><li>
準備ラミニン コート 96 ウェル プレート。
	<ol>
<li>組換えラミニン 521 (100 μ g/mL) のバイアルを解凍 (LN 521) 一夜に 4 ° C で 2 時間</li>
		<li>5 μ g/mL の溶液を準備するには、冷たい 1 ダルベッコ リン酸緩衝生理食塩水 (DPBS) (Ca2 +/Mg で2 +) x LN 521 を希釈します。</li>
		<li>調剤カセット標準チューブでディスペンサーを扱う自動液体を使用すると、50 μ L/ウェルの 96 ウェル プレート LN 521 ソリューションを追加できます。 注: すべてのボリューム分配が特に指定しない限り、カセットを調剤標準管自動液体ハンドリング ディスペンサーと実行されます。プライム ソリューション、カセットの調剤の終わりに到達するまでは、調剤に進みます。複数の 96 ウェル プレートは、回数に応じて手順を繰り返して、同じ実験で用意できます。</li>
		<li>37 °C/5% CO2 2 に 4 h で LN521 コーティング版を孵化させなさい。 注: LN521 コーティング プレートに格納できる 4 ° C で 2 週間蒸発し、汚染を避けるために平らな面にシール プレートを維持します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>1 時間に 30 分の 37 ° C でプレコート板の必要な数を暖かい。</li>
	<li>8 ch 吸引アダプターを使用して塗装面の残りの LN 521 溶液を吸引します。 注: コーティングの劣化を避けるために表面との接触を避けるために重要です。</li>
	<li>すぐに 10 μ M (ロック) Rho 関連キナーゼ阻害剤 Y27632 mTeSR1 培のウェルあたり 50 μ L を追加し、細胞 37 °C/5% CO2播種までインキュベーターでプレートを保ちます。 注: は、乾燥するラミニン コート井戸は認めません。</li>
	<li>
3 x 105セル/10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培 mL の細胞懸濁液を準備します。 注: 各セルライン播種密度の最適化が必要になります。<ol>
<li>培地を吸引 hPSCs で約 75% から 85% の未分化文化シャーレから LN 521 で培養の confluency 前述12。 注: hPSCs が上で培養した LN 521 mTSER1 のすべての 24 h を変更し、セル前述12として密度の 80% に到達後、定期的に継代培地で。</li>
		<li>洗浄室内温度 1 の 5 mL のセル (せずに Ca2 +/Mg2 +) x DPBS と吸引バッファー。</li>
		<li>セルに優しく細胞解離試薬 × 1 の 5 mL を追加し、, 細胞解離の 6 ~ 8 分くらいの 37 ° C で。 注: 反作用を停止し、するには、顕微鏡下でマトリックスから細胞の剥離を調べます。セルは、プレートから部分的に切断する必要があります。ない場合は、余分な 1 を 2 分間インキュベーションを拡張します。</li>
		<li>穏やかな細胞解離試薬の吸引によって、反応を終了し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 細胞に新鮮な mTeSR1 培の 5 mL を追加します。細胞スクレーパーを使用して、マトリックスとピペットをミックスする数回 P1000 ヒントを使用して上下から細胞を持ち上げます。</li>
		<li>トリパン ブルー染色除外法に基づく検定を使用して実行可能なセルをカウントし、必要な濃度と細胞懸濁液を準備します。</li>
		<li>滅菌 15 mL や 50 mL の遠心管に必要な細胞数をピペット又それらを室温で 5 分間 115 x gで遠心分離によって細胞をスピンダウンします。 注: 1 つの 96 ウェル プレート、mTeSR1 培 3 × 105セル/mL の 5 mL は H9 セル行必要です。</li>
		<li>上清を吸引し、10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 mTeSR1 培の 37 ° C で同種のソリューションが得られるまで優しく細胞ペレットを再懸濁します。 注: セル生存ポスト再めっきを改善しながら、ROCK 阻害剤の使用はお勧めします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>10 μ M ROCK 阻害剤 Y27632 と mTeSR1 の 50 μ L を含む 96 well プレートに細胞懸濁液の 50 μ L を追加します。</li>
	<li>播種後、プレートを 37 °C/5% CO2を付けるセルを許可するように 24 時間で細胞インキュベータに戻ります。</li>
	<li>次の日細胞を調べるし、細胞に細胞の接触が確立されたら、ROCK 阻害剤を撤回します。40% の confluency で分化培地 (図 1 b) に切り替えます。 注: セル密度が 40% 以上の場合、プレートは、H9 セルラインで足 HLC の差別化のため適していません。</li>
</ol>2. 96 プレートで組換え Laminins の肝細胞様細胞に hPSCs を区別します。
<ol><li>
中小企業の成長要因の分化を準備します。
	<ol>
<li>滅菌 0.2% ウシ血清アルブミン (BSA) の PBS で人間のアクチビン A 粉末を溶解することにより、人間のアクチビン A 原液 (100 μ g/mL) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。</li>
		<li>0.2 %bsa を無菌のマウス Wnt3a 粉末を溶解することによりマウス Wnt3a 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 200 で使用します。</li>
		<li>滅菌 0.2 %bsa で人間 HGF の粉末を溶解することにより、ひと肝細胞増殖因子 (HGF) 原液 (10 μ G/ml) を準備します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1: 1000 で使用します。</li>
		<li>オンコスタチン M (OSM) 原液 (20 μ g/mL) を準備するには、滅菌の 0.2 %bsa の粉末を溶解します。在庫の約数と-20 ° C にてストア1:1, 000 で使用します。</li>
		<li>決定的な内胚葉: 2 %b27 サプリメント (50 x、インスリンがなければ)、1% ペニシリン/ストレプトマイシンから成る、内胚葉分化培地を準備 (最終濃度: 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ロズウェル パーク記念研究所 1640 (追加RPMI 1640) 基礎培地。4 ° C で保存し、2 週間以内に使用します。それぞれの媒体の変更で必要なボリュームやで補うアクチビン A Wnt3a 100 ng/mL と 50 ng/mL、最終濃度でそれぞれ。</li>
		<li>Hepatoblast 分化: 20% ノックアウト血清交換 (KSR) 0.5% 1%、1% DMSO 0.1 mM β-メルカプトエタノール 1% 非必須アミノ酸 (NEAA) L-グルタミンの代替補完から成る、hepatoblast 分化培地の準備ペニシリン/ストレプトマイシン (最終濃度 100 IU/mL と 100 μ g/mL、それぞれ) ノックアウト DMEM (KO DMEM) に追加されます。真空下でフィルターし、4 ° C で保存2 週間以内に使用します。</li>
		<li>肝細胞の分化: 肝細胞分化培地、L-グルタミン、10 μ M ヒドロコルチゾン 21 hemisuccinate ナトリウム塩 (HCC) 1% ペニシリン/ストレプトマイシンに代わる補足 1% から成るを準備 (最終濃度 100 IU/mL と100 μ g/mL、それぞれ) HepatoZYME 培地に添加します。4 ° C で、在庫を保管し、2 週間以内使用します。HGF と OSM 必要なボリュームを補う、それぞれの媒体の変更について (最終濃度 10 ng/mL で 20 ng/mL、それぞれ)。</li>
	</ol>
</li>
	<li>播種、24 h の記事は慎重にハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアを取り出して、100 ng/mL アクチビン A と 50 ng/mL Wnt3a と新鮮な内胚葉プライミング培の 100 μ L を追加します。 注: 分化過程開始決定的な内胚葉媒体が追加されます。細胞の播種を最適化すると、細胞の分化は通常 24 h 内で開始されます。すべての媒体の変更はハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムとメディアを削除して、標準で自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して新鮮な媒体の 100 μ L を分注した調剤カセットをチューブは、しない限り、それ以外の場合指定します。ハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムは、300 μ L のヒントを使用して、よく頭 96 で使用されました。簡単に言えば、90 μ L もの細胞が付いている接触を避けるから吸気された、細胞のストレスを軽減する中型の変更時にセルを乾燥しないことが重要です。</li>
	<li>ヒト胚性幹細胞 (hESCs)、三日間内胚葉分化培地毎日を変更します。ひと誘導多能性幹細胞 (hiPSCs) の分化を実行すると、2 の余分な日だけアクチビン A を使用して決定的な内胚葉ステージを拡張します。</li>
	<li>決定的な内胚葉誘導後、hepatoblast 仕様 KSR/DMSO 中に切り替えて、5 日間ごとに 2 日間媒体を変更します。 注: 非添付も細胞数が存在する場合は、次の媒体の変更の前に 1 回血球を洗浄する以外の添加 KO DMEM を使用します。プロトコル (5 日) の第二期の期間のため、hepatoblast 仕様の最後の日の最後の 1 と 3 の中変更があります。</li>
	<li>次の hepatoblast 分化肝細胞成熟の HepatoZYME 中に切り替えます。KSR/DMSO 中を削除した後の補足なし HepatoZYME で血球を洗浄し、10 ng/mL HGF と 20 ng/mL OSM HepatoZYME 成熟培の 100 μ L を追加します。</li>
	<li>7 ~ 10 日間、媒体ごとの 48 h を変更します。日 18、分化、遺伝子発現と CYP P450 代謝活性を分析することによって HLCs を特徴付けます。</li>
</ol>3. 肝細胞様の細胞組換え Laminins の区別
<ol><li>肝細胞特異的マーカーと免疫染色を用いた偏波マーカーの発現を検出します。</li>
	<li>12前に説明したように CYP P450 の試金を使用して肝細胞の代謝機能をテストします。</li>
	<li>プレートごとウェルあたりの細胞の総数を数えるプレート バリエーションを決定します。</li>
</ol>4. 高スループット免疫細胞化学、画像集録
<ol><li>分化の 18 日に 1 x DPBS と 3 回洗浄、4% パラホルムアルデヒド (PFA) の 50 μ L 分注によって、HLCs を修正し、15 〜 30 分間室温でインキュベートします。固定、3 回で洗い流して PBST (0.1% トゥイーン) (Ca2 +/Mg2 +) を使用せずに自動皿洗浄機。 注: このセクションですべての洗浄は、特に指定しない限り、自動皿洗浄機を使用して実行します。すべての洗浄は、同じプロトコルに従って行われます。</li>
	<li>(せずに Ca2 +/Mg2 +) PBST の 100 μ L 分注で膜を permeabilize、室温で 20 分間インキュベートします。次に、pbst; 10 %bsa の 100 μ L 分注による蛋白質のブロックを実行し、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで 1 時間インキュベートします。タンパク質をブロック後、1 %bsa の 50 μ L を加えて pbst; 一次抗体を含む、プレート シェーカーを使用して穏やかな揺れで一晩, 4 ° C で。 注意: 蛋白質のブロックと抗体の添加の間洗わないでください。</li>
	<li>24 h 後 (せずに Ca2 +/Mg2 +) 1 x DPBS にて 3 回洗浄し、pbst; で 1 %bsa の 50 μ L 分注による二次抗体を追加します。暗闇の中で室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>二次抗体の孵化後 1 x DPBS で 3 回を洗ってください。DAPI の DPBS の 50 μ L を追加 (10 μ G/ml) と暗闇の中で部屋の温度で 5-10 分間インキュベートします。</li>
	<li>最後に、DPBS 3 回洗うし、井戸の 1 x DPBS の 100 μ L を残します。プレートは、イメージングのため準備ができています。 注: プレートは、イメージングまで暗闇の中で 4 の ° C で保存する必要があります。</li>
	<li>高コンテンツ イメージング システムを使用してプレートをイメージし、井戸の良い表現を取得するだけにいくつかのフィールドを取得します。コロンバス ソフトウェア (高コンテンツ イメージング解析システム ソフトウェア) を使用して、HLCs の別のマーカーの発現を定量化します。 注: コロンバスは、細胞表現型解析のためのセル分割分析を提供しています高いコンテンツ解析ソフトウェアです。同様の結果は、CellProfiler、生物画像22の定量分析のためのオープン ソース ソフトウェアを使用して実現できます。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Forbes, S. J., Gupta, S., Dhawan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+therapy+for+liver+disease:+From+liver+transplantation+to+cell+factory.">Cell therapy for liver disease: From liver transplantation to cell factory.</a> J Hepatol. 62 (1, Supplement), S157-S169 (2015).</li><li>Avior, Y., Sagi, I., Benvenisty, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pluripotent+stem+cells+in+disease+modelling+and+drug+discovery.">Pluripotent stem cells in disease modelling and drug discovery.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 17 (3), 170-182 (2016).</li><li>Szkolnicka, D., Lucendo-Villarin, B., Moore, J. K., Simpson, K. J., Forbes, S. J., Hay, D. 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教授デビッド C. Hay は共同創設者兼 Stemnovate 限定のディレクターです。
教授デビッド c. ヘイ HigherSteaks 限定のディレクターであります。

私たちの半自動の手順は効率、信頼性と経済性、規模 (図 1) で HLCs の生産を許可します。このプラットフォームのセル ベースのスクリーニング (図 2) の適切なアプローチを行う、プレートの井戸間に細胞数の面で有意差がなかった。さらに、半自動化ワークフローは手動プロセス5,12を使用する前にできなかった、一度にプレートの数が多いを生成するユーザーをできます。
重要なは、自動化プロセスは HNF4α を発現する細胞の大半との分化収量に影響しなかった (89.2% ± 2) および ALB (92.8% ± 6) (図 3)。HLCs は、CYP P450 酵素 CYP2D6、CYP3A4 の発現し、CYP1A2 と CYP3A 代謝活性以前報告された実験 (図 3)5に匹敵するが表示します。にもかかわらず、プロトコルの標準化、分化前のセル密度は純粋な足 HLC 分化にとって重要です。したがって、井戸に良い細胞分布を確保は、重要な考察 (図 1) です。これは依存のセルラインをあると証明した、従って細胞の播種と密度の最適化は各セル行前にスケール アップに必要です。
現在の形態でこのプラットフォームは適していません HLCs の臨床応用のための大量生産に、これは最も可能性の高いセル工場とバイオリアクターを使用して達成します。ただし、疾患モデリング、薬剤のスクリーニングおよび/または薬物の研究を転用のためひと肝細胞の急速な生成のため開発された方法論が許可されます。また、アッセイは、解明の多重データセットの生成を許可する多重化、影響を受けやすいです。今後は、我々 はまたこの技術が 3 D 分化など足 HLC 表現型生体外で改善するためのプラットフォームとしてシステムの in vitro複雑に適用することと考えています。
結論としては、考えています私たちの単純な半自動システムを実験のスループットを増加し、実験的な変化を減らす人間の生理への外挿と生物学的データセットの品質が向上します。

ひと肝細胞 (PHHs) は、肝の生物医学研究のための現在の標準を表します。彼らの利点にもかかわらず、PHHs は不安定な表現型1成熟肝細胞の限られたソースを表しています。ヒト胚性幹細胞 (Esc)、ひと誘導多能性幹細胞 (iPSC) は肝2,34,を含む人間のティッシュの再生可能エネルギー源を有望な医学研究の強力なリソースとして提案されています。.現在の肝細胞分化プロシージャ肝細胞マーカー、遺伝子、PHHs3,4,5,6,7に類似した機能を発現する細胞を生成します。 8,9,10,11。最近では、定義された材料と組換え laminins など行列の使用は、改良された細胞表現型と実験的再現性5,12,13,14。
従来の細胞培養の技術は、時間がかかり、エラーを起こしやすいです、手動ピペッティングに重く頼る。これは、アッセイおよび 1 つを扱うことができますプレート形式のスループットを制限します。まで、HLCs の生成を記述する研究のほとんどが労働集約的な性質で、サイズ15,16,17したがって小規模となっています。
最近の液体ハンドリング、ピペッティング システム研究所分析器、自動顕微鏡との組み合わせで可能となって人間の介入のための要件を最小限に抑えるための手順を開発します。これらの技術の利点を撮影し基本的な人間の肝臓組織を大量に生成する半自動化された分化システムを開発し、応用医学研究。このアプローチは、人間の ESC と iPSC 行セル行に応じて、必要な若干の調整を実行できます。高の内容分析とこのシステムを組み合わせて、我々 は足 HLC フェノタイピングより時間がかかり、スケール18,19,20,21で実行ことを示します。
要約すると、細胞培養の技術が記載のオートメーションは信頼性、実験時間管理、測定スループットの改善につながっています。

<table><tbody><tr><td>405 LS Washer</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B27 supplement</td><td>Life Technologies</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>beta-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>31350</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2058</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5879</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with Calcium and Magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14040133</td><td></td></tr><tr><td>Gentle cell dissociation reagent</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>7174</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMax</td><td>Life Technologies</td><td>35050</td><td></td></tr><tr><td>GripTips for VIAFLO 96</td><td>Integra</td><td>6434</td><td></td></tr><tr><td>HepatoZYME-SFM</td><td>Life Technologies</td><td>&amp;nbsp; 17705021</td><td></td></tr><tr><td>Human Activin A</td><td>Peprotech</td><td>120-14E</td><td></td></tr><tr><td>Human Hepatocyte Growth Factor</td><td>Peprotech</td><td>100-39</td><td></td></tr><tr><td>Human Oncostatin M</td><td>Peprotech</td><td>300-10</td><td></td></tr><tr><td>Human Recombinant Laminin 521</td><td>BioLamina</td><td>LN521-02</td><td></td></tr><tr><td>Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4881</td><td></td></tr><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Life Technologies</td><td>10829</td><td></td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Life Technologies</td><td>10828</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 medium</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>5850</td><td></td></tr><tr><td>MultidropCombi Reagent Dispenser</td><td>ThermoFisher</td><td>5840300</td><td></td></tr><tr><td>Non-essential amino acids</td><td>Life Technologies</td><td>11140</td><td></td></tr><tr><td>Operetta High-Content Imaging System</td><td>PerkinElmer</td><td>HH12000000</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)</td><td>Life Technologies</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant mouse Wnt3a</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>1324-WN-500/CF</td><td></td></tr><tr><td>Rho-associated kinase (ROCK)inhibitor Y27632</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Y0503-1MG</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Life Technologies</td><td>21875</td><td></td></tr><tr><td>Standard tube dispensing cassette</td><td>ThermoFisher</td><td>24072670</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9416&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>VIAFLO 96 Electronic 96-channel pipette</td><td>Integra</td><td>6001</td><td></td></tr><tr><td>PBS, no calcium, no magnesium</td><td>ThermoFisher</td><td>14190250</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyde solution 4%, buffered, pH 6.9</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1.00496&amp;nbsp;EMD MILLIPORE</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP3A4 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8801</td><td></td></tr><tr><td>P450-Glo CYP1A2 Assay and Screening System</td><td>Promega</td><td>V8771</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Antibodies&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6684</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>Alpha-fetoprotein</td><td>Abcam</td><td>ab3980</td><td>1:500 (mouse)</td></tr><tr><td>CYP2D6</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>CYP3A4</td><td>University of Dundee</td><td>University of Dundee</td><td>1:200 (sheep)</td></tr><tr><td>HNF-4&amp;alpha;</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-8987</td><td>1:400 (rabbit)</td></tr><tr><td>E-cadherin</td><td>Abcam</td><td>ab76055</td><td>1:200 (mouse)</td></tr><tr><td>IgG</td><td>DAKO</td><td></td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-Mouse 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11001</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-sheep 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11015</td><td>1:400</td></tr><tr><td>Anti-rabbit 488 (secondary antibody)</td><td>Life technologies</td><td>A-11008</td><td>1:400</td></tr></tbody></table>

semi-automated production of hepatocyte like cells from pluripotent stem cells

ひと多能性幹細胞は、人体組織の再生可能エネルギー源を表します。本研究では、ヒト胚性幹細胞 (hESCs) からひと肝組織の生成に焦点を当てたし、誘導多能性幹細胞 (Ips)。現在の差別化の手順は、ひと肝細胞様細胞 (HLCs) 胎児および大人の特性の混合物を表示するを生成します。細胞表現型を改善するために完全に定義しました私たちの分化の手順と細胞ニッチ表示改善された遺伝子発現と機能細胞の生成に終っています。一方、これらの研究は、進行状況をマーク、マルチ プレートのスクリーニングのための大量を生成する能力は労働集約的なプロシージャとバッチ変化されています。この問題に取り組むため、我々 は HLCs。 幹細胞播種に多能性幹細胞を分化する半自動化されたプラットフォームを開発しているし、分化は、96 ウェル プレート形式の液体処理と自動ピペッティング システムを使用して行われました。次の分化、細胞表現型を自動顕微鏡とマルチもルミノを使用して行った。

細胞の分化は萌芽期の幹細胞ライン (H9) を用いて行った。半自動化されたプラットフォームは、差別化し、細胞 (図 1 a) の特徴に慣れていた。自動液体ハンドリング ディスペンサーは、行列をコートで単一のセルをシードに使用されました。細胞の分化は、細胞に達すると 40% の confluency (0 日) に開始されました。媒体および媒体追加 (図 1 a) の液体ハンドリング ディスペンサーを削除するハンドヘルド電子チャネルの自動ピペット システムを使用してメディアの変更を行った。細胞の固定・染色を自動皿洗浄機との組み合わせで自動液体ハンドリング ディスペンサーを使用して行った。コロンバス ソフトウェア高コンテンツ イメージング システムを用いたイメージングと定量を行った。確立されたアッセイを用いたシトクロム P450 活性を測定しました。基板培養、細胞培養上清が収穫され、発光記録マルチモード マイクロ プレート リーダー (図 1 a) を使用しています。さらに、従来の位相差顕微鏡は、肝細胞の分化 (図 1 b) に細胞の形態の変化を測定する使用されました。
日 18 日 (図 2 a) を汚す DAPI 以下ウェル間の細胞数の変動を調べた。7 つのフィールドの表示は、井戸と核の定量化 (図 2 a) 数ごと捕獲されました。我々 は井戸 41,662 ± 3 の平均とよく (図 2 b) あたり 366 細胞間の統計的な差異を検出されません。
18 日に HLCs が固定し、典型的な肝細胞マーカー (図 3A G) 染色 CYP P450 活性をテストします。HLCs 表現 HNF4α など肝細胞マーカー (89.2% ± 2 陽性細胞) ALB (92.8% ± 6 陽性細胞)、AFP (61.8% ± 2 陽性細胞)。HLCs も CYP P450 タンパク質、CYP2D6、CYP3A4 の発現し、E-カドヘリン蛋白質の発現によって示すように多角形に独自の外観を表示します。18 日 HLCs CYP P450 活性を測定しました。HLCs は、295,906 ± 45、828 RLU/mL/mg タンパク質と 1,066,112 ±177、416 RLU/mL/mg タンパク質 (図 3 H) で CYP3A で CYP1A2 活性を示した。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2.jpg"> 図 1: 96 で Psc からの肝細胞分化もフォーマットします。細胞分化の半自動化、固定、染色・ イメージングと運動機能に使用される装置の(A) します。ダイアグラムです。(B).代表は足 HLC 分化細胞形態の変化します。簡単に言えば、Psc は決定的な内胚葉、石畳のような形態を表示する細胞と肝細胞成熟前の特徴細胞多角形を取得を hepatoblast 仕様に続いてに向けて準備万端します。スケールバー = 100 μ m.<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig2v3.jpg"> 図 2: HLCs 井戸-井戸変動の評価。(A)表現、96 ウェル プレート HLCs DAPI 染色のビュー。スケール バー = 1 ミリメートル。 (B)ウェルあたりのセル数の定量化。列 (上) とも、コロンバスのソフトウェアを使用して定量化されたあたりの 7 つのフィールドから行 (下) の井戸あたりのセル数の平均です。板全体平均セル数は 41,662 ± 3,366 SEM 細胞/ウェルです。井戸間に統計的有意差は認められなかった。テューキー事後検定と一方向の分散分析を用いて.<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2.jpg"> 図 3: 肝細胞マーカーの発現と 18 日 HLCs CYP P450 活性測定。(A)肝細胞核因子 4 α の割合(HNF4α) 式 ± SEM 30 井戸井戸あたり 10 フィールドのビューに基づいています。(B) SEM、+/-アルブミン (ALB) 式の割合は、ウェルあたり 10 のフィールドの表示と 3 つの井戸に基づいています。(C) SEM ± α フェトプロテイン (AFP) の割合は、ウェルあたり 10 のフィールドの表示と 3 つの井戸に基づいています。(D) E-カドヘリンの汚損。(E) CYP2D6 の汚損。(F) CYP3A4 の汚損。(G). 免疫グロブリン G (IgG) コントロールを染色します。スケールバー = 50 μ m (H) CYP 1 a 2 と 3 a 代謝内 P450 活性 HLCs 18 日目。6 生物複製 SEM. 活動 +/-が表すデータは蛋白 1 mg 当たりの相対的なライト ユニット (RLUs)/mL として引用されます。<a href="https://jove.unicartagenaproxy.elogim.com/files/ftp_upload/57995/57995fig3v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Semi-automated Production of Hepatocyte Like Cells from Pluripotent Stem Cells

このプロトコルでは、96 well プレート形式でひと多能性幹細胞からの肝細胞様細胞を生成する半自動化されたアプローチについて説明します。このプロセスは、迅速かつコスト効率の高い、品質の生産保証基礎・応用研究の肝細胞のような細胞のバッチを許可します。

多能性幹細胞からの細胞のような肝細胞の半自動化生産

Human pluripotent stem cells represent a renewable source of human tissue. Our research is focused on generating human liver tissue from human embryonic ...

semi-automated-production-hepatocyte-like-cells-from-pluripotent-stem

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K ビュー.  University of Edinburgh. このプロトコルでは、96 well プレート形式でひと多能性幹細胞からの肝細胞様細胞を生成する半自動化されたアプローチについて説明します。このプロセスは、迅速かつコスト効率の高い、品質の生産保証基礎・応用研究の肝細胞のような細胞のバッチを許可します。

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Defined and Scalable Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the human body. The differentiation of hPSCs to human hepatocyte-like cells (HLCs) has been extensively studied, and efficient differentiation protocols have been established. The combination of extracellular matrix and biological stimuli, including growth factors, cytokines, and small molecules, have made it possible to generate HLCs that resemble primary human hepatocytes. However, the majority of procedures still employ undefined components, giving rise to batch-to-batch variation. This serves as a significant barrier to the application of the technology. To tackle this issue, we developed a defined system for hepatocyte differentiation using human recombinant laminins as extracellular matrices in combination with a serum-free differentiation process. Highly efficient hepatocyte specification was achieved, with demonstrated improvements in both HLC function and phenotype. Importantly, this system is easy to scale up using research and GMP-grade hPSC lines&#160;promising advances in cell-based modelling and therapies.

The method presented here describes a scalable and good manufacturing practice (GMP)-ready differentiation system to generate human hepatocyte-like cells from pluripotent stem cells. It serves as a cost-effective and standardized system to generate human hepatocyte-like cells for basic and applied human liver research.

ヒト多能性幹細胞から肝細胞様細胞の定義され、スケーラブルな世代

Human pluripotent stem cells (hPSCs) possess great value for biomedical research. hPSCs can be scaled and differentiated to all cell types found in the ...

発生生物学

Using Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Hepatocyte-like Cells for Drug Discovery

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn errors in hepatic metabolism. However, to provide a platform that supports the identification of small molecules that can potentially be used to treat liver disease, the procedure requires a culture format that is compatible with screening thousands of compounds. Here, we describe a protocol using completely defined culture conditions, which allow the reproducible differentiation of human iPSCs to hepatocyte-like cells in 96-well tissue culture plates. We also provide an example of using the platform to screen compounds for their ability to lower Apolipoprotein B (APOB) produced from iPSC-derived hepatocytes generated from a familial hypercholesterolemia patient. The availability of a platform that is compatible with drug discovery should allow researchers to identify novel therapeutics for diseases that affect the liver.

The protocol presented here describes a platform for identifying small molecules for the treatment of liver disease. A step-by-step description is presented detailing how to differentiate iPSCs into cells with hepatocyte characteristics in 96-well plates, and to use the cells to screen for small molecules with potential therapeutic activity.

創薬における多能性幹細胞由来肝細胞様細胞を誘導人間を使用して

The ability to differentiate human induced pluripotent stem cells (iPSCs) into hepatocyte-like cells (HLCs) provides new opportunities to study inborn ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

ヒト多能性幹細胞の肝細胞への効率的な分化

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

Serum Free Production of Three-dimensional Human Hepatospheres from Pluripotent Stem Cells

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human embryonic stem cells (hESCs) and human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent promising sources of human liver spheres. We have developed a serum free and defined method of cellular differentiation to generate three-dimensional human liver spheres formed from human pluripotent stem cells. A potential limitation of the technology is the production of dense spheres with dead material inside. In order to circumvent this, we have employed agarose microwell technology at defined cell densities to control the size of the 3D spheres, preventing the generation of apoptotic and/or necrotic cores.&#160; Notably, the spheres generated by our approach display liver function and stable phenotype, representing a valuable resource for basic and applied scientific research. We believe that our approach could be used as a platform technology to develop further tissues to model and treat human disease and in the future may permit the generation of human tissue with complex tissue architecture.

This protocol describes an approach to produce hepatospheres from human pluripotent stem cells using a defined culture system and cell self-assembly. This protocol is reproducible in a number of cell lines, cost effective and allows the production of stable human hepatospheres for biomedical application.

多能性幹細胞からの3次元ヒト肝球の血清自由産生

The development of renewable sources of liver tissue is required to improve cell-based modelling, and develop human tissue&#160;for transplantation. Human ...

Robust Generation of Hepatocyte-like Cells from Human Embryonic Stem Cell Populations

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical studies are substantial, therefore it is essential that more predictive toxicology screens are developed and deployed early on in drug development (Greenhough et al 2010). Human hepatocytes represent the current gold standard model for evaluating drug toxicity, but are a limited resource that exhibit variable function. Therefore, the use of immortalised cell lines and animal tissue models are routinely employed due to their abundance. While both sources are informative, they are limited by poor function, species variability and/or instability in culture (Dalgetty et al 2009). Pluripotent stem cells (PSCs) are an attractive alternative source of human hepatocyte like cells (HLCs) (Medine et al 2010). PSCs are capable of self renewal and differentiation to all somatic cell types found in the adult and thereby represent a potentially inexhaustible source of differentiated cells. We have developed a procedure that is simple, highly efficient, amenable to automation and yields functional human HLCs (Hay et al 2008 ; Fletcher et al 2008 ; Hannoun et al 2010 ; Payne et al 2011 and Hay et al 2011). We believe our technology will lead to the scalable production of HLCs for drug discovery, disease modeling, the construction of extra-corporeal devices and possibly cell based transplantation therapies.

This article will focus on the generation of human hepatic endoderm from human embryonic stem cell populations.

ヒト胚性幹細胞集団から肝細胞様細胞の堅牢な生成

Despite progress in modelling human drug toxicity, many compounds fail during clinical trials due to unpredicted side effects. The cost of clinical ...

生物学

Integrative Protocol for Generation of iPSC-Derived 3D Human Hepatic Organoids

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) to generate 3D cultures of human hepatic organoids (HHOs). The utilization of HHOs offers a valuable approach to understanding liver development, unraveling liver diseases, conducting high-throughput studies for drug development, and exploring the potential for liver transplantation. In the former investigation, through immunofluorescence and quantitative RT-PCR techniques, the progression was monitored, identifying the presence of various cell populations, such as hepatoblasts and the two types of hepatoblast-derived cells: cholangiocytes or hepatocyte-like cells, across different developmental stages. This report presents a straightforward 3D protocol starting from hiPSC to acquire HHOs that mirror the stages of human embryo development. The protocol, spanning 46-50 days, encompasses several steps: (i) meticulous management of hiPSC culture to generate HHOs, (ii) initiation of cell differentiation in 2D and the subsequent transition to 3D, and (iii) an optimized dissociation strategy to break down HHOs into single cells for single-cell RNA sequencing. As an illustration of the broad applications of this approach, the present protocol was previously applied to unravel the role of thyroid hormone signaling in developing liver cells.

Human iPSC-derived 3D hepatic organoids constitute a potential tool for understanding the thyroid hormone's action on liver development.

iPSC由来3Dヒト肝臓オルガノイド作製のための統合プロトコール

Obtaining stable hepatic cells in culture poses a significant challenge for liver studies. Bearing this in mind, an optimized method is depicted utilizing ...

An Efficient Method for Directed Hepatocyte-Like Cell Induction from Human Embryonic Stem Cells

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug screening applications. Provided here is an efficient and reproducible method for differentiation of hESCs into functional HLCs. The establishment of an endoderm lineage is a key step in the differentiation to HLCs. By our method, we regulate the key signaling pathways by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE), followed by generation of hepatic progenitor cells, and finally HLCs with typical hepatocyte morphology in a stagewise method with completely defined reagents. The hESC-derived HLCs produced by this method express stage-specific markers (including albumin, HNF4&#945; nuclear receptor, and sodium taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP)), and show special characteristics related to mature and functional hepatocytes (including indocyanine green staining, glycogen storage, hematoxylin-eosin staining and CYP3 activity), and can provide a platform for the development of HLC-based applications in the study of liver diseases.

This manuscript describes a detailed protocol for differentiation of human embryonic stem cells (hESCs) into functional hepatocyte-like cells (HLCs) by continuously supplementing Activin A and CHIR99021 during hESC differentiation into definitive endoderm (DE).

ヒト胚性幹細胞からの肝細胞様細胞誘導の効率的な方法

The potential functions of hepatocyte-like cells (HLCs) derived from human embryonic stem cells (hESCs) hold great promise for disease modeling and drug ...

免疫・感染学

Hepatic Progenitor Specification from Pluripotent Stem Cells using a Defined Differentiation System

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to shortages in donor organ availability. Organ scarcity also affects the routine supply of human hepatocytes for basic research and the clinic. Therefore, the development of renewable sources of human liver progenitor cells is desirable and is the goal of this study. To be able to effectively generate and deploy human liver progenitors on a large scale, a reproducible hepatic progenitor differentiation system was developed. This protocol aids experimental reproducibility between users in a range of cell cultureware formats and permits differentiations using both, human embryonic and induced pluripotent stem cell lines. These are important advantages over current differentiation systems that will enhance the basic research and may pave the way towards clinical product development.

The goal of this article is to provide a standardized approach to induce human hepatic progenitor differentiation from pluripotent stem cells. The development of this procedure with ready-to-use media formulations offer the user a facile system to generate human liver cells for biomedical research and translation.

定義された分化系を用いた多能性幹細胞からの肝前駆体仕様

Liver disease is an escalating global health issue. While liver transplantation is an effective mode of therapy, patient mortality has increased due to ...

Automated Production of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cortical and Dopaminergic Neurons with Integrated Live-Cell Monitoring

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are prone to spontaneous differentiation into unwanted cell types. The methods are labor-intensive and are not easily amenable to large-scale experiments. To overcome these limitations, we developed an automated cell culture system coupled to a high-throughput imaging system and implemented protocols for maintaining multiple hiPSC lines in parallel and neuronal differentiation. We describe the automation of a short-term differentiation protocol using Neurogenin-2 (NGN2) over-expression to produce hiPSC-derived cortical neurons within 6&#8210;8 days, and the implementation of a long-term differentiation protocol to generate hiPSC-derived midbrain dopaminergic (mDA) neurons within 65 days. Also, we applied the NGN2 approach to a small molecule-derived neural precursor cells (smNPC)&#160;transduced with GFP lentivirus and established a live-cell automated neurite outgrowth assay. We present an automated system with protocols suitable for routine hiPSC culture and differentiation into cortical and dopaminergic neurons. Our platform is suitable for long term hands-free culture and high-content/high-throughput hiPSC-based compound, RNAi and CRISPR/Cas9 screenings to identify novel disease mechanisms and drug targets.

We show the automation of human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures and neuronal differentiations compatible with automated imaging and analysis.

ヒト人工多能性幹細胞由来皮質およびドーパミン作動性ニューロンの統合されたライブ細胞モニタリングによる自動生産

Manual culture and differentiation protocols for human induced pluripotent stem cells (hiPSC) are difficult to standardize, show high variability and are ...

<meta charset="utf8"></head><body>画像ベースML戦略による多能性幹細胞分化のモニタリング

A Live-cell Image-Based Machine Learning Strategy to Monitor Pluripotent Stem Cell Differentiation

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available PSC-to-functional cell differentiation systems are impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Precise control of cell differentiation in real time is therefore important. In this protocol, we describe a non-invasive and intelligent strategy that overcomes the variability in cell differentiation by using bright-field image-based machine learning. Taking PSC-to-cardiomyocyte differentiation as an example, this methodology provides detailed information for control of the initial PSC state, early assessment and intervention in differentiation conditions, and elimination of the misdifferentiated cell contamination, together realizing consistently high-quality differentiation from PSCs to functional cells. In principle, this strategy can be extended to other cell differentiation or reprogramming systems with multiple steps to support cell manufacturing, as well as to further our understanding of the mechanisms during cell fate conversion.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:生細胞明視野イメージングに基づくMLモデルを使用したPSCから機能細胞への分化の強化

Available pluripotent stem cell (PSC)-to-functional cell differentiation systems are currently impeded by problems of severe line-to-line and batch-to-batch variability. Here, using cardiac differentiation as the main example, we present a protocol to intelligently monitor and modulate the process of PSC differentiation based on image-based machine learning.

多能性幹細胞の分化を監視するための生細胞画像ベース機械学習戦略

Pluripotent stem cell (PSC) technologies have been widely used in drug discovery, disease modeling, and regenerative medicine.&#160;However, available ...