役に立つアドバイスや議論の優秀の UMass 糖尿病センターで β 細胞生物学グループより感謝します。ヒトの膵島は、によって、NIDDK 資金統合島配布プログラム (IIDP) 希望の都市で提供されていました。この作品 NIDDK/NIH によって資金が供給された: R01 DK114686 (LCA)、R01 DK105837 (CY)、2UC4DK098085 (IIDP) し、アメリカ糖尿病協会、アマランサスの順序とのコラボレーションで #1-15-BS-003 (LCA) を付与します。

動物を含むすべてのプロシージャは、マサチューセッツ州立大学付属学校機関動物医療および使用委員会によって承認されました。ヒトの膵島の研究は、被験者の使用を伴わないため IRB 審査または免除の対象とならないように UMass 制度審査会により決定しました。
1. 膵島の分離と培養
<ol><li>島を分離し、あなたの選択法を用いた膵外分泌と膵組織を汚染から分離します。 注: このメソッドは、コラゲナーゼ管注入と Ficoll 分離12 (齧歯類) または統合された膵島配布プログラム (IIDP13; 人間) から出荷後島によって分離島を使用して最適化されました。小島は、P200 ピペットで抜てきされました。</li>
	<li>膵島の形態を最適化するため一晩中 10 mL 完全な膵島 (10 %fbs、ペニシリン/ストレプトマイシン、5.5 モル/L のグルコースと RPMI) 37 ° C で 5% CO2を含む加湿チャンバー内を回復する島を許可します。この手順は、セクションを取得する必要はありません、小島がよりそのまま回復期間後 (図 2参照)。</li>
</ol>2. 膵島固定
<ol><li>低結合 p200 でもヒントを使用すると、約 250 のアイレット同等 (IEQ)13 1.5 mL 低結合および microfuge の管に顕微鏡下で校正グリッドを使用して手で摘みます。低結合ヒントやチューブは、膵島の損失を減らします。</li>
	<li>および microfuge の管の底に沈殿する島を許可します。任意の小島を削除しないように注意して、P200 ピペット先端部とほとんど上清を除去します。</li>
	<li>1 mL の PBS を追加します。速度 200 x g に達するまでスイング バケツ遠心管を遠心し、スピンを停止します。上澄みを除去します。2 洗浄の合計のため PBS 洗浄を繰り返します。</li>
	<li>10% ホルマリン溶液や焼きたての 4% のパラホルムアルデヒドの 500 μ L を追加します。30 分間室温で修正します。この方法でテストした結果、これらの固定方法は区別されました。短い固定も可能します。所期の固定期間を最適化することをお勧めします。</li>
	<li>P200 ヒントと定着剤を削除します。</li>
	<li>1 mL の PBS を追加します。速度 200 x g に達するまでチューブを遠心し、スピンを停止します。上澄みを除去します。2 洗浄の合計のため PBS 洗浄を繰り返します。</li>
	<li>次のステップに進んでください。</li>
</ol>3. 膵島ディスク (図 1) の準備
<ol><li>初回の使用で 70 ° C で (例えばHistogel) のゲルを溶かす、1.5 mL 長期貯蔵のための microfuge の管で因数を作る。因数は再利用することができますので、分注量は、重要ではありません。</li>
	<li>70 ° C に設定ヒート ブロックのゲルの因数を含むおよび microfuge の管を配置することによって 70 ° C でゲル (1 サンプルあたり約 100 μ L) を温める</li>
	<li>1.5 mL きれいおよび microfuge の管に青いアガロース ビーズ (サンプルごとに 10 μ L) を転送します。徹底的にピペットで移す前に、ビーズを再懸濁します。 注: 青いビーズ混合される agarose ボタンとパラフィン ブロックの埋め込み材料の視覚的な識別を支援する島。青ビーズの数が結果に重要ではありませんが、過剰なビーズを避けるため (> 小島の数 × 5) のセクションで小島の最適な配分を許可します。</li>
	<li>1 ml の PBS、青いビーズを 2 回洗います。各洗浄のため 800 × g で 1 分ビーズをスピンします。第 2 洗浄後 10 μ L の PBS、 nはサンプル チューブの数 x (n+2) のビーズを再懸濁します。たとえば、2 のサンプル チューブ、ビーズに追加する PBS のボリュームは 40 μ L でしょう。</li>
	<li>小島 (200 x g 簡単なスピン) を含むおよび microfuge の管を遠心し、上清のほとんどを取除きます。はさみや刃物で 10 μ L マイクロ ピペット チップの先端を切断し、各サンプルのきれいヒントを使用して、各膵管にビーズの 10 μ L を追加します。(島を失うことを避けるため) に混在させないでください。</li>
	<li>小島とビーズ (200 x g 簡単なスピン) を遠心します。ノーカットの 10 μ L マイクロ ピペット チップで可能な限り多くの PBS を削除します。</li>
	<li>顕微鏡スライド サンプル識別用ラベルです。2、3 のサンプルは、各スライドに用意できます。温めたジェルをヒート ブロックの近くのベンチにスライドを配置します。カミソリやハサミでサンプルごとの 20 μ L 低結合マイクロ ピペット ヒント 5 対 3 のヒントをカットします。マイクロ ピペット P20 2 急速な他に 1 つからの切り替えを許可するカットのヒントを読み込みます。</li>
	<li>温かいゲルの 15-20 μ L を加える最初のマイクロ ピペットを使用して、小島/ビーズおよび microfuge の管;すぐに混合、バブルを回避します。寒天/小島/ビーズ混合液をフォームにスライドに適用して、< 1 cm 径ディスク。外側のゲルのリングのためのスペースを残して、スライドの端の近くのディスク (次の手順)。優しく数回のスライドをタップすると、島とビーズを解決します。</li>
	<li>2 番目のマイクロ ピペットを使用して、サンプル チューブに温かいゲルの 20 μ L を追加します。スライドに元のディスクを取り巻くこの混合物を適用し最初マイクロ ピペット、ミックス、残り島/ビーズ、再熱ブロック地球温暖化固化、起動する場合新しいゲルを使用して。ディスクが必要な大きさと厚さになるまで、カット済みの追加のヒントを使用して、必要に応じて繰り返します。 注: は、外リングはわずかにより厚い場合、簡単にゼリー化したディスクの処理です。通常、ゲルの 3 x 20 μ L で十分です。この手順はチューブ洗浄によって島の損失を最小限に抑えるし、ディスクの処理を容易にするためにディスクの外側に膵島の貧しい agarose を追加します。</li>
	<li>各ディスクを個別に用意し、各スライドに複数のディスクを配置する場合サンプル順序の慎重な追跡。</li>
	<li>10 分または凝固するゲルまで、カバー付きのぬれた氷の平らな面にスライドを配置します。それはガラスからディスクをスライドに乾く場合に難しくなります。</li>
	<li>鉛筆で、1 つのサンプル処理/埋め込み組織カセット ラベル生検。青い紙の湿潤を避けるためにスライドの背面を乾燥させます。</li>
	<li>ガラスから自由に各方向にディスクをかみそりの刃の鈍いエッジを使用して、軽く押します。それは簡単にスライド、するとき青い画用紙に顕微鏡のスライドからディスクを押しゆっくりと。ディスク、平らな面を用紙に直接配置します。</li>
	<li>用紙カセットを移動しないように、ディスクをカセットに折り畳まれた紙に置いて閉じたりするディスク、ディスク、平らな折目を維持します。ディスクきれいにガラスをスライドされない場合より多くのゲルを追加および/または氷の数分以上のためにスライドを取得します。</li>
	<li>ビーカーに PBS でカセットが水没します。同じ日に最適な形態を埋め込むパラフィン プロセス。</li>
</ol>4. パラフィン包埋
注: 下記のとおり短縮脱水シリーズを使用してパラフィン ブロックにアイレット ゲル ディスクのプロセス。このテクニックは、自動のプロセッサを使用して最適化されたが、手動処理が同様の結果を生成する必要があります。
<ol><li>15 分の 85% のエタノールでカセットを浸します。</li>
	<li>95% エタノールでカセットを 15 分間浸します。</li>
	<li>100% エタノールでカセットを 15 分間浸します。3 つの洗浄の合計に 2 回繰り返します。</li>
	<li>キシレンのカセットを 15 分間浸します。3 つの洗浄の合計に 2 回繰り返します。</li>
	<li>溶融パラフィン カセットを 10 分間浸します。</li>
	<li>10-30 分の新鮮な溶融パラフィンにカセットを転送します。</li>
	<li>慎重にカセットを開き、青い紙の包みを開けます。紙に反対した平らな面の追跡、ゲルのディスクを削除します。小さい金型でダウン、切削表面に平行な (膵含む) 面とディスクを埋め込みます。プラグインのため慎重にカセットからそれを削除し、切削表面に向かって指している先端の小さな金型内に埋め込みます。</li>
</ol>5. パラフィン切片と染色
<ol><li>シリアル セクションが必要な場合は、スライドを順番にラベルします。</li>
	<li>経験豊富な histotechnologist カット 5 μ パラフィン セクションがあります。収量を最大にするには、物質を含むすべてのセクションを保存します。一般的には、20 のセクションを収集、材料のほとんどのキャプチャをことができます。</li>
	<li>室温でのセクションを格納します。セクションは、ルーチンの組織学的汚れ (例えば、 H & E) や蛍光抗体法 (例えば,インスリン, グルカゴンおよび DAPI) に適しています。必要な場合は、他の抗原の固定を最適化します。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kim, A., Miller, K., Jo, J., Kilimnik, G., Wojcik, P., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+architecture:+A+comparative+study.">Islet architecture: A comparative study.</a> Islets. 1 (2), 129-136 (2009).</li><li>Steiner, D. J., Kim, A., Miller, K., Hara, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+plasticity:+Interspecies+comparison+of+islet+architecture+and+composition.">Pancreatic islet plasticity: Interspecies comparison of islet architecture and composition.</a> Islets. 2 (3), 135-145 (2010).</li><li>Campbell-Thompson, M. L., Heiple, T., Montgomery, E., Zhang, L., Schneider, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Staining+protocols+for+human+pancreatic+islets.">Staining protocols for human pancreatic islets.</a> Journal of Visualized Experiments. (63), (2012).</li><li>Da Silva Xavier, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Cells+of+the+Islets+of+Langerhans.">The Cells of the Islets of Langerhans.</a> Journal of Clinical Medicine. 7 (3), (2018).</li><li>Sharma, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin+demand+regulates+&#946;+cell+number+via+the+unfolded+protein+response.">Insulin demand regulates &#946; cell number via the unfolded protein response.</a> The Journal of Clinical Investigation. 125 (10), 3831-3846 (2015).</li><li>Stamateris, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+Induces+Mouse+&#946;-Cell+Proliferation+via+IRS2,+MTOR,+and+Cyclin+D2+but+Not+the+Insulin+Receptor.">Glucose Induces Mouse &#946;-Cell Proliferation via IRS2, MTOR, and Cyclin D2 but Not the Insulin Receptor.</a> Diabetes. 65 (4), 981-995 (2016).</li><li>Blodgett, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+observations+from+next-generation+rna+sequencing+of+highly+purified+human+adult+and+fetal+islet+cell+subsets.">Novel observations from next-generation rna sequencing of highly purified human adult and fetal islet cell subsets.</a> Diabetes. 64 (9), 3172-3181 (2015).</li><li>Brissova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+human+pancreatic+islet+architecture+and+composition+by+laser+scanning+confocal+microscopy.">Assessment of human pancreatic islet architecture and composition by laser scanning confocal microscopy.</a> Journal of Histochemistry &amp; Cytochemistry. 53 (9), 1087-1097 (2005).</li><li>Joiner, K. S., Spangler, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+HistoGelTM-embedded+specimens+for+use+in+veterinary+diagnostic+pathology.">Evaluation of HistoGelTM-embedded specimens for use in veterinary diagnostic pathology.</a> Journal of Veterinary Diagnostic Investigation: Official Publication of the American Association of Veterinary Laboratory Diagnosticians, Inc. 24 (4), 710-715 (2012).</li><li>Cozar-Castellano, I., Takane, K. K., Bottino, R., Balamurugan, A. N., Stewart, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+beta-cell+proliferation+and+retinoblastoma+protein+phosphorylation+in+rat+and+human+islets+using+adenovirus-mediated+transfer+of+cyclin-dependent+kinase-4+and+cyclin+D1.">Induction of beta-cell proliferation and retinoblastoma protein phosphorylation in rat and human islets using adenovirus-mediated transfer of cyclin-dependent kinase-4 and cyclin D1.</a> Diabetes. 53 (1), 149-159 (2004).</li><li>La Fortune, K. A., Randolph, M. L., Wu, H. H., Cramer, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvements+in+cell+block+processing:+The+Cell-Gel+method.">Improvements in cell block processing: The Cell-Gel method.</a> Cancer Cytopathology. 125 (4), 267-276 (2017).</li><li>Alonso, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glucose+infusion+in+mice:+A+new+model+to+induce+beta-cell+replication.">Glucose infusion in mice: A new model to induce beta-cell replication.</a> Diabetes. 56 (7), 1792-1801 (2007).</li></ol>

著者の利害の衝突を宣言するあります。

この修正のゲル ディスク ベースの埋め込み法は、単純な安価なとセクションごとの島の高収率を生成する効率的な方法を提供します。フラットなガラス面にゲル ディスクを構築する明確に定義された領域に均等に分布拡散小島が容易になります。平らなディスクの小島を広めるセクションの平面の多くの小島を配置、歩留まりの最適化および使用される少ない島の利点を提供しています。?...

膵臓ランゲルハンス島、インスリンを循環の唯一のソースは、糖尿病を勉強して研究者のための重要な組織です。任意の特定の生物から可変サイズ、セル型の頻度、およびアーキテクチャ1,2,3島があります。体内構造と膵島内分泌細胞組成を研究する従来の戦略は、膵臓組織4,5をしきますです。以来、島は、合計膵細胞内容のごく一部を構成する、分子の研究は膵島で行われます。前のヴィヴォ膵島培養実験栄養素への応答、遺伝子の調節 (トランスフェクション、伝達)、または実験的治療内分泌細胞の生存・増殖・機能調節のメカニズムの重要な洞察を提供します。5,6。
膵島実験前のヴィヴォしばしば全体の島の分子研究または単層5,6で育った分散した膵島細胞の組織学的または分子の研究を使用して分析されます。全体の島の分子解析は、混在の細胞の種類は、任意の個々 のセル型に外挿する場合、偽陰性や偽陽性の結果が生じるの深刻な注意点を紹介します。後文化顕微鏡用カバーガラス上細胞分散細胞型特異結果測定できますが膵島建築介入への応答を変更することが、アーキテクチャ関連の成果の同定を排除します。通常の 1 つの結果だけ加えてを測定ことができる;たとえば、β 細胞の増殖と同じ条件下での β 細胞死を測定、2 つの個別の実験を実行する必要があります。これらのアプローチは、ブラインド間島変動、フィールドで注目のエリアにいます。細胞タイプ特異分子研究、または単一細胞 RNA 研究のフローサイトメトリーによる並べ替えの膵島細胞、組織の豊富なアーキテクチャの根絶とルーチンの携帯文化の分析にはあまり適していませんが高価、時間のかかる、限定がエレガントです5,7. 全体マウント immunostained 島の共焦点レーザー顕微鏡は高品質建築そのままのデータを提供しますが労働集約的、各サンプルから得られたデータは単一染色8で個人の成果に限られます。
後文化全体の島の高品質パラフィン セクションを生成する機能は、これらの懸念の多くに対処でしょう。高コスト、低豊富な膵島組織や人間の臓器提供者、または島の状態ポストの生体内または体外実験操作、ユニークな遺伝モデルから、貴重です。同じ島から複数のパラフィン切片を取得同じ実験から複数の細胞型特異、そのままアーキテクチャ解析できるようになります。
区分のための膵島のペレットを生成する既存の技術は完璧ではないです。組織に最適化されたアガロースはプロセス9しにくい小さなまたは断片化された組織サンプルを含む組織・細胞診標本の処理に広く使用されている水性低融点ゲルです。アプローチを埋め込み 1 膵島を微量遠心チューブに agarose の小島を中断、材料をペレット、寒天プラグを取得し、処理し断面10,11の埋め込む遠心分離機です。チューブの底から固化したサンプルを抽出は時間がかかり、困難なサンプルの時折の断片化とけがのリスクに 。小島はこのメソッドから取得したセクションで不十分な膵島の分布につながるプラグの先端に集中しています。プラグの丸底は、膵島の貧しい地域に区分を行うことなどを埋め込むことを複雑にします。全体的にみて、このメソッドは低降伏点と結果のセクションで周辺固定支持の膵島の分布に します。
この新しいメソッドは、膵島のセクションの準備のため簡体字および改善されたアプローチです。小島は少量で集中して、単一の平面を島と、小さなディスクを形成する顕微鏡スライドの滑らかな表面を配置します。Histogel 膵島ディスク短縮脱水とキシレン浸潤プロトコルを埋め込むパラフィンの処理が行われる。および microfuge の管の底に島を集中して、前のアプローチは、比較としても行われます。この新しい技術は各セクションで、膵島の分布セクションあたりの小島の収率が向上し、カセットに膵島ブロックを転送する時間がかかります。この手法は、膵島の生物学者のまたはそのネイティブの組織アーキテクチャの 1 つのサンプルに複数の結果を測定することによって低豊富な組織の生産性を最大化する希望組織の小片を勉強して他の科学者を使用しています。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.5 mL Eppendorf tube</td>
			<td>Norgen Bioteck Corp</td>
			<td>P/N 10113&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin Classic Starter Kit</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008708</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ranin ClassicPipette PR-2</td>
			<td>ShopRanin</td>
			<td>17008648</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (1000 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-430</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (200 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-412</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (20 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Low Binding Tip (10 &#956;L)</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>24-401</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Formalin solution</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>HT501128</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15710-S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heatblock</td>
			<td>VWR</td>
			<td>949312</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HistoGel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose blue beads- Affi-gel</td>
			<td>Bio-Rad</td>
			<td>153-7301</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dulbecco&#39;s PBS</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue processing cassette</td>
			<td>Simport</td>
			<td>M492-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bio-Wraps</td>
			<td>Leica-Surgipath</td>
			<td>3801090</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citadel 2000 tissue processor</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethanol 200 proof</td>
			<td>Decon Laboratories, INC</td>
			<td>2701</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Xylene</td>
			<td>Fisher Chemical</td>
			<td>X5SK-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraffin</td>
			<td>McCormick Scientific</td>
			<td>39503002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome</td>
			<td>Thermo-Shandon LLC</td>
			<td>Finesse ME+</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insulin antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0564</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glucagon antibody</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G2654</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoroshield with DAPI</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>F6057</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 594 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11076</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Alex fluor 488 secondary antibodies</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>A11001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

pancreatic islet embedding for paraffin sections

単離膵島を用いた実験は糖尿病の研究のために重要が、小島が高価で限られた豊かな。島を含む構造化されたアーキテクチャでは、関数に影響を与える混合セル人口、膵島広く細胞組成の変数です。培養膵島の研究が現在頻繁に使用される方法には、全体の島、客種異種膵島細胞の種類、一緒にまたは顕微鏡または分散膵島細胞の分子生物学の研究膵島建築を中断することで実行される分子の研究が含まれます。膵島研究生体内で膵臓のパラフィン包埋切片、細胞特異膵のネイティブ環境での成果を評価する強力な手法です。パラフィン切片で後文化島を勉強していくつかの利点を提供すること: 同じ島 (潜在的にも、正確な同じ島、連続切片を使用して)、セル型固有の測定維持するネイティブの複数の結果の検出膵島細胞間や細胞-基質間相互作用実験の露出の間におよび分析。ただし、埋め込みの既存技術は島後文化非能率的な時間のかかる、材料の損失になりやすいと一般的に役に立つ成果を定量化するために不十分な膵島番号を持つセクションを生成を分離しました。臨床病理学研究室細胞ブロック準備設備、アクセスできないと基礎研究所の実用的ではないです。堅牢な収量と膵島の分布のセクションを生成する改良、簡易ベンチ上メソッドを開発しました。固定の島は暖かい組織 agarose のゲルで再停止される、小島、飛行機で配布するように標準的なガラスのスライドでは、平らなディスクに戻します。標準的な脱水と埋め込み後、(10 +) 4-5 μ m 複数のセクションを同じ膵島ブロックからカットできます。このメソッドを使用して、マウス、ラットおよびヒト膵島の組織学的および免疫蛍光分析を実行できます。これ培養膵島から細胞型特異、そのまま建築の成果を評価するために効果的な安価な時間の節約方法です。

ゲル ディスクを準備する手順の図解図を図 1に示します。このゲル ディスク メソッド結果結果の意味のある定量化できるように 1 つの平面に分布する島の十分な数を含むパラフィン セクションで。図 2は、島セクションごと捕獲数を示すために結果として得られるセクションの低倍率の画像を示しています。一般に、> 35 ...

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Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

前のヴィヴォ膵研究、糖尿病研究のため重要です。ネイティブ 3 d アーキテクチャで培養膵島を研究する既存の技術は、時間がかかり、非効率的で、使用頻度の低いです。この作品は、全体培養膵島の高品質パラフィン セクションを生成するための新しい、シンプルで、効率的な方法を説明します。

パラフィン セクションの埋め込み膵島

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

pancreatic-islet-embedding-for-paraffin-sections

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

12.7K ビュー.  UMass Medical School. 前のヴィヴォ膵研究、糖尿病研究のため重要です。ネイティブ 3 d アーキテクチャで培養膵島を研究する既存の技術は、時間がかかり、非効率的で、使用頻度の低いです。この作品は、全体培養膵島の高品質パラフィン セクションを生成するための新しい、シンプルで、効率的な方法を説明します。

ビデオ: Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Murine Pancreatic Islet Isolation

マウス膵島単離

生物学

Immunohistochemistry: Paraffin Sections Using the Vectastain ABC Kit from Vector Labs

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific antibodies. There are two methods: the direct and indirect method. In this experiment, we will only describe the use of indirect IHC staining. Indirect IHC staining utilizes highly specific primary and biotin-conjugated secondary antibodies. Primary antibodies are utilized to discretely identify proteins of interest by binding to a specific epitope, while secondary antibodies subtract for non-specific background staining and amplify signal by forming complexes to the primary antibody. Slides can either be generated from frozen sections, or paraffin embedded sections mounted on glass slides. In this protocol, we discuss the preparation of paraffin-embedded sections by dewaxing, hydration using an alcohol gradient, heat induced antigen retrieval, and blocking of endogenous peroxidase activity and non-specific binding sites. Some sections are then stained with antibodies specific for T cell marker CD8 and while others are stained for tyrosine hydroxylase. The slides are subsequently treated with appropriate secondary antibodies conjugated to biotin, then developed utilizing avidin-conjugated horseradish peroxidase (HRP) with Diaminiobenzidine (DAB) as substrate. Following development, the slides are counterstained for contrast, and mounted under coverslips with permount. After adequate drying, these slides are then ready for imaging.

免疫組織化学：ベクターLabsからベクタステインABCキットを用いたパラフィン切片

Immunohistochemistry (IHC) is a valuable technique utilized to localize/visualize protein expression in a mounted tissue section using specific ...

Immunohistochemistry on Paraffin Sections of Mouse Epidermis Using Fluorescent Antibodies

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, suprabasal, and stratum corneum layers. The precise localization within the epidermis of a particular protein lends clues toward its functional role within the epidermis. In this chapter, we describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory. Paraffin sections generally provide much better morphology, hence, superior results and photographs; however, not all antibodies will work with the harsh fixation and treatment involved in their processing. Therefore, the protocol for frozen sectioning is also included. Within paraffin sectioning, two fixation protocols are described (Bouin's and paraformaldehyde); the choice of fixative will be directly related to the antibody specifications and may require another fixing method.

We describe a reliable method for immunolocalization within the epidermis modified for both frozen and paraffin sections that we use very routinely in our laboratory.

蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学

In the epidermis, immunohistochemistry is an efficient means of localizing specific proteins to their relative expression compartment; namely the basal, ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristic, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we have developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004, and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. Briefly, after cleaning the pancreas from the surrounding tissue, it was perfused with enzyme solution (Serva Collagenase + Neutral Protease or Sigma V enzyme). The distended pancreas was then transferred to the Ricordi digestion chamber, connected to a modified, closed circulation tubing system, and warmed up to 37&deg;C. During the digestion, the chamber was shaken gently. Samples were taken continuously to monitor the digestion progress. Once free islets were detected under the microscope, the digestion was stopped by flushing cold (4&deg;C) RPMI dilution solution (Mediatech, Herndon, VA) into the circulation system to dilute the enzyme. After being collected and washed in M199 media supplemented with human albumin, the tissue was sampled for pre-purification count and incubated with UW solution before purification. Purification process will be described in Part II: Purification and Culture of Human Islets.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part I: digestion and collection of pancreatic tissue) using a modified automated method.

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of ...

Human Pancreatic Islet Isolation: Part II: Purification and Culture of Human Islets

Management of Type 1 diabetes is burdensome, both to the individual and society, costing over 100 billion dollars annually. Despite the widespread use of glucose monitoring and new insulin formulations, many individuals still develop devastating secondary complications. Pancreatic islet transplantation can restore near normal glucose control in diabetic patients 1, without the risk of serious hypoglycemic episodes that are associated with intensive insulin therapy. Providing sufficient islet mass is important for successful islet transplantation. However, donor characteristics, organ procurement and preservation affect the isolation outcome 2. At University of Illinois at Chicago (UIC) we developed a successful isolation protocol with an improved purification gradient 3. The program started in January 2004 and more than 300 isolations were performed up to November 2008. The pancreata were sent in cold preservation solutions (UW, University of Wisconsin or HTK, Histidine-Tryptophan Ketoglutarate) 4-7 to the Cell Isolation Laboratory at UIC for islet isolation. Pancreatic islets were isolated using the UIC method, which is a modified version of the method originally described by Ricordi et al 8. As described in Part I: Digestion and Collection of Pancreatic Tissue, human pancreas was trimmed, cannulated, perfused, and digested. After collection and at least 30 minutes of incubation in UW solution, the tissue was loaded in the cell separator (COBE 2991, Cobe, Lakewood, CO) for purification 3. Following purification, islet yield (expressed as islet equivalents, IEQ), tissue volume, and purity was determined according to standard methods 9. Isolated islets were cultured in CMRL-1066 media (Mediatech, Herndon, VA), supplemented with 1.5% human albumin, 0.1% insulin-transferrin-selenium (ITS), 1 ml of Ciprofloxacin, 5 ml o f 1M HEPES, and 14.5 ml of 7.5% Sodium Bicarbonate in T175 flasks at 37&deg;C overnight culture before islets were transplanted or used for research.

Achieving high quality and appropriate quantity of human islets is one of the prominent prerequisites for successful islet transplantation. In this video, we describe step by step the procedures for human pancreatic islet isolation (part II: purification and culture of human islets) using a modified automated method.

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Computer-assisted Large-scale Visualization and Quantification of Pancreatic Islet Mass, Size Distribution and Architecture

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), and delta-cells (somatostatin) that are embedded in the exocrine tissues and comprise 1-2% of the entire pancreas. There is a close correlation between body and pancreas weight. Total beta-cell mass also increases proportionately to compensate for the demand for insulin in the body. What escapes this proportionate expansion is the size distribution of islets. Large animals such as humans share similar islet size distributions with mice, suggesting that this micro-organ has a certain size limit to be functional. The inability of large animal pancreata to generate proportionately larger islets is compensated for by an increase in the number of islets and by an increase in the proportion of larger islets in their overall islet size distribution. Furthermore, islets exhibit a striking plasticity in cellular composition and architecture among different species and also within the same species under various pathophysiological conditions. In the present study, we describe novel approaches for the analysis of biological image data in order to facilitate the automation of analytic processes, which allow for the analysis of large and heterogeneous data collections in the study of such dynamic biological processes and complex structures. Such studies have been hampered due to technical difficulties of unbiased sampling and generating large-scale data sets to precisely capture the complexity of biological processes of islet biology. Here we show methods to collect unbiased "representative" data within the limited availability of samples (or to minimize the sample collection) and the standard experimental settings, and to precisely analyze the complex three-dimensional structure of the islet. Computer-assisted automation allows for the collection and analysis of large-scale data sets and also assures unbiased interpretation of the data. Furthermore, the precise quantification of islet size distribution and spatial coordinates (i.e. X, Y, Z-positions) not only leads to an accurate visualization of pancreatic islet structure and composition, but also allows us to identify patterns during development and adaptation to altering conditions through mathematical modeling. The methods developed in this study are applicable to studies of many other systems and organisms as well.

Novel computer-assisted methods of large-scale procurement and analysis of immunohistochemically stained pancreatic specimens are described: (1) Virtual Slice capture of the entire section; (2) Mass analysis of large-scale data; (3) Reconstruction of 2D Virtual Slices; (4) 3D islet mapping; and (5) Mathematical analysis.

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

The pancreatic islet is a unique micro-organ composed of several hormone secreting endocrine cells such as beta-cells (insulin), alpha-cells (glucagon), ...

Yeast Colony Embedding Method

Patterning of different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms also display patterns of cell types. For example, in the yeast S. cerevisiae, sporulated cells and pseudohyphal cells are not uniformly distributed in colonies. The functional importance of patterning and the molecular mechanisms that underlie these patterns are still poorly understood.
One challenge with respect to investigating patterns of cell types in fungal colonies is that unlike metazoan tissue, cells in colonies are relatively weakly attached to one another. In particular, fungal colonies do not contain the same extensive level of extracellular matrix found in most tissues . Here we report on a method for embedding and sectioning yeast colonies that reveals the interior patterns of cell types in these colonies. The method can be used to prepare thick sections (0.5 &mu;) useful for light microscopy and thin sections (0.1 &mu;) suitable for transmission electron microscopy. Asci and pseudohyphal cells can easily be distinguished from ovoid yeast cells by light microscopy , while the interior structure of these cells can be visualized by EM.
The method is based on surrounding colonies with agar, infiltrating them with Spurr's medium, and then sectioning. Colonies with a diameter in the range of 1-2 mm are suitable for this protocol. In addition to visualizing the interior of colonies, the method allows visualization of the region of the colony that invades the underlying agar.

A method for embedding yeast colonies allowing sectioning for light and electron microscopy. This protocol allows determination of the distribution of sporulated cells and pseudohyphal cells within colonies providing a new tool toward understanding the organization of cell types within a fungal community.

酵母のコロニーの埋め込み法

Patterning of  different cell types in embryos is a key mechanism in metazoan development. Communities of microorganisms, such as colonies and biofilms ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Probe-based Real-time PCR Approaches for Quantitative Measurement of microRNAs

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that provides an accurate and reproducible analysis. Probe-based chemistry offers the least background fluorescence as compared to other (dye-based) chemistries. Presently, there are several platforms available that use probe-based chemistry to quantitate transcript abundance. qPCR in a 96 well plate is the most routinely used method, however only a maximum of 96 samples or miRNAs can be tested in a single run. This is time-consuming and tedious if a large number of samples/miRNAs are to be analyzed. High-throughput probe-based platforms such as microfluidics (e.g. TaqMan Array Card) and nanofluidics arrays (e.g. OpenArray) offer ease to reproducibly and efficiently detect the abundance of multiple microRNAs in a large number of samples in a short time. Here, we demonstrate the experimental setup and protocol for miRNA quantitation from serum or plasma-EDTA samples, using probe-based chemistry and three different platforms (96 well plate, microfluidics and nanofluidics arrays) offering increasing levels of throughput.

Circulating microRNAs have recently emerged as promising and novel biomarkers for various cancers and other diseases. The goal of this article is to discuss three different probe-based real-time PCR platforms and methods that are available to quantify and determine the abundance of circulating microRNAs.

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

Probe-based quantitative PCR (qPCR) is a favoured method for measuring transcript abundance, since it is one of the most sensitive detection methods that ...

パラフィンセクションの埋め込み膵島

要約

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マウス膵島単離

免疫組織化学：ベクターLabsからベクタステインABCキットを用いたパラフィン切片

蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と文化

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

酵母のコロニーの埋め込み法

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

パラフィン セクションの埋め込み膵島

要約

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マウス膵島単離

免疫組織化学：ベクターLabsからベクタステインABCキットを用いたパラフィン切片

蛍光抗体を用いたマウス表皮のパラフィン切片で免疫組織化学

人間の膵島単離：パートI：膵組織の消化とコレクション

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と​​文化

のパラフィン包埋して凍結切片ショウジョウバエアダルトの筋肉

膵島質量、サイズ分布とアーキテクチャのコンピュータ支援大規模可視化と定量化

酵母のコロニーの埋め込み法

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

プローブベースのリアルタイムPCRは、マイクロRNAの定量的測定のためのアプローチ

パラフィンセクションの埋め込み膵島

人間の膵島単離：パートII：ヒト膵島の精製と文化