Name: phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes
Uploaded: 2018-01-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 23 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

אנו מודים ג'ניפר דיק, אורסולה Zarzenska על תמיכתם מדעי. עבודה זו מבחינה כלכלית נתמך על ידי הקריירה אינטגרציה מענק (CIG, PCIG14-GA-2013-63 0734) על ידי הנציבות האירופית בתוך תוכנית המסגרת השביעית המענק LFF-GK06 'DELIGRAH' (Landesforschungsförderung המבורג), המענק DFG (DFG KE 856_6-1) מוענק JK.

1. דגימה וצמחים הכנת מהצינורות של napus נולד ב- 4,8,20
<ol><li>לשימוש מהצינורות דגימה, להבינם 8 בת napus דרב צמחים הפריחה הראשונית רק את הצג כדי למנוע אבקה מציג.</li>
	<li>השתמש מחט תת-עורית (Ø מ מ 0.8) punctate התפרחת שאלה מספר פעמים. חזור על מספר גבעולים תפרחת אחרים ועל צמחים אחרים כדי להשיג מספיק מהצינורות (איור 2 א). הערה: עבור ניתוח מורכב, מומלץ להתחיל עם פחות 600 µL של מהצינורות. 4-5 צמחים תניב בין 200 ל 700 µL של מהצינורות.</li>
	<li>. תנגב את הטיפה הראשונה מן האתרים פצוע עם נייר סינון טיפות אלה בעיקר מכילים חומר מזוהם מאוד מן הפצועים הרקמה שמסביב, צריך להיות מושלך.</li>
	<li>לאסוף את הטיפות הבאות על ידי pipetting ולאחסן את תפליט שנאספו בשפופרת תגובה צוננת מראש mL 1.5 חרוט ב-20 ° C באמצעות מערכת קירור שהנהר.</li>
	<li>המשך איסוף עד אין צורה ירידה נוספת היא הנצפה, אך לא יותר מ- 1 h. הליך זה יכול לחזור אחרי יומיים ללא אובדן משמעותי של מהצינורות שנאספו. הערה: מהצינורות שנאספו יכול להשתמש בו מיד או המאוחסנים ב- 80 ° C לצורך ניתוח עתידי. לאחסון-80 ° C, הלם-להקפיא הצינור התגובה בחנקן נוזלי.</li>
	<li>לרכז את הדגימה שיפה כ 1/6th של אמצעי האחסון הראשונית באמצעות רכזים צנטריפוגלי עם משקל מולקולרי חתך (MWCO) של 10,000 Daltons (Da). Centrifuge המדגם מרוכזת בשעה 4 ° C ו- g x 20,000 לפחות 15 דקות להסיר חלקיקי אבק. הערה: ריכוז sap שיפה לא להוביל לאובדן משמעותי של חלבונים.</li>
	<li>לניתוח מורכב עוקבות, להמשיך עם שלב 3.1.</li>
</ol>2. שיפה sap טוהר שליטה באמצעות רוורס טרנסקריפטאז PCR (RT-PCR) 4,8,20
<ol><li>לבודד RNA הכולל מ מהצינורות באמצעות שיטת החילוץ RNA סטנדרטי עבור חומר נוזלי (למשל TRIzol או פנול-כלורופורם החילוץ ואחריו אלכוהול איזופרופיל משקעים פאזה מימית, אתנול שטיפה צעדים על פי הפרוטוקול של היצרן). התראה: פנול-כלורופורם הוא רעיל. לעבוד תחת ברדס עם ציוד למיגון אישי המתאים. ניתן לאחסן את הרנ א שחולצו אתנול ב-80 מעלות צלזיוס עד שישה חודשים.</li>
	<li>להסיר זיהום של ה-DNA על ידי עיכול עם DNase אני (u 1/µg) למשך 45 דקות ב 37 מעלות צלזיוס, בטל את האנזים על-ידי הוספת EDTA ריכוז הסופי של 5 מ מ, דגירה המדגם ב 75 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.</li>
	<li>כדי לקבל את ה-RNA טהור, לטהר ולרכז את הדגימה מאת צעד טיהור נוסף (למשל באמצעות ערכות ניקוי RNA, לפי הוראות היצרן).</li>
	<li>ביצוע של רוורס טרנסקריפטאז PCR (RT-PCR) של סינתזה של cDNA עם ערכת סינתזה cDNA באמצעות 150 ng של RNA טהור כפי שתואר על ידי היצרן של פרוטוקול. הערה: cDNA שניתן לאחסן ב-20 ° C עד שימוש נוסף.</li>
	<li>להשתמש µL 5 של cDNA כתבנית עבור ריאקציה PCR רגיל כפי שצוין על-ידי היצרן, להגביר את התמלילים תא ספציפי ולבדוק על-ידי agarose בג'ל. לאשר את הטוהר של דגימות שיפה באמצעות למשל תחל יחידת משנה קטנים rubisco, thioredoxin h של החלבון מעיל אבקה (איור 1b, טבלה 1).</li>
</ol>3. כחול מקורי דף 4,25,26,31
<ol><li>להשתמש או ג'לים מעבר צבע מקורי יציקת עצמית כמפורט במקומות אחרים27 או מסחרי Bis-טריס צבע ג'לים.</li>
	<li>עומס µg 20-30 של המדגם ופרוטאין מרוכז לכל טוב על גבי הג'ל לפחות triplicates.</li>
	<li>להפעיל את הג'ל 4 ° C ו 150 V באמצעות מאגר קטודית כחול כהה B ומאגר אנודת (טבלה 2) עד המדגם 1/3rd של הג'ל (ca. 20-30 דקות, איור 3a). הערה: עבור סופג בצפון, נתיב יחיד ג'ל מספיקה, בעוד לניתוח של חלבון הרכב על-ידי דף תלת-ממד וספקטרומטר מסה שמומלץ לשלב אותה להקה של עד עשרה מסלולים ג'ל להתרכז שופע פחות חלבונים.</li>
	<li>להשהות ההפעלה, מאגר קטודית כחול כהה exchange B עם קטודה כחול בהיר מאגר B/10 (טבלה 2) ולהמשיך לרוץ. לסיים את הג'ל כאשר החזית הכחולה יתחיל elute החוצה הג'ל (ca. 120-180 דקות, איור 3a). הערה: הג'ל מקורי כחול המוגמר ניתן לאחסן ב 4 מעלות צלזיוס למשך לפחות שבוע. אחסון ממושך יכול להוביל לפזר להקות, יש להימנע. מאגר כחול כהה B הניתנים לשימוש חוזר.</li>
</ol>4. אופציונלי: זיהוי של RNA באמצעות כחול מקורי הצפוני סופג 4
<ol><li>לגזור רצועות נפרדות או להשתמש את ליין ג'ל כל הג'ל מקורי כחול, להעביר אותם לתוך קרום ניילון על ידי חצי יבש סופג-3.5 mA/cm2 עבור 60 דקות ולסמן את הגבול העליון והתחתון ג'ל עם עיפרון על הקרום (איור 4a).</li>
	<li>לאחר סופג, לשטוף את הקרום במים שטופלו DEPC ויבש בין שני ניירות סינון.</li>
	<li>לבצע UV-crosslinking של קרום blotted עם µJ/cm 120,0002 (85 ש' אם שימוש Crosslinker את הטבלה שלחומרים).</li>
	<li>מראש hybridize הקרום עם 6 מ של מאגר הכלאה (מסחרי או מתוצרת עצמית) עבור 60 דקות ב 68 מעלות צלזיוס בתנור הכלאה (איור 4a).</li>
	<li>להוסיף 1 אוטם שריר נוספים של הכלאה מאגר המכיל 4 µL של הגששים 3'-biotinylated (100 ננומטר).</li>
	<li>דגירה הקרום עם החללית בן לילה, תוך כדי קירור התנור מ 68 ° C ל- 37 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>לשטוף את הקרום עם מאגר המכיל 2 מרחביות x SSC ו- 0.1%, עבור 5 דקות בטמפרטורת החדר, כדי להסיר את הגששים מאוגדים unspecifically. התראה: מרחביות יכול לגרום גירויים. ללבוש כפפות, חלוק המעבדה בעת עבודה עם מרחביות מרחביות המכיל פתרונות.</li>
	<li>מבצע זיהוי הגששים 3'-biotinylated קרום למשל עם Streptavidin-HRP-המספר המשלים, הלומינול כמו מצע peroxidase (HRP) חזרת, וכתוצאה מכך לתגובה chemiluminescent רגיש (איור 4a).</li>
</ol>5. שני ממד: טריס-Tricine-אוריאה דף 4,28
<ol><li>בלו להקות יחיד של הג'ל מקורי כחול. לשלב להקות מדגימות להפעיל מסלולים מקבילים להשגת ריכוז נוסף של חלבונים מורכבים (איור 5). הערה: להקות נכרת יכול להיות מאוחסן התגובה יחיד צינורות עד שימוש נוסף ב 4 º C.</li>
	<li>לשפוך ג'ל טריס-Tricine-אוריאה ב- 12% (עובי של 1 מ מ, 6.8 ס"מ 8.6 ס"מ (רוחב x אורך)). להתכונן 10 מ ל ג'ל פתרון A הג'ל הפרדת (טבלה 2), לשפוך בין שתי צלחות זכוכית כיסוי עם אלכוהול איזופרופיל. להסיר את אלכוהול איזופרופיל בסיום הפילמור ולהעביר 4 מ ל ג'ל פתרון B (טבלה 2) עבור הערימה בג'ל ג'ל ועל הוספה ש-10 לסרק היטב. התראה: אקרילאמיד Unpolymerized יכול להיות העצבים, TEMED הוא מזיק אם נשאף. תמיד ללבוש ציוד למיגון אישי ועבודה תחת מכסה המנוע.</li>
	<li>העברת הלהקות ג'ל נכרת לתוך צינור התגובה 1.5 mL ולהוסיף 1 מ"ל של 2 x מרחביות למאגר מדגם equilibration של החלקים ג'ל (איור 5, בטבלה 2).<ol>
<li>דגירה בדגימות 10 דקות בטמפרטורת החדר, לפני רותחים בתוך גוש חימום (95 ° C) או במיקרוגל, דגירה בדגימות שוב בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות נוספות.</li>
		<li>מחסנית כמה חתיכות ג'ל equilibrated המייצג אותו מורכבים לכיס ג'ל בודד אחד.</li>
		<li>לבצע את אלקטרופורזה באמצעות אנודת קטודית הפעלת מאגרי ב-150 V 45 עד 60 דקות, לסלק את ליין ג'ל שלם.</li>
	</ol>
</li>
	<li>דגירה השביל לחתוך כעשרים דקות במאגר חומצי (100 מ מ טריס, חומצה אצטית 100 מ מ), equilibrate ב 125 מ"מ טריס-HCl, pH 6.8 עוד כעשרים דקות (איור 5).</li>
</ol>6. הממד השלישי: 4,מרחביות-דף32
<ol><li>יוצקים על מרחביות 15% הפרדת ג'ל על פי Laemmli32 (עובי: 1.5 מ מ, 6.8 ס"מ 8.6 ס"מ (רוחב x אורך)) (טבלה 2) ומוסיפים שכבה דקה של a 4% לערום ג'ל לעיל. התראה: מרחביות, אקרילאמיד ו- TEMED הם רעילים ואינם מזיקים. לעבוד תחת ברדס וללבוש ציוד למיגון אישי.</li>
	<li>להעביר את ליין ג'ל equilibrated על גבי הג'ל מרחביות ולכסות את הג'ל עם 0.5% (w/w) agarose ב 1 x מרחביות הפעלת מאגר בתוספת עקבות של bromophenol כחול (איור 5).</li>
	<li>מרתיחים זמנים תוססים הפעלת מאגר עם agarose במיקרוגל מוקדמת על הג'ל.</li>
	<li>להפעלת סימן הפרוטאין. כדי להעריך את המשקולות מולקולרית של רכיבי יחיד, הכנס את פיסת נייר סינון בקצה אחד של הג'ל עד agarose פני השטח למוצק או להשתמש מסרק מיוחד משמש בדרך כלל עבור IPG ג'לים.</li>
	<li>להפעיל את הג'ל ב-150 V עבור 60 דקות וכתם הג'ל עם colloidal Coomassie, הכתם כסף או כל אחד אחר מכתים שיטה מתאימה לניתוח spectrometric המוני הבאים.</li>
	<li>לנתח את הנקודות חלבון גלוי שימוש בגישות spectrometric המוני כמו לייזר בסיוע מטריקס desorption/יינון זמן-של-טיסה (MALDI-TOF) או LC-MS/MS ספקטרומטר מסה. הערה: מומלץ להשתמש את Coomassie colloidal מכתים כמו כבר מתואר33... בידיים שלנו, שופע אפילו פחות חלבונים יכולים להיות מספיק צבעונית ומאפשר ניתוח המוני spectrometric עם איכות נתונים סבירים.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Kempers, R., van Bel, A. J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Symplasmic+connections+between+sieve+element+and+companion+cell+in+the+stem+phloem+ofVicia+faba+L.+have+a+molecular+exclusion+limit+of+at+least+10+kDa.">Symplasmic connections between sieve element and companion cell in the stem phloem ofVicia faba L. have a molecular exclusion limit of at least 10 kDa.</a> Planta. 201 (2), 195-201 (1997).</li><li>Stadler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+GFP-fusions+in+Arabidopsis+companion+cells+reveals+non-specific+protein+trafficking+into+sieve+elements+and+identifies+a+novel+post-phloem+domain+in+roots.">Expression of GFP-fusions in Arabidopsis companion cells reveals non-specific protein trafficking into sieve elements and identifies a novel post-phloem domain in roots.</a> Plant J. 41 (2), 319-331 (2005).</li><li>Imlau, A., Truernit, E., Sauer, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-to-cell+and+long-distance+trafficking+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+phloem+and+symplastic+unloading+of+the+protein+into+sink+tissues.">Cell-to-cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues.</a> Plant Cell. 11 (3), 309-322 (1999).</li><li>Ostendorp, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+Brassica+napus+phloem+protein+and+ribonucleoprotein+complexes.">Functional analysis of Brassica napus phloem protein and ribonucleoprotein complexes.</a> New Phytol. 214 (3), 1188-1197 (2017).</li><li>Paultre, D. S. G., Gustin, M. -. P., Molnar, A., Oparka, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lost+in+Transit:+Long-Distance+Trafficking+and+Phloem+Unloading+of+Protein+Signals+in+Arabidopsis+Homografts.">Lost in Transit: Long-Distance Trafficking and Phloem Unloading of Protein Signals in Arabidopsis Homografts.</a> Plant Cell. 28 (9), 2016-2025 (2016).</li><li>Sali, A., Glaeser, R., Earnest, T., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+words+to+literature+in+structural+proteomics.">From words to literature in structural proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 216-225 (2003).</li><li>Lin, M. -. K., Lee, Y. -. J., Lough, T. J., Phinney, B. S., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+Pumpkin+Phloem+Proteome+Provides+Insights+into+Angiosperm+Sieve+Tube+Function.">Analysis of the Pumpkin Phloem Proteome Provides Insights into Angiosperm Sieve Tube Function.</a> Mol. Cell. Proteomics. 8 (2), 343-356 (2008).</li><li>Giavalisco, P., Kapitza, K., Kolasa, A., Buhtz, A., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Towards+the+proteome+of+Brassica+napus+phloem+sap.">Towards the proteome of Brassica napus phloem sap.</a> Proteomics. 6 (3), 896-909 (2006).</li><li>Lucas, W. J., Yoo, B. C., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=RNA+as+a+long-distance+information+macromolecule+in+plants.">RNA as a long-distance information macromolecule in plants.</a> Nat. Rev. Mol. Cell. Bio. 2 (11), 849-857 (2001).</li><li>Dinant, S., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sampling+and+Analysis+of+Phloem+Sap.">Sampling and Analysis of Phloem Sap.</a> Plant Mineral Nutrients. 953, 185-194 (2013).</li><li>Kennedy, J. S., Mittler, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Method+of+obtaining+Phloem+Sap+via+the+Mouth-parts+of+Aphids.">A Method of obtaining Phloem Sap via the Mouth-parts of Aphids.</a> Nature. 171 (4351), 528 (1953).</li><li>King, R. W., Zeevaart, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhancement+of+Phloem+exudation+from+cut+petioles+by+chelating+agents.">Enhancement of Phloem exudation from cut petioles by chelating agents.</a> Plant Physiol. 53 (1), 96-103 (1974).</li><li>Alosi, M. C., Melroy, D. L., Park, R. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+gelation+of+Phloem+exudate+from+cucurbita+fruit+by+dilution,+glutathione,+and+glutathione+reductase.">The regulation of gelation of Phloem exudate from cucurbita fruit by dilution, glutathione, and glutathione reductase.</a> Plant Physiol. 86 (4), 1089-1094 (1988).</li><li>Dinant, S., Bonnemain, J. -. L., Girousse, C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+sap+intricacy+and+interplay+with+aphid+feeding.">Phloem sap intricacy and interplay with aphid feeding.</a> Comptes rendus biologies. 333 (6-7), 504-515 (2010).</li><li>Tetyuk, O., Benning, U. F., Hoffmann-Benning, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Collection+and+analysis+of+Arabidopsis+phloem+exudates+using+the+EDTA-facilitated+Method.">Collection and analysis of Arabidopsis phloem exudates using the EDTA-facilitated Method.</a> J Vis Exp. (80), e51111 (2013).</li><li>Kovalskaya, N., Owens, R., Baker, C. J., Deahl, K., Hammond, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+modified+EDTA-mediated+exudation+technique+and+guttation+fluid+analysis+for+Potato+spindle+tuber+viroid+RNA+detection+in+tomato+plants+(Solanum+lycopersicum).">Application of a modified EDTA-mediated exudation technique and guttation fluid analysis for Potato spindle tuber viroid RNA detection in tomato plants (Solanum lycopersicum).</a> J. Virol. Methods. 198, 75-81 (2014).</li><li>Rodriguez-Medina, C., Atkins, C. A., Mann, A. J., Jordan, M. E., Smith, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macromolecular+composition+of+phloem+exudate+from+white+lupin+(Lupinus+albus+L).">Macromolecular composition of phloem exudate from white lupin (Lupinus albus L).</a> BMC Plant Biol. 11 (1), 36 (2011).</li><li>Taylor, J. S., Thompson, B., Pate, J. S., Atkins, C. A., Pharis, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytokinins+in+the+Phloem+Sap+of+White+Lupin+(Lupinus+albus+L.).">Cytokinins in the Phloem Sap of White Lupin (Lupinus albus L.).</a> Plant Physiol. 94 (4), 1714-1720 (1990).</li><li>Yoo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Systemic+Small+RNA+Signaling+System+in+Plants.">A Systemic Small RNA Signaling System in Plants.</a> Plant Cell. 16 (8), 1979-2000 (2004).</li><li>Buhtz, A., Springer, F., Chappell, L., Baulcombe, D. C., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+small+RNAs+from+the+phloem+of+Brassica+napus.">Identification and characterization of small RNAs from the phloem of Brassica napus.</a> Plant J. 53 (5), 739-749 (2008).</li><li>Chalhoub, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+genetics.+Early+allopolyploid+evolution+in+the+post-Neolithic+Brassica+napus+oilseed+genome.">Plant genetics. Early allopolyploid evolution in the post-Neolithic Brassica napus oilseed genome.</a> Science. 345 (6199), 950-953 (2014).</li><li>Sasaki, T., Chino, M., Hayashi, H., Fujiwara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+several+mRNA+species+in+rice+phloem+sap.">Detection of several mRNA species in rice phloem sap.</a> Plant Cell Phys. 39 (8), 895-897 (1998).</li><li>Doering-Saad, C., Newbury, H. J., Bale, J. S., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+aphid+stylectomy+and+RT-PCR+for+the+detection+of+transporter+mRNAs+in+sieve+elements.">Use of aphid stylectomy and RT-PCR for the detection of transporter mRNAs in sieve elements.</a> J Exp. Bot. 53 (369), 631-637 (2002).</li><li>Ruiz-Medrano, R., Xoconostle-C&#225;zares, B., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+long-distance+transport+of+CmNACP+mRNA:+implications+for+supracellular+regulation+in+plants.">Phloem long-distance transport of CmNACP mRNA: implications for supracellular regulation in plants.</a> Dev. 126 (20), 4405-4419 (1999).</li><li>Sch&#228;gger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis.">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal. Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li><li>Sch&#228;gger, H., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+electrophoresis+for+isolation+of+membrane+protein+complexes+in+enzymatically+active+form.">Blue native electrophoresis for isolation of membrane protein complexes in enzymatically active form.</a> Anal. Biochem. 199 (2), 223-231 (1991).</li><li>Fiala, G. J., Schamel, W. W. A., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+(BN-PAGE)+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates.">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), e2164 (2011).</li><li>Rais, I., Karas, M., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+electrophoresis+for+the+isolation+of+integral+membrane+proteins+and+mass+spectrometric+identification.">Two-dimensional electrophoresis for the isolation of integral membrane proteins and mass spectrometric identification.</a> Proteomics. 4 (9), 2567-2571 (2004).</li><li>Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tricine-SDS-PAGE.">Tricine-SDS-PAGE.</a> Nature protocols. 1 (1), 16-22 (2006).</li><li>Wittig, I., Braun, H. -. P., Sch&#228;gger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue+native+PAGE.">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li><li>Eubel, H., Braun, H. -. P., Millar, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blue-native+PAGE+in+plants:+a+tool+in+analysis+of+protein-protein+interactions.">Blue-native PAGE in plants: a tool in analysis of protein-protein interactions.</a> Plant Methods. 1 (1), 11 (2005).</li><li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4.">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li><li>Dyballa, N., Metzger, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fast+and+sensitive+colloidal+coomassie+G-250+staining+for+proteins+in+polyacrylamide+gels.">Fast and sensitive colloidal coomassie G-250 staining for proteins in polyacrylamide gels.</a> J Vis Exp. (30), (2009).</li><li>Turnbull, C. G. N., Lopez-Cobollo, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heavy+traffic+in+the+fast+lane:+long-distance+signalling+by+macromolecules.">Heavy traffic in the fast lane: long-distance signalling by macromolecules.</a> New Phytol. 198 (1), 33-51 (2013).</li><li>Hall, S. M., Baker, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+chemical+composition+of+Ricinus+phloem+exudate.">The chemical composition of Ricinus phloem exudate.</a> Planta. 106 (2), 131-140 (1972).</li><li>Barnes, A., Bale, J., Constantinidou, C., Ashton, P., Jones, A., Pritchard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+protein+identity+from+sieve+element+sap+in+Ricinus+communis+L.+by+quadrupole+time+of+flight+(Q-TOF)+mass+spectrometry.">Determining protein identity from sieve element sap in Ricinus communis L. by quadrupole time of flight (Q-TOF) mass spectrometry.</a> J. Exp. Bot. 55 (402), 1473-1481 (2004).</li><li>Walz, C., Giavalisco, P., Schad, M., Juenger, M., Klose, J., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics+of+curcurbit+phloem+exudate+reveals+a+network+of+defence+proteins.">Proteomics of curcurbit phloem exudate reveals a network of defence proteins.</a> Phytochemistry. 65 (12), 1795-1804 (2004).</li><li>Walz, C., Juenger, M., Schad, M., Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+presence+and+activity+of+a+complete+antioxidant+defence+system+in+mature+sieve+tubes.">Evidence for the presence and activity of a complete antioxidant defence system in mature sieve tubes.</a> Plant J. 31 (2), 189-197 (2002).</li><li>Kehr, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phloem+sap+proteins:+their+identities+and+potential+roles+in+the+interaction+between+plants+and+phloem-feeding+insects.">Phloem sap proteins: their identities and potential roles in the interaction between plants and phloem-feeding insects.</a> J Exp. Bot. 57 (4), 767-774 (2006).</li><li>Ham, B. -. K., Brandom, J. L., Xoconostle-C&#225;zares, B., Ringgold, V., Lough, T. J., Lucas, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+polypyrimidine+tract+binding+protein,+pumpkin+RBP50,+forms+the+basis+of+a+phloem-mobile+ribonucleoprotein+complex.">A polypyrimidine tract binding protein, pumpkin RBP50, forms the basis of a phloem-mobile ribonucleoprotein complex.</a> Plant Cell. 21 (1), 197-215 (2009).</li><li>Schamel, W. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biotinylation+of+protein+complexes+may+lead+to+aggregation+as+well+as+to+loss+of+subunits+as+revealed+by+Blue+Native+PAGE.">Biotinylation of protein complexes may lead to aggregation as well as to loss of subunits as revealed by Blue Native PAGE.</a> J. Immunol. Methods. 252 (1-2), 171-174 (2001).</li><li>Zhang, S., Sun, L., Kragler, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phloem-delivered+RNA+pool+contains+small+noncoding+RNAs+and+interferes+with+translation.">The phloem-delivered RNA pool contains small noncoding RNAs and interferes with translation.</a> Plant Physiol. 150 (1), 378-387 (2009).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

שיפה הוא תא של ריבית גבוהה, כיוון שהוא מהווה תוואי תחבורה ראשי עבור photoassimilates, היא חיונית עבור מערכת אזעקה למרחקים ארוכים בין צמחים שונים חלקים9,20,34, 35. בנוסף, מולקולות קטנות מקרומולקולות כמו חלבונים ו RNAs היו מעורבים עם תחזוקה שיפה, איתות4,7,8. הניתוח של הרכב שיפה מוגבלת על ידי נגישות מוגבלת שיפה דגימות של רוב מיני צמחים. הטכניקה stylet חרקים החלים נרחב, אך תובענית השפעול ותוצאות בכמויות קטנות מאוד של שיפה דגימות11. טכניקה קלה אחת המשמש עבור הדגימה שיפה זה הקלו EDTA exudation12. EDTA chelates יונים כלט כמו סידן, וכך מונע סגירה של מסננת צלחות על ידי P-חלבונים ו callose. זה קל לשימוש, אך נוטה זיהום על ידי תאים פגומים, דוגמאות הן מדולל. Depleting יונים כלט מאת EDTA יכול גם להוביל התמוטטות של מתחמי הקיים. עם זאת, הוא מאפשר דגימה מתוך מגוון רחב של מינים, כולל צמח מודל לבנה א15. Exudation ספונטנית של מהצינורות מתרחשת רק במספר קטן של מיני צמחים. זה שיטה פולשני הכרוך נזק משמעותי של רקמות הצמח10. לאחרונה הקמנו napus דרב כמין מודל לימוד בתחבורה הבינעירונית4,8,20. כאן, מהצינורות ניתן לטעום מן חתכים קטנים, אשר מפחית ופצעו אפקטים של מקורות זיהום.
באמצעות טכניקות דגימה שונים, פרוטאום שיפה דוגמאות של מינים שונים של נחקר, בשנים האחרונות7,8,17,36,37, 38,39. ללימודים אלה פרוטאום ', היו חלבונים חילוץ, זירז תחת denaturing תנאים, ולכן אינם מאפשרים מסקנות לגבי חלבון: חלבון וחלבון: חומצות גרעין אינטראקציות להציג בתנאים מקורית. Co-immunoprecipitation (CoIP), שכבת-על מבחני המצוין ribonucleoprotein הגדולות מורכבות אולי קיימים מהצינורות של דלעת40, אך לא הוכח כי כל מכלולי macromolecular להתקיים בתנאים מקורי בתוך מערכת שיפה.
דף מקורי כחול, שהוצגו על ידי. Schägger et al. 26, בשילוב עם ג'ל ברזולוציה גבוהה עוקבות אלקטרופורזה צעדים מאפשרות ההפרדה של רכיבים בודדים של מתחמי חלבון גדולה. באמצעות 3D-דף ניתוחים של יליד napus דרב שיפה תפליט, אנו יכול לאחרונה להדגים כי מספר גבוה משקל מולקולרי: חלבון, מתחמי RNP קיים בדגימות שיפה, פעיל enzymatically4. שיטות אלטרנטיביות כדי לבודד חלבון מתחמי, כמו גם RNPs כמו גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה שאולי קיימים, אבל נכשל מבחינת רזולוציה בהשוואה בסון-דף. יתר על כן, איכות סבירה של הפרדה מורכבים, גודל אי-הכללה של עמודות מטריצות חייב להיות מותאם על פי העובי מולקולרית בסך הכל מורכבת נחקר. ניתוח מתחמי גודל שונים ולכן ידרוש סוגים שונים של עמודות אשר הוא עולה אינטנסיבית, אינו מאפשר ככוח התמקדות גבוהה כדף בסון.
שלבים קריטיים כדי לנתח מתחמי מ napus דרב כוללים את הסכום הכולל של מהצינורות משמש החל חומר. µL לפחות 600 שיפה מדגם הכרחי, ניתן להשיג 5 מפעלים להבינם. 3D-דף ו בסון סופג בצפון זה הכרחי להפעיל את הג'ל בסון הראשונית עם כמות מספקת של שיפה דגימות. כדי להשיג זאת, שיפה דגימות מרוכזים עד ניתן לטעון לתוך כל 20-30 µg של חלבון לפחות היטב triplicates של המדגם אותו מופעלים במקביל. ריכוז נמוך מדי או גבוה מדי להפחית את הגילוי של מכלולים (איור 3). דוגמאות שיפה צריך להיות שנאספו לתוך צינורות התגובה על קרח ויש לאחסנו קפוא לשימוש במועד מאוחר יותר למנוע השפלה חלבון והמסירה. מעכבי פרוטאז נמצאו proteomes שיפה כל מנותח, אך גם פרוטאוזום פעיל מלא שתואר בעלון שיפה napus נולד ב-4. יתר על כן, נפח והרכב של דגימות שיפה תלויות זמן-נקודת הדגימה של תנאים סביבתיים10. לכן חייבים להקפיד לאסוף בו זמנית של היום בתנאים דומים. מתח טיפולים (למשל הבצורת) יכולים להפחית את כמות שיפה הניתנים לאיסוף. כדי לזהות חלבונים יחיד באמצעות ספקטרומטר מסה, זה חובה להגביל מציג קרטין אפשרי על ידי בכפפות כל הזמן. קרטין מוביל לאותות נוספים במהלך ניתוח המוני spec, הסלים זיהוי חלבונים. הפעלת בסון-הדף במתח גבוה או בטמפרטורת החדר יכול להוביל חימום של הג'ל עשוי לגרום פירוק של מתחמי שביר.
פרוטוקול המובאת כאן מתאימה לניתוח של קומפלקסים: חלבון. אנו גם מראים כי זה יכול לשמש כדי לזהות RNAs מסוים הכלול את מתחמי במקביל. כדי להשיג זאת, לאחרונה הצגנו פרוטוקול עבור בסון הצפוני סופג4. RNAs נוטים השפלה מאת RNAse מציג. כדי להגביל את השפלה כזאת שטופלו DEPC, מים אמור לשמש.
המגבלות העיקריות של השיטה הציג כוללים את אומדן משקל מולקולרי של מתחמי חלבון המופרדות על-ידי בסון-דף, מאז העברת התנהגות תלוי בגודל, צורה אפילו שינויים posttranslational של מתחמי31, 41. הערכת גודל של מתחמי RNP זה עוד יותר קשה בגלל ההשפעה של חומצות גרעין על התנהגות ההעברה. זה גם לא ניתן למנוע את מתחמי בגודל זהה שיתוף להעביר בלהקה בודד אחד. זה יכול להוביל חיזוי שגוי של קומפוזיציות מורכבות. ולכן אימות את האינטראקציות נצפתה עם שיטות משלימות, למשל על ידי מבחני תפקודית4, ייתכן שיהיה צורך. גם חלבונים בלבד בחולשה או transiently קשור קומפלקס macromolecular עלול ללכת לאיבוד בתוך שהמאגר בסון. כדי למנוע זאת, דגימות יכול להיות תפור, מה יכול גם לגרום לחפצים או יכול למנוע זיהוי חלבונים, או התנאים מאגר ניתן למטב.
בניגוד קלאסי 2D-דף, השילוב של אוריאה-מרחביות-דף מאפשר ההפרדה על פי hydrophobicity, משקל מולקולרי במקום נקודה איזואלקטרית (pI) ו משקל מולקולרי 28, וכן אינו מגביל את ההפרדה חלבונים של טווח ספציפי pI. חלבונים הדומה קלאסי 2D-דף, מופרדים גלויים נקודות יחיד, אבל על אלכסון קו 4,28 (איור 5, איור 6). יותר חלבונים הידרופובי מופיעים כתמים מעל זה באלכסון, ואילו יותר הידרופילית חלבונים נמצאים מתחת לקו28. הריכוזים לזיהוי בשימוש פרוטוקול זה להפריד חלבונים בין 25 ל-80 kDa. טוב. כדי לאפשר הפרדה של חלבונים קטן או גדול יותר לזיהוי של ריכוז יכולים להיות מגוונים או ג'לים מעבר צבע יכול לשמש בממד השלישי. הרכיבים של מורכבות הרביעי (איור 3) המופרדות באמצעות 3D-דף (איור 6) נחתכו החוצה, טריפסין, מתעכל נותחו על ידי ספקטרומטר מסה. כתוצאה מכך הזיהוי של מספר ligases tRNA. מרכיבי מתחמי אחרים היו שפורסם לאחרונה 4. 3D-עמוד שלנו זמין ההפרדה של ligases שונים, כלומר אספרטט, אספרגין, תראונין, ליזין, גליצין ligases, עם משקולות מולקולרי דומה (טבלה 3). באמצעות בדיקה tRNA ספציפי מתיונין, אנחנו הצליחו לזהות tRNA שעשויות להיות מאוגדים בתוך מתחם הרביעי, אבל אם tRNA באורך מלא או שברי tRNA במתחם לא שיפלו עם הגששים בשימוש. כדי לבדוק אם חומצות גרעין ממש בתוך המתחם וקשורות לא שותפה נודדים, פרוטאז מתעכל מהצינורות דגימות עשוי לשמש בפקדי העברה מתאים.
זה כבר העריכו קודם לכן כי תרגום החלבון יכול להתרחש בתוך צינורות מסננת שיפה, מאז כמעט רוב מרכיבי ריבוזום כולו, כמו גם גורמים התארכות נמצאו שיפה דגימות4,7. שלנו ממצא של tRNA, tRNA ligases נראה כדי לתמוך את הרעיון הזה. אולם, שברי tRNA בדגימות שיפה מתנת דלעת הוכחו להיות מעכבי חזק של תרגום42 , ריבוזומים פונקציונלי שנראה שהוא נעדר4, רומז כי התרגום לא יכולים להתקיים.
פרוטוקול המובאת כאן יחדיו, מאפשר ההפרדה של: חלבון מקורי, אפילו RNP קומפלקסים של שיפה ודוגמאות הפרדה וזיהוי של רכיבים בודדים שלהם עם רזולוציה גבוהה. היישום של שיטה זו מאפשרת הגילוי של חלבון הרומן ושל RNP מתחמי בדגימות שיפה, ולכן יכול להבהיר את פונקציות חדשות בתא הזה צמח מאוד מיוחדים.

התעלות הבינעירוניים של שיפה הם חיוניים עבור ההקצאה של חומרים מזינים אורגניים צמחים גבוהים יותר, אבל הם גם מעורבים בוויסות תהליכים שונים רבים חשוב צמיחה, פיתוח, ההגנה הפתוגן של ההסתגלות כדי לוואי תנאים סביבתיים. חוץ effectors קטן כמו יונים, phytohormones או מטבוליטים עצמם, מקרומולקולות כמו חלבונים ו RNAs שהתגלו לאחרונה כמו אותות פוטנציאליים.
מחקרים הראו כי שיפה הטעינה של חלבונים הוא גודל התלוי ומבוקר על ידי ממגבלת הגודל של הדרה (SEL) של יחידות נקבובית-plasmodesmal התחברות תאים לוויה (CC), ניפוי אלמנטים (SE) כי הם בדרך כלל בטווח של 10 > 67 kDa1 , 2 , 3. עם זאת, למרות אלה מגבלות גודל חלבונים גדולים יותר של חלבון מתחמי נמצאו בתוך מערכת שיפה מאתגר את הרעיון של אי-הכללה של גודל4, אפילו לא ספציפית אובדן מהחלבונים CC ל SE כבר הציע5 .
Ribonucleoprotein multiprotein, כמו גם גדול מתחמי ממלאים תפקידים מרכזי ביוסינטזה, שמירה על שלמות המבנה של תא6. יש ראיות כי מכלולי חלבון ו- ribonucleoprotein שיפה-mobile קיימים4,7, אך נכון להיום ידוע מעט על תפקידם. ברכיבי מסננת שיפה היו מעורבים: חלבון ו- RNP מתחמי בתחבורה הבינעירונית ו / או8,איתות9. כדי לפענח את הפונקציות של מתחמי translocated, לומד שלהם קומפוזיציה אצל משתנה סביבתי או להדגיש תנאי נדרש. כדי להשיג זאת, מתחמי מקורי צריך להיות מבודד, הרכיבים שלהם יש להפריד עם רזולוציה מספיק.
כדי לבודד מתחמי גבוהה משקל מולקולרי של שיפה, זה הכרחי הראשונה כדי לקבל דוגמאות sap מספקת איכות וכמות. הטכניקה יכולה לשמש עבור הדגימה שיפה תלוי מיני צמחים מעניינים. שלוש שיטות עיקריות להשגת מהצינורות קיים 10: חרקים stylectomy11exudation הקלו EDTA12, ספונטנית exudation13.
שיפה דגימות תודרנית לבנה (ע' לבנה), המפעל הגדולות מודל במעבדות ברחבי העולם, יכולה להיות מושגת רק על ידי הקלו EDTA exudation או כנימות עלה stylectomy14,15. שתי השיטות להוביל מהצינורות מדולל מאוד או כמויות מדגם נמוך מאוד. Exudation EDTA הקלו גם מועדים לזיהום, שאולי לא מייצג את הרכב שיפה אמיתי16. שיפה ספונטנית exudation מוגבל לשתול זנים כמו cucurbits, תורמוס או יוקה, לאן לחתוך חלקי הצמח מוביל פליטה ספונטנית של מהצינורות שניתן בקלות שנאספו13,17,18, 19. לאחרונה הקמנו שמן אונס (כרוב napus) כמערכת מודל מתאים לניתוח שיפה, שכן הוא קרוב משפחה של לבנה א , מספר microliters של מהצינורות ניתן להשיג חתכים קטנים זה הוכח להיות של טוהר גבוהה-4,-8,-20. יתר על כן, רצף הגנום napus דרב יצא בשנת 201421.
חוץ stylectomy כנימות עלה, שיפה כל אוסף השיטות המתוארות כוללים פגיעה של הרקמה באתר של הדגימה שמסביב, ההרכב של מהצינורות עשויים להשתנות בתגובה לפציעה. לכן זה חיוני כדי לבדוק את טיב דגימות שיפה, מבלי להתחשב בשיטה דגימה חלה. ישנן שיטות שונות עבור בקרת איכות של שנאספו מהצינורות, למשל על-ידי קביעת RNase פעילות22,23, RT-PCR עם primers נגד8,Rubisco24, או הניתוח של הסוכר הרכב8.
שיטות שונות כדי לבודד ולהפריד בין מתחמי חלבון יכול להיות מיושם, כולל גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה, ultracentrifugation צפיפות סוכרוז או מדגם הסינון דרך ריריות עם משקל מולקולרי ייחודי החתך offs. עם זאת, גישות אלה אינם מאפשרים ברזולוציה גבוהה. טכניקה שנקראת כחול מקורי (דף בסון-), תואר לראשונה על ידי Schägger et al. 25, עדיפה מבחינת רזולוציה. הוא שימש בהצלחה כדי לקבוע את המשקולות מולקולרית של מתחמי חלבון מקורית גדולה organelles שונים או lysates הסלולר ו26,שלהם יחסית abundances27.
להבהיר עוד יותר את הרכב מורכב של חלבונים מתחמי, זה הכרחי להפריד בין הרכיבים השונים תחת denaturing תנאים, שמוביל פירוק מוחלט של הרכיבים המורכבים. זו יכולה להיות מושגת על ידי מימד השני של 28,מרחביות-דף29 או, כדי להשיג רזולוציה גבוהה יותר, על ידי מימד השני של התמקדות לגירויי כאב (הציבורית) ואחריו third dimension של מרחביות-דף30 וזיהוי עוקבות של החלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את הדגימה של מהצינורות טהור מצמחים napus דרב וניתוח של חלבון מתחמי מדגימות שיפה כזה באמצעות גישה electrophoretic 3D של שילוב בסון-דף עם טריס-Tricine-שתנן-עמוד ועמוד מרחביות. החלבון מופרדים רכיבים מורכבים לאחר מכן מזוהות באמצעות ספקטרומטר מסה. בנוסף, אנחנו מציגים כחול מקורי הצפוני סופג כשיטה המאפשר הזיהוי של RNAs קומפלקסים גדולים RNP4, הרחבת הישימות של הגישה.

<table><tbody><tr><td>1.5 mL reaction tubes</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>10 well comb for SDS PAGE, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653359</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>AppliChem</td><td>131090</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (29:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610156</td><td></td></tr><tr><td>30 % Acrylamide-bisacrylamide solution (37.5:1) solution</td><td>BioRad</td><td>1610158</td><td></td></tr><tr><td>96 % Ethanol</td><td>Carl Roth</td><td>P075</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Carl Roth</td><td>6755</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Lonza</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>Aluminum sulfate-(14-18)-hydrate</td><td>AppliChem</td><td>141101</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium peroxodisulfate (APS)</td><td>Carl Roth</td><td>9592.3</td><td></td></tr><tr><td>Bis-Tris</td><td>AppliChem</td><td>A3992</td><td></td></tr><tr><td>Boric acid</td><td>AppliChem</td><td>A2940</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>AppliChem</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal concentrators &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Vivaspin 500 (Mwco 10 kDa)</td><td>Sartorius</td><td>VS0102</td><td></td></tr><tr><td>Chemiluminescent Nucleic Acid Detection Module Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89880</td><td></td></tr><tr><td>Chromatography papers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; 3 mm CHR</td><td>Whatman</td><td>3030-153</td><td></td></tr><tr><td>CoolBox M30 System</td><td>Biocision</td><td>BCS-133</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie brilliant Blue G-250</td><td>AppliChem</td><td>A3480</td><td></td></tr><tr><td>Diethyl pyrocarbonate (DEPC)</td><td>AppliChem</td><td>A0881</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>AppliChem</td><td>A1101</td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>AppliChem</td><td>A3778</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol abs.</td><td>AppliChem</td><td>A3693</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>AppliChem</td><td>A1103</td><td></td></tr><tr><td>Gel Imaging system &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Chemidoc Touch</td><td>BioRad</td><td>1708370</td><td></td></tr><tr><td>GeneRuler 1kb plus</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SM1331</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem</td><td>141339</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>AppliChem</td><td>131340</td><td></td></tr><tr><td>Heating block TS1</td><td>Biometra</td><td>846-051-500</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization oven &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; GFL Hybridization Incubator 7601</td><td>GFL</td><td>7601</td><td></td></tr><tr><td>Hypodermic needle (0.8 mm)</td><td>B Braun</td><td>4658309</td><td></td></tr><tr><td>IPG gel comb, thickness 1 mm</td><td>BioRad</td><td>1653367</td><td></td></tr><tr><td>Labeling of RNA &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;Biotin 3&#039;end DNA Labeling Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>89818</td><td></td></tr><tr><td>Native gradient gel &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Novex NativePAGE 4&amp;ndash;16% Bis-Tris protein gel</td><td>Invitrogen</td><td>BN1002BOX</td><td></td></tr><tr><td>Nylon membrane &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Hybond-N+</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>RPN203B</td><td></td></tr><tr><td>Ortho-phosphoric acid</td><td>Carl Roth</td><td>6366.1</td><td></td></tr><tr><td>PageRuler prestained protein ladder</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>26616</td><td></td></tr><tr><td>Power supply for Gel electrophoresis EPS</td><td>Amersham Pharmacia</td><td>18-1130-01</td><td>available from GE Healthcare</td></tr><tr><td>RNA Cleanup Kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>Semi dry blot &lt;em&gt;e.g&lt;/em&gt;. Fastblot 43B semi dry Blot</td><td>Biometra</td><td>846-015-100</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride (NaCl)</td><td>AppliChem</td><td>A1149</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate (SDS)</td><td>AppliChem</td><td>142363</td><td></td></tr><tr><td>Synthesis of cDNA &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>K1621</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylenediamine (TEMED)</td><td>AppliChem</td><td>A1148</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>AppliChem</td><td>A3954</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>AppliChem</td><td>A1086</td><td></td></tr><tr><td>Tri-sodium citrate dihydrate</td><td>AppliChem</td><td>A3901</td><td></td></tr><tr><td>TRIzol Reagent</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15596026</td><td></td></tr><tr><td>ULTRAhyb Ultrasensitive Hybridization Buffer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM8670</td><td></td></tr><tr><td>Urea</td><td>AppliChem</td><td>A1360</td><td></td></tr><tr><td>UV Crosslinker &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; Stratalinker 2400</td><td>Agilent</td><td>NC0477671</td><td>from Fisher Scientific</td></tr><tr><td>Vertical electrophoresis apparatus &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt;The XCell SureLock Mini-Cell or Mini-Protean III System</td><td>Thermo Fisher Scientific or BioRad</td><td>EI0001 or 1658004</td><td></td></tr><tr><td>Wipers &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; KIMWIPES Delicate Task Wipers</td><td>Kimberly-Clark</td><td>34120</td><td></td></tr></tbody></table>

phloem sap sampling from brassica napus for 3d-page of protein and ribonucleoprotein complexes

דגימה של שיפה של צמחים גבוהים לעתים קרובות מפרך ותלוי באופן משמעותי מיני צמחים. עם זאת, מחקרים פרוטאום תחת denaturing תנאים ניתן להשיג במינים שונים. מקורית: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מדגימות שיפה יש עדיין בקושי נותחו, למרות שהם אולי משחק תפקידים חשובים תחזוקת את התא מיוחדים או איתות למרחקים ארוכים. מכלולים גדולים מולקולרית ניתן לבודד באמצעות של כחול מקורי בג'ל (בסון-עמוד). ניתן להפריד בין מרכיבי חלבון שלהם על ידי סולפט נתרן עוקבות dodecyl (דף מרחביות-). עם זאת, חלבונים עם משקולות מולקולרי דומה משותפת נודדים, מה יכול לעכב זיהוי חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה. שילוב בסון-דף עם שני שונים denaturing ג'ל אלקטרופורזה צעדים, כלומר טריס-Tricine-אוריאה ומרחביות-דף, מאפשר ההפרדה נוספים של חלבונים על פי hydrophilicity/hydrophobicity שלהם ושל ובכך מגדיל את הרזולוציה ואת ההצלחה שיטות זיהוי חלבונים. זה גם מאפשר הבחנה חלבונים אשר נבדלים רק שינויים posttranslational שלהם. בנוסף, כחול מקורי הצפוני סופג ניתן להחיל כדי לזהות את רכיבי ה-RNA קומפלקסים macromolecular. אנו מראים כי הפרוטוקול שלנו מתאימה לפענח חלבונים ו- RNA מרכיבי מקורית: חלבון ו- ribonucleoprotein (RNP) מתחמי התרחשות בדגימות שיפה. שילוב של כחול מקורי דף עם שני צעדים דף שונה denaturing יכול לעזור כדי להפריד בין סוגים שונים של חלבון גדולה מתחמי ומאפשר גם שיעור זיהוי מוגברת של הרכיבים שלהם באמצעות ספקטרומטר מסה. יתר על כן, הפרוטוקול היא יציבה מספיק כדי לזהות בו זמנית חומצות גרעין שעשויות להיות מאוגדים בתוך מתחמי חלבון יחיד.

Watch this Scientific Journal Video about Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes at JoVE.com

דגימת מוהל פלואם מ-Brassica napus עבור 3D-PAGE של קומפלקסים של חלבון וריבונוקלאופרוטאין | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את הרכב החלבון גדול מקורי: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מהאונס שמן (נולד ב- napus) תפליט שיפה בגישה של תלת-ממד לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) שילוב של כחול מקורי (בסון) עם שני עמודים denaturing ואחריו זיהוי המוני spectrometric.

Sampling the phloem of higher plants is often laborious and significantly dependent on the plant species. However, proteome studies under denaturing ...

phloem-sap-sampling-from-brassica-napus-for-3d-page-protein

Universidad de Cartagena UDEC

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

Fundamentals

Macromolecules

SCIENTISTS IN ACTION

13.7K Views.  Universität Hamburg. כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי לנתח את הרכב החלבון גדול מקורי: חלבון וחלבון: חומצות גרעין מתחמי מהאונס שמן (נולד ב- napus) תפליט שיפה בגישה של תלת-ממד לזיהוי ג'ל אלקטרופורזה (עמוד) שילוב של כחול מקורי (בסון) עם שני עמודים denaturing ואחריו זיהוי המוני spectrometric.

Video: Phloem Sap Sampling from Brassica napus for 3D-PAGE of Protein and Ribonucleoprotein Complexes

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Biochemistry

2 in 1: One-step Affinity Purification for the Parallel Analysis of Protein-Protein and Protein-Metabolite Complexes

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of protein-protein interactions (PPI) is no novelty, experimental approaches aiming to characterize endogenous protein-metabolite interactions (PMI) constitute a rather recent development. Herein, we present a protocol that allows simultaneous characterization of the PPI and PMI of a protein of choice, referred to as bait. Our protocol was optimized for Arabidopsis cell cultures and combines affinity purification (AP) with mass spectrometry (MS)-based protein and metabolite detection. In short, transgenic Arabidopsis lines, expressing bait protein fused to an affinity tag, are first lysed to obtain a native cellular extract. Anti-tag antibodies are used to pull down protein and metabolite partners of the bait protein. The affinity-purified complexes are extracted using a one-step methyl tert-butyl ether (MTBE)/methanol/water method. Whilst metabolites separate into either the polar or the hydrophobic phase, proteins can be found in the pellet. Both metabolites and proteins are then analyzed by ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry (UPLC-MS or UPLC-MS/MS). Empty-vector (EV) control lines are used to exclude false positives. The major advantage of our protocol is that it enables identification of protein and metabolite partners of a target protein in parallel in near-physiological conditions (cellular lysate). The presented method is straightforward, fast, and can be easily adapted to biological systems other than plant cell cultures.

Protein-protein and protein-metabolite interactions are crucial for all cellular functions. Herein, we describe a protocol that allows parallel analysis of these interactions with a protein of choice. Our protocol was optimized for plant cell cultures and combines affinity purification with mass spectrometry-based protein and metabolite detection.

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

Cellular processes are regulated by interactions between biological molecules such as proteins, metabolites, and nucleic acids. While the investigation of ...

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, allergy-provoking immune responses. In addition, carbohydrate structures also play a critical role in plant metabolism. Here, we present a simple and rapid method for preparing and analyzing N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus) using an N-glycanase specific for the release of plant-derived carbohydrate structures. To achieve this, crude trichloroacetic acid precipitates of radish homogenates were treated with PNGase H+, and labeled using 2-aminobenzamide as a fluorescent tag. The labeled N-glycan samples were subsequently analyzed by ultra performance liquid chromatography (UPLC) separation and matrix-assisted laser desorption ionization-time of flight (MALDI-TOF) mass spectrometry for a detailed structural evaluation and to quantify relative abundancies of the radish-derived N-glycan structures. This protocol can also be used for the analysis of N-glycans from various other plant species, and may be useful for further investigation of the function and effects of N-glycans on human health.

Analysis of N-glycans from Raphanus sativus Cultivars Using PNGase H+

We describe a simple and rapid method for the preparation and analysis of N-glycans from different cultivars of radish (Raphanus sativus).

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H+

In recent years, the carbohydrate moieties of plants have received considerable attention, as they are a potential source of cross-reactive, ...

High-Resolution Complexome Profiling by Cryoslicing BN-MS Analysis

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed complexes. The latter can be elegantly resolved according to molecular size using native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE). Coupling of such separations to sensitive mass spectrometry (BN-MS) has been well-established and theoretically allows for exhaustive assessment of the extractable complexome in biological samples. However, this approach is rather laborious and provides limited complex size resolution and sensitivity. Also, its application has remained restricted to abundant mitochondrial and plastid proteins. Thus, for a majority of proteins, information regarding integration into stable protein complexes is still lacking. Presented here is an optimized approach for complexome profiling comprising preparative-scale BN-PAGE separation, sub-millimeter sampling of broad gel lanes by cryomicrotome slicing, and mass spectrometric analysis with label-free protein quantification. The procedures and tools for critical steps are described in detail. As an application, the report describes complexome analysis of a solubilized endosome-enriched membrane fraction from mouse kidneys, with 2,545 proteins profiled in total. The results demonstrate identification of uniform, low-abundance membrane proteins such as intracellular ion channels as well as high resolution, complex protein assembly patterns, including glycosylation isoforms. The results are in agreement with independent biochemical analyses. In summary, this methodology allows for comprehensive and unbiased identification of protein (super)complexes and their subunit composition, providing a basis for investigating stoichiometry, assembly, and interaction dynamics of protein complexes in any biological system.

A versatile cryoslicing BN-MS protocol using a microtome is presented for high-resolution complexome profiling.

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

Proteins generally exert biological functions through interactions with other proteins, either in dynamic protein assemblies or as a part of stably formed ...

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based phosphoproteomics has transformed the way of studying plant signal transduction. However, requirement of lots of starting materials and prolonged MS measurement time to achieve the depth of coverage has been the limiting factor for the high throughput study of global phosphoproteomic changes in plants. To improve the sensitivity and throughput of plant phosphoproteomics, we have developed a stop and go extraction (stage) tip based phosphoproteomics approach coupled with Tandem Mass Tag (TMT) labeling for the rapid and comprehensive analysis of plant phosphorylation perturbation in response to osmotic stress. Leveraging the simplicity and high throughput of stage tip technique, the whole procedure takes approximately one hour using two tips to finish phosphopeptide enrichment, fractionation, and sample cleaning steps, suggesting an easy-to-use and high efficiency of the approach. This approach not only provides an in-depth plant phosphoproteomics analysis (&#62; 11,000 phosphopeptide identification) but also demonstrates the superior separation efficiency (&#60; 5% overlap) between adjacent fractions. Further, multiplexing has been achieved using TMT labeling to quantify the phosphoproteomic changes of wild-type and snrk2 decuple mutant plants. This approach has successfully been used to reveal the phosphorylation events of Raf-like kinases in response to osmotic stress, which sheds light on the understanding of early osmotic signaling in land plants.

Phosphoproteomic Strategy for Profiling Osmotic Stress Signaling in Arabidopsis

Presented here is a phosphoproteomic approach, namely stop and go extraction tip based phosphoproteomic, which provides high-throughput and deep coverage of Arabidopsis phosphoproteome. This approach delineates the overview of osmotic stress signaling in Arabidopsis.

אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis

Protein phosphorylation is crucial for the regulation of enzyme activity and gene expression under osmotic condition. Mass spectrometry (MS)-based ...

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called photoreceptors to sense and adapt to light. The red/far-red light-absorbing phytochrome photoreceptors have been studied extensively. Phytochromes exist as a family of proteins with distinct and overlapping functions in all higher plant systems in which they have been studied1. Phytochrome-mediated light responses, which range from seed germination through flowering and senescence, are often localized to specific plant tissues or organs2. Despite the discovery and elucidation of individual and redundant phytochrome functions through mutational analyses, conclusive reports on distinct sites of photoperception and the molecular mechanisms of localized pools of phytochromes that mediate spatial-specific phytochrome responses are limited. We designed experiments based on the hypotheses that specific sites of phytochrome photoperception regulate tissue- and organ-specific aspects of photomorphogenesis, and that localized phytochrome pools engage distinct subsets of downstream target genes in cell-to-cell signaling. We developed a biochemical approach to selectively reduce functional phytochromes in an organ- or tissue-specific manner within transgenic plants. Our studies are based on a bipartite enhancer-trap approach that results in transactivation of the expression of a gene under control of the Upstream Activation Sequence (UAS) element by the transcriptional activator GAL43. The biliverdin reductase (BVR) gene under the control of the UAS is silently maintained in the absence of GAL4 transactivation in the UAS-BVR parent4. Genetic crosses between a UAS-BVR transgenic line and a GAL4-GFP enhancer trap line result in specific expression of the BVR gene in cells marked by GFP expression4. BVR accumulation in Arabidopsis plants results in phytochrome chromophore deficiency in planta5-7. Thus, transgenic plants that we have produced exhibit GAL4-dependent activation of the BVR gene, resulting in the biochemical inactivation of phytochrome, as well as GAL4-dependent GFP expression. Photobiological and molecular genetic analyses of BVR transgenic lines are yielding insight into tissue- and organ-specific phytochrome-mediated responses that have been associated with corresponding sites of photoperception4, 7, 8. Fluorescence Activated Cell Sorting (FACS) of GFP-positive, enhancer-trap-induced BVR-expressing plant protoplasts coupled with cell-type-specific gene expression profiling through microarray analysis is being used to identify putative downstream target genes involved in mediating spatial-specific phytochrome responses. This research is expanding our understanding of sites of light perception, the mechanisms through which various tissues or organs cooperate in light-regulated plant growth and development, and advancing the molecular dissection of complex phytochrome-mediated cell-to-cell signaling cascades.

Investigating Tissue- and Organ-specific Phytochrome Responses using FACS-assisted Cell-type Specific Expression Profiling in Arabidopsis thaliana

The molecular basis of spatial-specific phytochrome responses is being investigated using transgenic plants that exhibit tissue- and organ-specific phytochrome deficiencies. The isolation of specific cells exhibiting induced phytochrome chromophore depletion by Fluorescence-Activated Cell Sorting followed by microarray analyses is being utilized to identify genes involved in spatial-specific phytochrome responses.

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana</em

Light mediates an array of developmental and adaptive processes throughout the life cycle of a plant. Plants utilize light-absorbing molecules called ...

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) System

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein (YFP) into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest. These constructs can then be co-transformed into Nicotiana benthamiana via Agrobacterium mediated transformation, allowing the transit expression of fusion proteins. The reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact 1-7. To test and validate the protein-protein interactions, BiFC can be used together with yeast two hybrid (Y2H) assay. This may detect indirect interactions which can be overlooked in the Y2H. Gateway technology is a universal platform that enables researchers to shuttle the gene of interest (GOI) into as many expression and functional analysis systems as possible8,9. Both the orientation and reading frame can be maintained without using restriction enzymes or ligation to make expression-ready clones. As a result, one can eliminate all the re-sequencing steps to ensure consistent results throughout the experiments. We have created a series of Gateway compatible BiFC and Y2H vectors which provide researchers with easy-to-use tools to perform both BiFC and Y2H assays10. Here, we demonstrate the ease of using our BiFC system to test protein-protein interactions in N. benthamiana plants.

Detection of Protein Interactions in Plant using a Gateway Compatible Bimolecular Fluorescence Complementation BiFC System

We have developed a technique to test protein-protein interactions in plant. A yellow fluorescent protein (YFP) is split into two non-overlapping fragments. Each fragment is cloned in-frame to a gene of interest via Gateway system, enabling expression of fusion proteins. Reconstitution of YFP signal only occurs when the inquest proteins interact.

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

We have developed a BiFC technique to test the interaction between two proteins in vivo. This is accomplished by splitting a yellow fluorescent protein ...

Profiling Thiol Redox Proteome Using Isotope Tagging Mass Spectrometry

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on Arabidopsis thaliana, a genetically tractable host plant1,2. The accumulation of reactive oxygen species (ROS) in cotyledons inoculated with DC3000 indicates a role of ROS in modulating necrotic cell death during bacterial speck disease of tomato3. Hydrogen peroxide, a component of ROS, is produced after inoculation of tomato plants with Pseudomonas3. Hydrogen peroxide can be detected using a histochemical stain 3'-3' diaminobenzidine (DAB)4. DAB staining reacts with hydrogen peroxide to produce a brown stain on the leaf tissue4. ROS has a regulatory role of the cellular redox environment, which can change the redox status of certain proteins5. Cysteine is an important amino acid sensitive to redox changes. Under mild oxidation, reversible oxidation of cysteine sulfhydryl groups serves as redox sensors and signal transducers that regulate a variety of physiological processes6,7. Tandem mass tag (TMT) reagents enable concurrent identification and multiplexed quantitation of proteins in different samples using tandem mass spectrometry8,9. The cysteine-reactive TMT (cysTMT) reagents enable selective labeling and relative quantitation of cysteine-containing peptides from up to six biological samples. Each isobaric cysTMT tag has the same nominal parent mass and is composed of a sulfhydryl-reactive group, a MS-neutral spacer arm and an MS/MS reporter10. After labeling, the samples were subject to protease digestion. The cysteine-labeled peptides were enriched using a resin containing anti-TMT antibody. During MS/MS analysis, a series of reporter ions (i.e., 126-131 Da) emerge in the low mass region, providing information on relative quantitation. The workflow is effective for reducing sample complexity, improving dynamic range and studying cysteine modifications. Here we present redox proteomic analysis of the Pst DC3000 treated tomato (Rio Grande) leaves using cysTMT technology. This high-throughput method has the potential to be applied to studying other redox-regulated physiological processes.

Reactive oxygen species level is elevated when cells encounter stress conditions. Here we show the example of 3'-3' diaminobenzidine staining as well as cysTMT labeling and mass spectrometry to profile the redox proteome in Pseudomonas syringae treated tomato leaves.

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000 not only causes bacterial speck disease in Solanum lycopersicum but also on Brassica species, as well as on ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic compartment of plant leaves is the site of several important biological processes, including cell wall formation, cellular nutrient and water uptake and export, plant-endophyte interactions and defence responses to pathogens. The infiltration-centrifugation method is well established as a robust technique for the analysis of the soluble apoplast composition of various plant species. The fluid obtained by this method is commonly known as apoplast washing fluid (AWF). The following protocol describes an optimized vacuum infiltration and centrifugation method for AWF extraction from Phaseolus vulgaris (French bean) cv. Tendergreen leaves. The limitations of this method and the optimization of the protocol for other plant species are discussed. Recovered AWF can be used in a wide range of downstream experiments that seek to characterize the composition of the apoplast and how it varies in response to plant species and genotype, plant development and environmental conditions, or to determine how microorganisms grow in apoplast fluid and respond to changes in its composition.

The Infiltration-centrifugation Technique for Extraction of Apoplastic Fluid from Plant Leaves Using Phaseolus vulgaris as an Example

This protocol details the optimized extraction of apoplast washing fluid from plant leaves, using French bean plants (Phaseolus vulgaris) as a model example.

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש<em&gt; Vulgaris Phaseolus</em&gt; כדוגמה

The apoplast is a distinct extracellular compartment in plant tissues that lies outside the plasma membrane and includes the cell wall. The apoplastic ...

שיפה Sap דגימה של כרוב napus עבור תלת-ממד-דף של חלבונים, קומפלקסים Ribonucleoprotein

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

2 ב 1: בשלב אחד טיהור זיקה לניתוח מקבילים של חלבון, מתחמי חלבון-מטבוליט

ניתוח של N- glycans של צנון sativus הזנים באמצעות PNGase H⁺

הפרדה ברזולוציה גבוהה בפרופיל מלא-ניתוח בהקפאה בסון-MS

אסטרטגיה פוספוטומית ליצירת פרופיל של איתות מתח אוסמוטי ב- Arabidopsis

חקירת רקמות ו איברים ספציפיים התגובות Phytochrome באמצעות FACS בסיוע נייד מסוג פרופיל ביטוי ספציפי ארבידופסיס thaliana

איתור של אינטראקציות חלבון הצמח באמצעות bimolecular תואם Gateway הקרינה השלמה (BiFC) מערכת

פרופיל Proteome חיזור תיאול באמצעות תיוג איזוטופ ספקטרומטריית מסה

איסוף וניתוח של

טכניקת ההסתננות-צנטריפוגה להפקת Apoplastic נוזלים מצמח עלים שימוש