Name: phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
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彼らの科学的なサポート、ジェニファー フェイントをかけるとウルシュラ Zarzenska に感謝します。この仕事はキャリア統合許可 (CIG、PCIG14-ジョージア州-2013-63 0734) 第 7 フレームワーク プログラム、LFF GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung ハンブルク)、グラントと DFG グラント (DFG KE 856_6-1) 内にある欧州委員会によって財政上支えられるJK に授与。

1. サンプリングやナタネから師管液の準備植物4,8,20
<ol><li>サンプリング、師部樹液植えた 8 週齢を使用してナタネ植物花粉の汚染を防ぐためにそのショーの唯一の初期開花。</li>
	<li>注射針を使用して (Ø 0.8 mm) および点状花房茎数回。いくつかの他の花房の茎と十分な師部 sap (図 2 a) を取得する他の植物を繰り返します。 メモ: 複素解析の勧め師部樹液の少なくとも 600 μ L で開始します。4 に 5 の植物師管液の 200 と 700 μ L の間になります。</li>
	<li>ろ紙を負傷したサイトから最初のドロップをふき取りなさい。これらの低下は主に負傷した組織の周囲から高汚染物質を含むし、破棄する必要があります。</li>
	<li>ピペッティングで次の滴を収集し、凍らない冷却システムを用いた-20 ° C であらかじめ冷やして円錐 1.5 mL の反応管内の収集した滲出液を格納します。</li>
	<li>さらにドロップ形成される観察可能なしかし、もはや 1 時間以上まで収集を継続します。収集した師管液の重要な損失することがなく 2 日後、この手順を繰り返すことができます。 注: 収集した師管液することができますすぐに使用または将来の分析のための-80 ° C で保存します。-80 ° C のストレージの衝撃-凍結反応チューブ液体窒素で。</li>
	<li>分子量 10,000 ダルトン (Da) のカット (MWCO) を用いた遠心コンセントレーター最初のボリュームの約 1/6thに師部サンプルを集中します。4 ° C とダスト粒子を除去する、少なくとも 15 分間 20,000 × g の集中のサンプルを遠心します。 注: 師部 sap 濃度は蛋白質の低下にはつながらない。</li>
	<li>その後の複雑な分析手順 3.1 に進みます。</li>
</ol>2. 師部 sap 純度制御逆転写 PCR (RT-PCR) 4,8,20を使用して
<ol><li>師管液液体材料の標準的な RNA 抽出法を使用してからの総 RNA の隔離 (例えばTRIzol またはフェノール-クロロホルム抽出に続いた水相洗浄手順によるとエタノールからイソプロパノールの沈殿物によって、製造元のプロトコル)。 注意: フェノール クロロホルムは有毒です。適切な個人的な保護装置のフードの下で動作します。6 ヶ月間-80 ° c のエタノールで抽出した RNA を保存できます。</li>
	<li>DNA の DNase と消化による汚染を削除私は 37 ° C で 45 分間 (1 u/μ g) EDTA を最終濃度 5 mM に追加することによって、酵素を不活性化し、75 ° C 10 分でサンプルをインキュベートします。</li>
	<li>純粋な RNA 浄化し、もう一歩浄化 (例えばRNA のクリーンアップ キット、製造元の指示に従ってを使用して) このサンプルを集中します。</li>
	<li>逆転写 PCR (RT-PCR) を共演 150 を使用して cDNA 合成キット cDNA の合成純粋な RNA の ng はメーカーで指定されているプロトコル 's。 注: cDNA は-20 ° C でさらに使用するまで格納できます。</li>
	<li>コンパートメント特定の成績証明書を増幅し、アガロース電気泳動でチェックにテンプレートとしての製造元によって指定された標準 PCR の反作用のための cDNA の 5 μ L を使用します。例えば rubisco 小サブユニット、チオレドキシン h、および花粉外被蛋白質 (表 1図 1 b) のプライマーを使用して篩部試料の純度を確認してください。</li>
</ol>3. 青ネイティブ ページ4,25,26,31
<ol><li>27または商業 Bis トリス グラデーション ジェルに従って別の場所でどちらかの自己注がれたネイティブ勾配ゲルを使用します。</li>
	<li>負荷のゲルのウェルあたり高濃度タンパク質サンプルの 20 に 30 μ g を少なくともトリプリケートします。</li>
	<li>4 ° C および 150 V でゲルを実行サンプル (約20 〜 30 分、図 3 a) ゲルの 1/3rdを渡されるまで、暗い青カソード バッファー B と陽極バッファー (表 2) を使用しています。 注: 北しみが付くこと、単一ゲル レーンで十分中、3 D ページおよびより少なく豊富な蛋白質を集中する最大 10 個のゲル レーンから同じバンドを組み合わせることをお勧めは質量分析によるタンパク質組成分析のためです。</li>
	<li>光青カソードと交換暗い青陰極バッファー B B/10 (表 2) をバッファーの実行や、実行を一時停止します。ゲル (ca. 120 に 180 分、図 3 a) ゲルから溶出するブルーのフロントの起動時に実行を終了します。 注: 完成した青ネイティブ ゲルは 4 ° C で少なくとも 1 週間保存できます。長期の保管はバンドをびまん性につながることができ、避けるべきであります。暗い青バッファー B は再利用できます。</li>
</ol>4. ブルー ネイティブ北しみが付く4を使用して RNA を検出するオプション:
<ol><li>明瞭なバンドをカット、ネイティブ ブルージェルから全体のゲルのレーンを使用または半乾燥する 60 分の 3.5 mA/cm2でしみが付くことによってナイロン膜にそれらを転送し、膜 (図 4 a) に鉛筆で上限と下限のゲルの境界線をマークします。</li>
	<li>ブロッティング後 DEPC 処理水の膜を洗浄し、2 つのフィルター ペーパーの乾燥します。</li>
	<li>120,000 μ J/cm2でブロッティング膜の紫外架橋を実行 (85 sテーブルの材料で、架橋剤を使用している場合)。</li>
	<li>前ハイブリダイゼーション オーブン (図 4 a) で 68 ° C で 60 分間交配バッファー (市販または自作) の 6 mL で膜を交配させます。</li>
	<li>3'-ビオチン化プローブの 4 μ L を含む交配バッファーの追加 1 mL を追加 (100 nM)。</li>
	<li>37 ° c. に 68 の ° C からオーブンを冷却しながら一晩、プローブと膜を孵化します。</li>
	<li>不特定にバインドされているプローブを削除する部屋の温度で 5 分間、2 x SSC と 0.1 %sds を格納するバッファーで膜を洗浄します。 注意: SDS は、炎症を引き起こす可能性が。SDS とソリューションを含む SDS を使用するときは、手袋、白衣を着用します。</li>
	<li>西洋わさびペルオキシダーゼ (HRP) 基板、高感度化学発光反応 (図 4 a) の結果として、膜などストレプトアビジン-HRP-共役とルミノールの 3'-ビオチン化プローブの検出を実行します。</li>
</ol>5. 2 番目の寸法: トリス トリシン尿素ページ4,28
<ol><li>青ネイティブ ゲルから単一のバンドを切除します。さらに複雑なタンパク質 (図 5) 濃度を達成するために車線を並列で実行サンプルからバンドを結合します。 注: 摘出バンドに格納できる単一反応管 4 ° C でさらに使用するまで</li>
	<li>12% トリス トリシン尿素ゲルを注ぎなさい (厚さ 1 mm、6.8 × 8.6 cm (幅 × 長さ))。(表 2)、分離ゲルのゲル溶液の 10 mL を準備 2 つのガラス板とイソプロパノールとオーバーレイの間注ぐ。重合終了後、イソプロパノールを取り外し、ゲルと、10 もくし挿入にスタッキングのゲルのゲル液 B (表 2) の 4 つの mL。 注意: 未重合アクリルアミドは神経毒性することができます、TEMED 吸入すると有害。常に個人保護具を着用し、フードの下で働きます。</li>
	<li>1.5 mL の反応管に摘出したゲルのバンドを転送し、ゲル部分 (図 5表 2) 平衡の SDS サンプルバッファー x 2 の 1 mL を追加します。<ol>
<li>暖房のブロック (95 ° C) または電子レンジで沸騰する前に、室温で 10 分間のサンプルをインキュベートし、さらに 15 分の室温で再度サンプルをインキュベートします。</li>
		<li>1 つの単一のゲルのポケットに同じ建物を表すいくつかの平衡ゲル部分をスタックします。</li>
		<li>アノードとカソード 45 ~ 60 分の 150 V でバッファーを実行するを使用して電気泳動を行い、全体のゲル レーンを消費税します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>酸性バッファー (100 mM 100 mM 酢酸トリス) で 20 分間カット レーンをインキュベートし、125 mm トリス-HCl、別の 20 分 (図 5) の 6.8 pH 平衡します。</li>
</ol>6. 3 次元: SDS ページ4,32
<ol><li>塩化物イオンと32によるとゲルの分離 15 %sds を注ぐ (厚さ: 1.5 ミリメートル、6.8 × 8.6 cm (幅 × 長さ)) (表 2)、ゲル上のスタック 4% の薄い層を追加。 注意: SDS、アクリルアミド、TEMED が有毒、有害であります。フードの下で働くし、個人用保護具を着用します。</li>
	<li>SDS ゲルの平衡ゲル レーンを転送し、ブロモフェノール ブルー (図 5) の微量を添加したバッファーを実行する 1 x SDS の 0.5% (w/w) agarose のゲルをカバーします。</li>
	<li>電子レンジでの agarose が付いてのバッファーをゲルにロード前に実行中の SDS を沸騰させます。</li>
	<li>単一成分の分子量を推定するためのタンパク質マーカーを実行、agarose が固化するまで一枚のゲルの 1 つの端にフィルター紙を挿入または通常 IPG ゲルに使用されます特殊な櫛を使用します。</li>
	<li>150 V 60 分と汚れでゲルを実行コロイド Coomassie、銀染色のいずれか、またはその他のゲル染色法以降の質量分析に適した。</li>
	<li>分析のようなマトリックス支援レーザー脱離イオン化質量分析法によるアプローチを使用して目に見える蛋白スポット飛行時間 (MALDI-TOF) やクロマトグラフィー-タンデム質量質量分析法。 注: 染色としてすでに記載されている33コロイド Coomassie を使用する勧めします。私たちの手でより豊富な蛋白質十分に染色することができますを使用することができ、合理的なデータ品質の質量分析。</li>
</ol>

<ol>
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Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li><li>Ham, B. -. K., Brandom, J. L., Xoconostle-C&#225;zares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypyrimidine+tract+binding+protein,+pumpkin+RBP50,+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex.">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. 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著者が明らかに何もありません。

師部は高利のコンパートメント、深水の主要交通ルートを構成する、別の植物の部品9,20,34、間長距離シグナル伝達に必須でも 35。小さな分子に加えてタンパク質と Rna のような高分子は師部メンテナンスとシグナリング4,7,8関与しています。師部組成の分析は、ほとんど植物の師部サンプルに限られたアクセシビリティによって制限されます。昆虫スタイレット手法は広く適用が実験的に厳しいと師部サンプル11の非常に少量の結果します。師部をサンプリングするために使用される 1 つの簡単なテクニックは、EDTA 促進溶出12です。EDTA はカルシウムのような二価イオンをキレートおよび P 蛋白質およびカロースによる篩板の閉鎖を防止すること。それは使いやすいが、損傷した細胞による汚染しやすい、サンプルを希釈します。EDTA による二価イオンの破壊も、既存の複合体の破壊に 。ただし、それはモデル植物シロイヌナズナ15を含む種の広い範囲からのサンプリングができます。師部樹液の自発的な滲出物は、植物種の小さい数でのみ発生します。植物組織10の重大な傷害を伴う侵襲的な方法です。我々 は最近の長距離輸送4,8,20を研究モデル種としてナタネを設立しました。ここで、師管液楽しめます小さな切開から負傷の影響と汚染源を軽減できます。
別のサンプリング技術を使用して、別の植物種から採取された師部のプロテオームを近年7,8,17,36,37,で検討されている38,39。これらのプロテオーム研究蛋白質で抽出、条件の変化の下で沈殿蛋白質: 蛋白質および蛋白質についての結論を許可しないため、: 核酸相互作用が原産の条件の下に存在します。Co-免疫沈降 (CoIP) とオーバーレイの試金示されるカボチャ40、師部樹液の主要なリボ核蛋白質の複雑ながありますが、内のネイティブの条件の下で任意の高分子複合体が存在することを認められなかった、師部システム。
Schäggerらによって導入された、青ネイティブ ページ26日以降高解像度ゲル電気泳動手順との組み合わせでは、大規模なタンパク質複合体の個々 のコンポーネントの分離を有効にします。ネイティブナタネの 3 D ページ解析を使用して, 篩部の滲出液が最近ことを示すいくつかの高分子量蛋白質: 蛋白質と RNP 複合体師部サンプルに存在が酵素によって実行中4。サイズ排除クロマトグラフィーのような蛋白質の複合体として結合を分離する方法は存在するが、BN ページと比較した場合は解像度の面で失敗する可能性があります。さらに、複雑な分離の合理的な品質、サイズ排除列行列は調査されている全体的な複雑な分子量に応じて対応しなければなりません。異なるサイズの複合体を分析、したがって集中的なコストは、BN ページとして高い焦点を力として可能にしない列の種類を要求します。
ナタネから複合体を分析するための重要なステップは、師管液の開始材料として使用を含めます。師部サンプルの少なくとも 600 μ L 必要し、5 つ植えた植物から得られます。3 D ページおよび BN 北しみが付くことの師部サンプルの十分な量の初期の BN ゲルを開始する必要が。これを達成するには、師部サンプル集中している蛋白質の 20 に 30 μ g は、よく、少なくともそれぞれに読み込まれることができますまで並列で実行される同じサンプルのトリプリケートします。低すぎるか高すぎる濃度を減らす複合体 (図 3) の検出。師部のサンプルは、氷の上の反応管に収集する必要があります、タンパク質分解と売り上げ高を避けるために後で使用できるフリーズされて保存されるべきであります。プロテアーゼ阻害剤は、すべて師部プロテオーム解析で発見されているが、ナタネ4の師部の完全にアクティブなプロテアソームがまた記述されていた。さらに、ボリュームと師部サンプル組成依存サンプリング時点で環境条件10。したがって同じような条件の下で一日の同じ時間で収集するためには注意が必要があります。ストレス治療 (干ばつなど) は収集できる師部の量を減らすことができます。質量分析法による単一蛋白質を識別するために、すべての時間の手袋を装着して可能なケラチン汚染を制限する必須です。ケラチンは質量スペック解析時に追加の信号につながるし、タンパク質の同定を妨げません。高電圧や周囲温度で BN ページで実行すると、壊れやすい複合体の分解が生じるゲルの加熱につながります。
ここで提示されたプロトコルは蛋白質: 蛋白質複合体の解析に適しています。また、使用と並列の複合体に含まれている特定の Rna を検出できますが.これを達成するには、最近 BN 北部4しみが付くことのためのプロトコルを導入しました。Rna は、RNAse 汚染による劣化になりやすいです。このような劣化を抑える DEPC 処理水使用してください。
本手法の主な制限は、移行動作サイズ、形状とも複合体31、翻訳後修飾によって異なりますので BN-PAGE - で区切られたタンパク質の分子量の推定 41。RNP 複合体のサイズ推定は移行挙動に及ぼす核酸が原因も複雑です。それも防止できない同じサイズの複合体は共同 1 つの単一バンドに移行。これは複雑な組成の誤った予測につながることができます。例えば機能アッセイ4、したがって、相補的な手法で観測された相互作用を検証するは必要で 。蛋白質だけ弱いか一過性高分子複合体に関連付けられている使用される BN バッファー失われる可能性があります。これを避けるためには、サンプルが架橋、成果物につながることができますか、タンパク質同定を防ぐことができるまたはバッファー条件を最適化することができます。
古典的な 2 D のページとは対照的組み合わせ尿素-SDS-PAGE の疎水性と等電点 (pI) と分子量28ではなく分子量に従って分離し、蛋白質の分離は制限されません、特定の pI の範囲です。古典に類似した 2 D ページ、分離タンパク質シングル スポットとして表示されますが、対角線上線4,28 (図 5, 図 6)。ライン28下より親水性タンパク質が見つかったに対し、この対角線上のスポットで多くの疎水性タンパク質が表示されます。このプロトコルで使用されるポリアクリルアミド濃度は 25 に 80 kDa のタンパク質をよく分離されます。小さいまたは大きいタンパク質の分離、ポリアクリルアミドを許可するように濃度を変えることができるまたは勾配ゲルを 3 番目のディメンションで使用できます。3 D ページ (図 6) で区切られた複雑な IV (図 3) のコンポーネントは、トリプシン消化、および質量分析法による分析をカットされました。これは、いくつかの tRNA のリガーゼの特定につながった。他の複合体のコンポーネントをされている最近、 4を公開します。当社の 3 D ページには、異なるリガーゼ、すなわちアスパラギン酸、アスパラギン、スレオニン、リジン、グリシンのリガーゼ、同じような分子量 (表 3) との分離が有効になります。メチオニン tRNA 特定プローブを使用して、我々 は複雑な IV 内可能性がありますバインドされた tRNA を検出することができたが、フルレングス tRNA または tRNA 断片が、複雑な場合は使用プローブと差別されることはできません。プロテアーゼ消化師部 sap である核酸は本当にコンプレックス内連結および共同移行ではない場合、チェックするには、サンプルは適切なマイグレーション制御として役立つかもしれない。
それは師部篩管内でタンパク質翻訳することができます行われる師部サンプル4,7で伸長因子と同様、全体のリボソームのほとんどのコンポーネントが検出されましたので以前推測されています。TRNA と tRNA のリガーゼの私達の見つけることはこの考えを支持するようです。しかし、カボチャから篩部のサンプルで現在の tRNA 断片が翻訳42の強力な阻害剤に示されている、機能的なリボゾーム欠席4翻訳が場所を取ることができないことを示唆するように見えます。
一緒に取られて、ここで提示されたプロトコルは、高解像度の個々 のコンポーネントのネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルと分離からも RNP 複合体の分離と同定をことができます。このメソッドのアプリケーションは新規タンパク質と師部サンプル RNP 複合体の検出を有効し、したがってこの専門性の高い工場区画の新機能を解明することができます。

師部の長距離導管高等植物の有機性栄養素の配分に欠かせないが成長と発展、病原体の防御と悪影響への適応の重要な多くの異なるプロセスに関与するも環境条件。イオン、植物ホルモン、または自分自身の代謝物のような小さなエフェクタは、ほかのタンパク質と Rna のような高分子最近潜在的な信号として浮上しています。
研究は、蛋白質の師部読み込みがサイズ依存と伴細胞 (CC) の接続孔 plasmodesmal 単位のサイズ排除限界 (SEL) で制御したことを示されているふるいの要素 (SE) に 10 の範囲に通常ある、> 67 kDa の1,2,3しかし、にもかかわらずこれらのサイズ制限より大きい蛋白質および蛋白質の複合体は、サイズ排除4のアイデアに挑戦師部システム内発見されている、推奨5 、CC からタンパク質が SE にも非特異的失われて。.
物質として大きなリボ核蛋白質複合体は、生合成・ セル6の構造の整合性の維持に極めて重要な役割を再生します。4、7を師部携帯タンパク質とリボ核蛋白質複合体に存在する証拠があるが、その機能についてはほとんど知られている日付に。篩ふるいの要素: タンパク質と RNP 複合体が関与している長距離輸送および/または信号8,9。その組成変動を受ける環境を勉強して転体の機能の解明や、ストレス条件が必要です。そのためには、ネイティブ複合体を分離する必要があり、そのコンポーネントは、十分な解像度と分離しなければなりません。
師部から高分子量複合体を分離、十分な質と量の sap サンプルを取得するの先決です。師部をサンプリングするために使用できる手法は、興味の植物種に依存します。師管液を取得する 3 つの主な方法存在10: 昆虫 stylectomy11、EDTA 促進溶出12、および自発的な滲出物13。
シロイヌナズナ(a)、研究所、世界中で主要なモデル プラントからの師部のサンプルは、EDTA 促進溶出やアブラムシ stylectomy14,15でのみ取得できます。両方のメソッドは、非常に希釈師部 sap または非常に低いサンプル量に します。EDTA 促進溶出も汚染しやすい、実際師部組成16を表さないことがあります。自発師部滲出物は、植物の部分を切断は簡単に収集した13,17,18をすることができます師部樹液の自然放出につながる、ウリ、ルピナス、ユッカなど植物に限定 19。我々 は最近篩分析のための適切なモデル システムとしてナタネ (ナタネ) を設立、シロイヌナズナの近親と師管液のいくつかマイクロリットルを示されている小切開から取得できますので高純度4,8,20であります。さらに、ナタネのゲノム塩基配列は 2014年21にリリースされました。
アブラムシの stylectomy を除いて説明すべての師部コレクション方法は周囲のサンプリング、現場組織の損傷を含めるし、師管液の組成は、損傷に応答変更可能性があります。したがってサンプリング法に関係なく、師部サンプルの品質をチェックする不可欠です。例えばRNase 活動22,23Rubisco8,24プライマーと PCR または砂糖の分析による決定により収集された師部 sap の品質管理のさまざまな方法があります。組成8。
サイズ排除クロマトグラフィー、ショ糖密度遠心明確な分子量カット膜によるサンプルろ過などを分離し、タンパク質複合体を分離するさまざまな方法を適用できるトレードオフです。ただし、これらのアプローチは高解像度を許さない。最初 Schäggerらによって記述された青ネイティブ ページ (BN-PAGE) と呼ばれる手法。25日は解像度の面で優れています。それは正常に様々 な細胞小器官や細胞可溶化物の相対的な存在量26,27から大規模なネイティブ タンパク質の分子量を決定するため使用されました。
さらにタンパク質の複雑な組成の解明、複雑な部品の完全な分解につながる条件の変化の下で個々 のコンポーネントを分離する必要は。これは SDS ページ28,29またはより高い解像度を実現、等電集中 (IEF) の 2 番目の次元で続いて SDS ページ30の third dimension との識別をその後に 2 番目の次元によって達成することができます。質量分析法を用いたタンパク質。
このプロトコルでは、ナタネ植物から純粋な師部樹液の採取・ BN-PAGE-トリス-トリシン-尿素-ページおよび SDS のページを組み合わせて 3 D 電気泳動のアプローチを使用してこのような師部サンプルからタンパク質複合体の分析について説明します。複雑なコンポーネントは、質量分析法による識別されますその後分離されたタンパク質。さらに、紹介するブルー ネイティブ北しみが付くこと大きい RNP 複合体4Rna の検出を許可する方法としてアプローチの適用性を拡張します。

<table><tbody><tr><td>1.5 mL reaction tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96 % Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium peroxodisulfate (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal concentrators &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography papers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging system &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Heating block TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; GFL Hybridization Incubator 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle (0.8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG gel comb, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Labeling of RNA &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;Biotin 3&#039;end DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Native gradient gel &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Novex NativePAGE 4&amp;ndash;16% Bis-Tris protein gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nylon membrane &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-phosphoric acid</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler prestained protein ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Power supply for Gel electrophoresis EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>available from GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot &lt;em&gt;e.g&lt;/em&gt;. Fastblot 43B semi dry Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Synthesis of cDNA &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate dihydrate</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Vertical electrophoresis apparatus &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System</td><td>Thermo Fisher Scientific or BioRad</td><td>EI0001 or 1658004</td><td></td></tr><tr><td>Wipers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; KIMWIPES Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes

高等植物の篩管液をサンプリング、しばしば骨の折れると植物種に大きく依存。ただし、別の植物種の変性条件下のプロテオーム研究を達成できます。ネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質: 師部のサンプルから核酸複合体、まだやっとのことで分析されているこの特殊な区画の維持または長距離シグナル伝達で重要な役割を果たしている可能性が。大きな分子は、青ネイティブ ゲル電気泳動法 (BN] ページ) を使用して分離できます。その後ナトリウム ドデシル硫酸ページ (SDS-PAGE) による、タンパク質成分を分離できます。ただし、同じような分子量が付いている蛋白質共同移行、質量分析法によるタンパク質の同定を妨げることができるか。BN-PAGE-を組み合わせて 2 つ異なる変性ゲル電気泳動手順、すなわちトリス トリシン尿素と SDS ページの親水性/疎水性に従ってタンパク質を追加分離できます、解像度と成功を増やしますタンパク質同定。それも違いだけで、翻訳後修飾タンパク質を区別することができます。さらに、高分子複合体の RNA コンポーネントを識別するには、青いネイティブ北しみが付くことを適用できます。我々 のプロトコルが蛋白質およびネイティブ蛋白質: 蛋白質および師部のサンプルで発生するリボ核タンパク質 (RNP) 複合体の RNA 成分の解明に適していることを示します。青を組み合わせること 2 つの異なる変化ページ手順でネイティブ ページは異なった種類の大きい蛋白質の複合体を分離することができ、質量分析法による部品の高められた識別率ができます。さらに、プロトコルは同時に 1 つの蛋白質の複合体の内で潜在的にバインドされている核酸を検出する十分な堅牢です。

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タンパク質およびリボ核タンパク質複合体の 3D-PAGE のためのアブラナ属セイヨウアブラナからの師部樹液のサンプリング |生物学 |ビデオ

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2 つのページを持つ。

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

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Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

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13.7K ビュー.  Universität Hamburg. 大規模なネイティブ蛋白質: 蛋白質および蛋白質の蛋白質組成を分析するためのプロトコルの紹介: ナタネから核酸複合体 (ナタネ)ブルーを組み合わせて 3 D ポリアクリルアミドゲル電気泳動 (ページ) アプローチを使用して篩部の滲出液ネイティブ (BN) 質量分析による同定が続く変化の 2 つのページを持つ。

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mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

生化学

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, allergy-provoking immune responses. In addition, carbohydrate structures also play a critical role in plant metabolism. Here, we present a simple and rapid method for preparing and analyzing N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus) using an N-glycanase specific for the release of plant-derived carbohydrate structures. To achieve this, crude trichloroacetic acid precipitates of radish homogenates were treated with PNGase H+, and labeled using 2-aminobenzamide as a fluorescent tag. The labeled N-glycan samples were subsequently analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) separation and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for a detailed structural evaluation and to quantify relative abundancies of the radish-derived N-glycan structures. This protocol can also be used for the analysis of N-glycans from various other plant species, and may be useful for further investigation of the function and effects of N-glycans on human health.

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

We describe a simple and rapid method for the preparation and analysis of N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus).

ダイコン品種使用 PNGase H+からN型糖鎖の解析

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

生物学

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

の収集と分析<em&gt;シロイヌナズナ</em&gt;師部はEDTA-促進法を用いた滲出

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用<em&gt;インゲンマメ</em&gt;例として

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

要約

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植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

2 の 1: タンパク質・タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ダイコン品種使用 PNGase H⁺からN型糖鎖の解析

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

の収集と分析

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用

タンパク質とリボ核蛋白質複合体の 3 D ページのナタネから師部 Sap サンプリング

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植物のプロトプラストからのmRNAインターアクチベント捕獲

2 の 1: タンパク質・ タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ダイコン品種使用 PNGase H+からN型糖鎖の解析

クライオスライシングBN-MS解析による高解像度複合プロファイリング

シロイヌナズナにおける浸透性ストレスシグナル伝達のプロファイリングのためのホスホプロテオミクス戦略

でFACSアシスト細胞型特異的発現プロファイリングを使用して組織と器官特異フィトクロム応答を調査シロイヌナズナ

ゲートウェイ互換二分子蛍光相補（BiFC）システムを使用してプラントにおけるタンパク質相互作用の検出

同位体タグ質量分析法を用いたチオールレドックスプロテオームのプロファイリング

の収集と分析

植物の葉からのアポプラスト液の抽出のための浸透·遠心分離技術の使用

2 の 1: タンパク質・タンパク質代謝物の複合体の並列解析のための親和性の浄化をワンステップ

ダイコン品種使用 PNGase H⁺からN型糖鎖の解析