Name: laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets
Uploaded: 2018-04-09T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 50 s
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ドクター マーティン ・ m ・ シュミットとラインの Fraemohs に感謝しますこの作品は、研 (ZonMW ビディ 016.126.358 輸血研究 (LSBR Nr。 1638) ランドスタイナー財団、ドイツ研究振興協会 (SFB1123/A2) R.R.K. に授与オランダ財団によって支えられました。

ここで説明したすべてのメソッドは、医療倫理とマーストリヒト大学動物倫理的な板によって承認されています。
1 ヒトの細胞とフロー ベースのアッセイ
<ol><li>
ヒトの血液から血小板を分離
	<ol>
<li>クエン酸 (3.2%) 抗凝固薬の静脈血を描画します。</li>
		<li>1/15 酸クエン酸ブドウ糖量を追加 (ACD: クエン酸ナトリウム 80 mM、52 mM クエン酸、183 mM グルコース) 血液に。</li>
		<li>多血小板血漿 (PRP) を取得する 15 分のブレーキなし 350 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>15 mL コニカル チューブに上清を転送し、ACD の 1/20 ボリュームを追加します。</li>
		<li>遠心分離機で 1,110 g 血小板貧しい血しょう (PPP) を取得する 15 分のブレーキなし。</li>
		<li>上清を捨てます。穴、血小板活性化の防止で支援することが広いピペット先端部 (1000 P) の終わりを切断し、慎重に血小板バッファー ph 6.6 PRP と同じボリュームで血小板ペレットを中断 (PB: 136 mM の NaCl、10 mM Hepes、2.7 mM KCl、2 mM MgCl2, 0.1% ウシ血清アルブミンおよび 0.1% グルコース)。ACD の 1/20 ボリュームを加え、優しく混ぜます。</li>
		<li>1,110 g 15 分ブレーキなしで血小板をペレットします。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、慎重に 1 mL 血小板バッファー (pH 7.5) で上記として血小板を中断します。</li>
		<li>多項目自動血球分析装置による 1/10 希釈で血小板濃度を測定します。</li>
		<li>2 x 107/mL の数を達成するために血小板バッファー (pH 7.5) を使用してボリュームを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
(ブリンクマンらから適応したヒトの血液から白血球の分離11 )
	<ol>
<li>抗凝固剤としてヘパリン (10 U/mL) に 24 ミリリットルの血液を描画します。</li>
		<li>1.077 グラム/mL の密度 polysucrose ナトリウム diatrizoate 媒体の 6 mL を追加 (材料表参照) 15 mL コニカル チューブと慎重に上の層 5-6 mL 全血に。</li>
		<li>ブレーキなし 800 x g で 20 分間遠心します。</li>
		<li>吸引し透明な黄色の最上位のレイヤーを破棄し、新鮮な 15 mL の円錐管に顆粒球を含む下の赤みを帯びた相を転送します。14 mL とブレーキなし 300 x g で 10 分間遠心する最終巻に 2 ミリメートルの EDTA を含む PBS を追加することによって細胞を洗浄します。</li>
		<li>一方で、密度勾配媒体の準備 (例えばパーコール、材料表を参照) 2 ml 10 x PBS 貯蔵液 18 mL 密度勾配媒体を混合することによって実用的なソリューション。PBS のこの実用的なソリューションを希釈 (1 x) 4.25 mL の 85%、80%、75%、70%、65% のグラデーション ミディアム ソリューションを取得します。</li>
		<li>密度勾配を有する円錐管の 2 を準備するには、互いの上にすべての媒体の割合の 2 mL を階層化します。最高濃度で開始し、降順で続行します。防水マーカー チューブ上にあるレイヤーをマークします。</li>
		<li>慎重に各 2 つの準備されたグラデーションに細胞懸濁液 2 mL をレイヤーします。</li>
		<li>慎重にバランスの取れた遠心でブレーキなし 800 x g で 20 分間遠心します。</li>
		<li>遠心分離の後トップ層と 65% のほとんど削除 PBMCs と (最初のリング) をレイヤーし、収集新しい管に 85% 層まで表面を残りホワイト (2 番目のリング、PMN)。</li>
		<li>PBS 2 ミリメートルの EDTA、チューブ、ブレーキなし 300 x g で 10 分間遠心を埋めることで細胞を洗浄します。</li>
		<li>上澄みを除去し、1 mL のハンクのバッファー (pH 7.45) 含む 10 mM Hepes と 0.2% アルブミン (アッセイバッファー) の堆積セル (通常 ≥95% が PMN) を停止します。</li>
		<li>診断を使用してセルをカウントし、1 x 106/mL でセルを中断します。</li>
		<li>蛍光標識と白血球 (ステップ 3.3) の灌流を続けます。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
付着性血小板および血管細胞膜の作製
	<ol>
<li>
細胞培養皿準備 (培養細胞)
		<ol>
<li>1 ml の希釈ラット尾コラーゲン (30 の μ g/mL は 0.2 μ m のフィルターでフィルター処理された PBS で希釈した) の 35 mm 細胞培養皿のコート済み。</li>
			<li>37 ° C で 30 分間インキュベート、コラーゲン液を捨て、PBS で一度お皿を洗ってください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
培養皿で血管細胞の培養
		<ol>
<li>デタッチ (例えば、血管内皮、HAoEC、HAoSMC) のプライマリまたは不死化血管細胞 (例えばEA。Hy926、SVEC) 1.5 mL 細胞剥離ソリューション (例えばaccutase) と T75 フラスコで合流に成長します。細胞剥離液を中和し、商工会議所を数えるセルとセルの濃度を決定する適切な成長媒体の 4.5 mL を追加します。(例えば、完全な内皮細胞成長培地) 適切な培地に 10 の5セル/mL × 0.5 でセルを中断します。</li>
			<li>細胞懸濁液 2 mL をそれぞれ 35 mm ディッシュに追加します。(24-48 h、細胞の種類に応じて撮影) 合流点まで 5% CO2と 37 ° C で加湿のインキュベーターで培養します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
ガラスの coverslip の準備 (付着血小板)
		<ol>
<li>塩酸エタノールで一度ガラス基板を浸す (1.2 M/50 %v/v)。</li>
			<li>純水で 2 回 coverslip をすすいでください。</li>
			<li>N2下 coverslip を乾燥させます。</li>
			<li>プレコート希薄化後のラット尾コラーゲンの灌流チェンバのチャンネルの位置に従って、100 μ L でガラス基板タイプ I (30 の μ g/mL は 0.2 μ m のフィルターでフィルター処理された PBS で希釈) です。</li>
			<li>室温で 30 分間インキュベート、コラーゲン液を捨て、洗浄 3 coverslip PBS で x。</li>
			<li>室温 0.5 h と HEPES 1 %bsa コラーゲンをコーティングした coverslip をブロックします。</li>
			<li>洗って乾燥、coverslip と灌流チェンバにマウントします。人間から血小板またはそれぞれ手順 1.1 または 2.1 に示したマウスの血を分離します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
血小板の固定化
		<ol>
<li>チャンネルあたり 2 × 107/mL 血小板懸濁液 70 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2で 1.5 時間孵化させなさい。</li>
			<li>ブロッキング液 (HEPES で 5 %bsa) と蛍光標識白血球 (ステップ 3.3) の血流と RT。 続行で少なくとも 30 分の非付着血小板を慎重に取り付けます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
血管内皮細胞単層の刺激
		<ol>
<li>37 ° C、5% CO2で 4 時間、10 ng/mL 腫瘍壊死因子 α (tnf α) が含まれている新鮮なメディアとメディアを置き換えることによって血管の細胞を刺激します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>2 マウス細胞とフロー ベースのアッセイ
<ol><li>
マウスの血液から血小板を分離
	<ol>
<li>心臓穿刺から 21 G 針 (〜 1 mL) を使用して描画血液麻酔 (ケタミン 80 mg/kg およびメデトミジン 0.3 mg/kg) 6-8 週-古いマウス (C57Bl/6) 抗凝固剤としてクエン酸 (3.2%)。</li>
		<li>ACD の 1/6 量を追加します。</li>
		<li>220 × g で遠心分離、多血小板血漿 (PRP) を取得する 5 分間の中のブレーキ。</li>
		<li>新しい管にプラス 1/3 赤の血液細胞の上清 (~ 600 μ L) を転送します。</li>
		<li>6 分のブレーキなし 95 × g で遠心分離機します。</li>
		<li>上清 (PRP) を転送し、タイロード バッファーの 1/10 倍希釈液で血小板濃度を測定 (TH バッファー: 136 mM の NaCl、5 mM Hepes、2.7 mM KCl、0.42 mM NaH2PO4* H2O、2 mM MgCl20.1% ウシ血清アルブミンおよび 0.1%ブドウ糖) 自動血球計数装置を持つ。</li>
		<li>1/25 ACD + 0.1 U/mL エンドウアピラーゼのボリュームを追加することによって血小板を洗って 2,870 g、中ブレーキを 2 分間の遠心分離機します。</li>
		<li>上澄みを廃棄し、0.1 U/mL エンドウアピラーゼや、ACD の 1/10 量 600 μ L TH バッファーを追加します。ピペット先端部 (1000 P) を切断ことが広い穴、血小板活性化の予防にも役立ちますし、そっと餌を中断します。</li>
		<li>2,870 g で遠心分離機、2 分間中ブレーキ</li>
		<li>上澄みを廃棄し、優しく回バッファー内の血小板を中断します。</li>
		<li>第 2 x 107/mL の数を達成するためにバッファーを使用してボリュームを調整します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血小板の付着性単分子膜の作製
	<ol>
<li>1.3.3 に従ってガラス基板 (付着血小板) を準備します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
血小板の固定化
	<ol>
<li>チャンネルあたり 2 × 107/mL 血小板懸濁液 100 μ L を追加し、37 ° C、5% CO2で 1.5 時間孵化させなさい。</li>
		<li>ブロッキング液 (HEPES で 5 %bsa) と蛍光標識白血球 (ステップ 3.3) の血流と RT。 続行で少なくとも 30 分の非付着血小板を慎重に取り付けます</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マウス血小板膜の刺激
	<ol>
<li>白血球 (ステップ 3.3) の灌流は、の前にトロンビンの灌流、血小板を刺激する (0.5 nM) で 37 ° C で 3 分間 HHHSA バッファー</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 蛍光標識と白血球 (PMN または人間の RAW264.7 THP 1 またはマウス フロー ベースの試金のためのプライマリ マウス単球) の血流
<ol><li>
蛍光標識
	<ol>
<li>セル側の透過物緑蛍光核酸染色 (1 μ M) と白血球 (1 x 106/mL) ラベルを付けます。37 ° C で 30 分間細胞をインキュベートします。</li>
		<li>5 分間 300 × g で遠心分離によって PBS のセルを洗浄し、0.5 106セル/mL (1 つのテスト条件、流量に応じて 5 mL) アッセイバッファーで倍の濃度に細胞を中断します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
流れの商工会議所の分析の準備
	<ol>
<li>細胞膜上に白血球の付着のため、お皿から細胞培養液を破棄し、流れ区域にそれを組み立てます。注射器にチューブを接続します。固定化血小板に白血球の付着のためマイクロ スライドを注射器に接続します。37 ° c の水浴をあらかじめ暖かく</li>
		<li>灌流シリンジ (50 mL)、インストール注射器シリンジ ホルダーとセットでポンプを撤回のモードを取る。0 mL ポンプ ボリュームを設定し、50 mL シリンジの 26.70 mm 直径を設定します。</li>
		<li>チューブの一方の端に、肘のルアーロック コネクタを接続します。ルアーロック注射器ロック カプラーを置き、ルアーロック ロック カプラーに肘ルアーロック コネクタとチューブを接続します。無料チューブ端を流れ区域に接続します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
白血球の血流と接着
	<ol>
<li>細胞膜上に白血球の付着のため、お皿から細胞培養液を破棄し、流れ区域にそれを組み立てます。注射器にチューブを接続します。固定化血小板に白血球の付着のためマイクロ スライドを注射器に接続します。</li>
		<li>白血球の血流と、血管に付着のため- または血小板膜、アッセイバッファーと塗りつぶし 1 mL ピペットでチューブを含む 50 mL の円錐管に 2 番目の管を配置し、チューブを絞るし、流れ区域にそれを接続します。</li>
		<li>白血球灌流前に細胞懸濁液に 3 mM CaCl2と 2 mM MgCl2を追加し、37 ° C で 5 分間インキュベート</li>
		<li>商工会議所とチューブから可能な空気を除去する細胞の灌流前にアッセイバッファーを灌流します。</li>
		<li>タイトな圧迫して管端を閉じ、細胞懸濁液、空気の泡が閉じ込められているを防ぐアッセイバッファーからチューブを切り替えます。最初の細胞が到着するまで適切な流動率/せん断応力を持つセルを灌流します。</li>
		<li>適切な流動率/せん断応力を 2 分間細胞灌流し、逆位相差/蛍光顕微鏡 (例えば、EVOS フロリダ) でローリングと付着性のセルの 2-6 分間に少なくとも 6 の画像をキャプチャ 100 倍の倍率を使用して接続されています。CCD や CMOS のデジタル カメラ。 メモ: フロー レート/せん断応力は、フロー槽寸法と液の粘度に依存します。ここで使用される灌流チェンバの (材料の表を参照してください)。 Τ =η* 97.1*Φ Τ: せん断応力 (1 dyn/cm2) Η: 粘度 (0.015 dyn * s/cm2) Φ: 流量 (0.67 mL/分)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
白血球解消接着
	<ol>
<li>De-adhesion、トラップになってから空気の泡を防止するチューブを押し込んでアッセイバッファーに細胞懸濁液からチューブを切り替えます。</li>
		<li>適切な流動率/せん断応力 (注を参照してください 3.3.7) アッセイバッファーによる血液灌流による細胞をデタッチします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
白血球輪廻
	<ol>
<li>白血球輪廻の白血球 (ステップ 3) を灌流まで適量の白血球の付着 (~ 50 セル/ビュー] フィールド)。</li>
		<li>アッセイバッファーで白血球のサスペンションを交換してください。</li>
		<li>37 ° C で 30-60 分毎 10-15 秒の時間経過によって細胞細胞を記録します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Dinauer, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+immune+deficiencies+with+defects+in+neutrophil+function.">Primary immune deficiencies with defects in neutrophil function.</a> American Society of Hematology. 2016 (1), 43-50 (2016).</li><li>Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte-endothelial+cell+recognition:+three+(or+more)+steps+to+specificity+and+diversity.">Leukocyte-endothelial cell recognition: three (or more) steps to specificity and diversity.</a> Cell. 67 (6), 1033-1036 (1991).</li><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Traffic+signals+for+lymphocyte+recirculation+and+leukocyte+emigration:+the+multistep+paradigm.">Traffic signals for lymphocyte recirculation and leukocyte emigration: the multistep paradigm.</a> Cell. 76 (2), 301-314 (1994).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41 (5), 694-707 (2014).</li><li>Legein, B., Temmerman, L., Biessen, E. A. 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(36), e1724 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. (77), e50586 (2013).</li><li>Schmitt, M. M. N., Megens, R. T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+junctional+adhesion+molecule-a+guides+monocytes+into+flow-dependent+predilection+sites+of+atherosclerosis.">Endothelial junctional adhesion molecule-a guides monocytes into flow-dependent predilection sites of atherosclerosis.</a> Circulation. 129 (1), 66-76 (2014).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

この生体外の試金は血管の炎症の中に白血球動員の基になるメカニズムを調査する簡単な方法が、注意すべきいくつかの重要なポイントがあります。このアッセイを正常に実行するための最初の要件は、白血球と合流、そのまま血管や血小板膜の血流です。これは、コラーゲン タイプ表面の事前コーティング私によって達成できます。一般に、第一次血管細胞を操作するときは優しく...

けが、炎症や感染症、時に白血球迅速に対応に病原体または損傷-関連分子パターン (PAMPs、DAMPs) アクティブ化された状態に変更し、血流から炎症と組織損傷のサイトに移動します。白血球の細胞・分子環境と対話できる能力は白血球接着欠乏1のような遺伝性疾患によって強調されるよう、免疫細胞としての正しい機能に不可欠です。白血球接着過去数十年の間に強烈な調査の対象とされている、初期の 1990 年代2,3における白血球接着カスケードのコンセプトになりました。白血球接着は、血管内皮細胞、血管の表面を転がしてにセルの原因への白血球のセレクチンを介したキャプチャによって開始されます。この圧延により内皮バインド渡り鳥手がかり、例えばケモカイン、インテグリンの活性化を誘導するためにスキャンする白血球です。その後、インテグリンの活性化は、しっかりした白血球逮捕で内皮配位子へのバインドを仲介します。白血球がクロールして広がり、内皮細胞の膜を貫通し、基になる組織に細胞の前に extravasate その後準備をします。正規白血球カスケードの基本概念は導入以来ほとんど変わらず、いくつかの中間の手順4を追加しました。それにもかかわらず、正確な分子メカニズムと白血球動員に関与する多くの選手の役割を持って、これまで解明されていない、白血球動員まま感染症、炎症、(自動) 免疫の分野で重要な課題研究。
たとえば、動脈硬化などの血管の炎症性疾患、血管壁ドライブ プラーク開発に白血球動員増加しました。不安定な動脈硬化性プラークが破裂する、血小板および凝固系の大規模な活性化とその後5容器の閉塞をリードします。心筋梗塞や脳卒中などの重篤な心血管リスクがあります。さらに、白血球と血小板 (例えば、マトリックス成分と滑らかな露出血管壁内部の相互作用の多数をもたらすそれは内皮細胞の侵食が臨床的に発生する例えば冠動脈ステント留置後心筋細胞) と血管傷害をカバーする血小板と白血球の。これらの相互作用が病気の新生内膜形成6、7のドライブ可能性があります単球血小板の相互作用としてのさらなる発展のために重要です。さらに、Mac 1 (αMβ2) 白血球インテグリンを介した血小板白血球の相互作用、血小板 GPIbα 最近マウス8で血栓症の新規ドライバーとして識別されています。
分離マトリックス分子の広いスペクトルと白血球と血管由来の不死化細胞株の研究との白血球と血小板の源として人間や動物の血液の普及を考えると、それは白血球のシミュレーションが可能設定、特別に設計された流灌流チャンバーを使用して実験室の流れの下での相互作用。多くの亜種は、自己粘着性灌流チャンバー真空駆動からまで、過去十年にわたって設計されています。すべての亜種は、不動の部分 (例えば、培養血管細胞または基質タンパク質) が動かない部分に液の灌流を有効にする事前に定義されたチャネルを装備した大きい防漏チャンバーに組み立てられる公有地であります。さらに、成形技術の進歩には、シリカ ポリマー9に基づくカスタム ソリューションの開発が有効になります。粘度と灌流の流体の流量とチャネルの高さ主流灌流装置10のせん断応力特性が決まります。この記事で提案する体外付着のメカニズムを研究、解き放つ接着法と静脈および動脈の流れの政体の下で白血球の輪廻。紹介した方法の利点は彼らが一般的なカメラに接続された蛍光顕微鏡を使用して実行できます、高い技術的な能力を所有する実験者を必要としません。In vitroアッセイ (例えば、阻害剤を追加または遮断抗体によって)、多くの方法で操作することができますつまり、血管の炎症のさまざまなモデルの適用とタンパク質機能接着の調査を可能または特定の化合物の評価。

<table><tbody><tr><td>Inverted fluorescence microscope e.g. EVOS-FL</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pump &lt;em&gt;e.g.&lt;/em&gt; model: 210-CE</td><td>&amp;nbsp;world precision instruments</td><td>78-9210W</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 35 mm TC-Treated Easy-Grip Style Cell Culture Dish</td><td>corning</td><td>353001</td><td></td></tr><tr><td>50 mL syringe</td><td>Becton Dickinson</td><td>300137</td><td></td></tr><tr><td>Silicone tubing&amp;nbsp;</td><td>VWR</td><td>228-0700</td><td></td></tr><tr><td>Elbow Luer Connector Male</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Female Luer Lock Coupler</td><td>Ibidi</td><td>10823</td><td></td></tr><tr><td>Flow chamber</td><td>University Hospital RWTH Aachen</td><td></td><td>Patent DE10328277A1: Baltus T, Dautzenberg R, Weber CPD. Str&amp;ouml;mungskammer zur in-vitro-Untersuchung von physiologischen Vorg&amp;auml;ngen an Zelloberfl&amp;auml;chen. 2005.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ibidi sticky slide VI 0.4</td><td>Ibidi</td><td>80608</td><td></td></tr><tr><td>Coverslips for sticky slides&amp;nbsp;</td><td>Ibidi</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Collagen Type I, rat tail</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>A1048301</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant Human TNF-&amp;alpha;</td><td>Peprotech</td><td>300-01A</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin Receptor Activator for Peptide 6 (TRAP - 6)</td><td>Anaspec / Eurogentec</td><td>24191</td><td></td></tr><tr><td>SYTO 13 green fluorescent nucleic acid stain</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>S7575</td><td></td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; Balanced Salt Solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>H4641</td><td></td></tr><tr><td>HEPES buffer solution 1M, liquid</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>15630049</td><td></td></tr><tr><td>BUMINATE Albumin, 25%&amp;nbsp;</td><td>Baxter</td><td>60010</td><td></td></tr><tr><td>Water for injection</td><td>B. Braun</td><td>3624315</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride dihydrate</td><td>Merck</td><td>102382&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>M2670</td><td></td></tr><tr><td>Apyrase</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>A6535</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVEC)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-12203</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Medium (Ready-to-use)</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-22010</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Endothelial Cells (HAoEC)</td><td>ATCC</td><td>&amp;nbsp;PCS-100-011</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Cell Basal Medium&amp;nbsp;</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-030</td><td></td></tr><tr><td>Endothelial Cell Growth Kit-BBE</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-040</td><td></td></tr><tr><td>Primary Human Aortic Smooth Muscle Cells (HAoSMC)</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-012</td><td></td></tr><tr><td>Vascular Smooth Muscle Cell Growth Kit</td><td>ATCC</td><td>PCS-100-042</td><td></td></tr><tr><td>Human endothelial cell line, EA.hy926</td><td>ATCC</td><td>CRL-2922</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM)</td><td>ATCC</td><td>30-2002</td><td></td></tr><tr><td>Mouse endothelial cell line, SV 40 transformed (SVEC4-10)</td><td>ATCC</td><td>CRL-2181</td><td></td></tr><tr><td>Human Monocytic cell line, THP-1</td><td>DSMZ</td><td>ACC-16</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 with Ultra-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE12-702F/U1</td><td></td></tr><tr><td>Mouse monocyte/macrophage RAW264.7</td><td>ATCC</td><td>TIB-71</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle&#039;s Medium (DMEM), high glucose</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Promocell GmbH</td><td>C-41310</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>P1644</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque 1119</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>11191</td><td></td></tr><tr><td>10x PBS</td><td>Life Technologies Europe bv</td><td>14200075</td><td></td></tr><tr><td>BD&amp;nbsp;Vacutainer Plastic Blood Collection Tubes with Sodium Heparin</td><td>Becton Dickinson</td><td>367876</td><td></td></tr><tr><td>VACUETTE TUBE 9 ml 9NC Coagulation sodium citrate 3.2%&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>HCl/EtOH mixture (1.2 mol/L HCl and 50% ethanol) in water</td><td>Sigma-Aldrich Chemie</td><td>Prepare by mixing 0.3L HCl (4 mol/L) with 0.7L of 70% v/v ethanol in a fume hood</td><td></td></tr></tbody></table>

laminar flow-based assays to investigate leukocyte recruitment on cultured vascular cells and adherent platelets

損傷やけがや組織の損傷部位に炎症時の白血球の募集は最近数十年間に調べたし、白血球接着連鎖の概念をもたらしました。ただし、白血球動員に関与する正確な分子メカニズムがまだ特定されていない完全に。接着のメカニズムを研究、解き放つ接着簡単流アッセイを提案する白血球動員に感染、炎症、および (自動-) 免疫研究の分野で重要な課題が残っているので、静脈と動脈の流れの政体の下で白血球の輪廻。生体外の試金を使用して、白血球と血管の炎症のさまざまなモデルの携帯パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを研究できます。このプロトコルは白血球と血管内皮細胞や血小板、可視化と、記録することができますとの相互作用を研究する並列フロー チャンバーとカメラに接続されている倒立位相差顕微鏡を使用して層流ベースの試金を記述します。オフライン分析。白血球や血小板、血管内皮細胞は、阻害剤またはこのプロセス中に特定の分子の役割を決定する抗体で前処理することができます。せん断条件、すなわち動脈または静脈剪断応力は粘性や灌流の流体の流量とチャネルの高さ簡単に合わせることができます。

内皮白血球接着を研究に蛍光に分類された thp-1 細胞灌流 tnf α または非-刺激血管内皮膜 3 ダイン/cm2で 2 分間以上。付着性単球細胞の合計数は、2-6 分の期間にわたって六つの独立したフィールドをキャプチャすることにより血流の 2 分後定められました。付着性のセル (例えば、EVOS フロリダ) 倒立位相差/蛍光顕微鏡で撮影した少なくとも 6 で定量化さ?...

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Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

laminar-flow-based-assays-to-investigate-leukocyte-recruitment-on

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.5K ビュー.  Maastricht University. 炎症時に血管壁の損傷後、白血球は血管細胞と血小板との対話熱心。ここでは、白血球や細胞パートナー間の相互作用の根底にある分子メカニズムを特徴付ける簡単流アッセイについて述べる。

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Parallel-plate Flow Chamber and Continuous Flow Circuit to Evaluate Endothelial Progenitor Cells under Laminar Flow Shear Stress

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well quantifiable fluid shear stresses1.
Our flow chamber design and flow circuit (Fig. 1) contains a transparent viewing region that enables testing of cell adhesion and imaging of cell morphology immediately before flow (Fig. 11A, B), at various time points during flow (Fig. 11C), and after flow (Fig. 11D). These experiments are illustrated with human umbilical cord blood-derived endothelial progenitor cells (EPCs) and porcine EPCs2,3.
This method is also applicable to other adherent cell types, e.g. smooth muscle cells (SMCs) or fibroblasts.
The chamber and all parts of the circuit are easily sterilized with steam autoclaving. In contrast to other chambers, e.g. microfluidic chambers, large numbers of cells (&gt; 1 million depending on cell size) can be recovered after the flow experiment under sterile conditions for cell culture or other experiments, e.g. DNA or RNA extraction, or immunohistochemistry (Fig. 11E), or scanning electron microscopy5. The shear stress can be adjusted by varying the flow rate of the perfusate, the fluid viscosity, or the channel height and width. The latter can reduce fluid volume or cell needs while ensuring that one-dimensional flow is maintained. It is not necessary to measure chamber height between experiments, since the chamber height does not depend on the use of gaskets, which greatly increases the ease of multiple experiments. Furthermore, the circuit design easily enables the collection of perfusate samples for analysis and/or quantification of metabolites secreted by cells under fluid shear stress exposure, e.g. nitric oxide (Fig. 12)6.

We are describing a method to subject adherent cells to laminar flow shear stress in a sterile continuous flow circuit. The cells' adhesion, morphology can be studied through the transparent chamber, samples obtained from the circuit for metabolite analysis and cells harvested after shear exposure for future experiments or culture.

層流のせん断応力下の内皮前駆細胞を評価するために、平行平板フローチャンバーと定常流回路

The overall goal of this method is to describe a technique to subject adherent cells to laminar flow conditions and evaluate their response to well ...

生物工学

Analysis of Physiologic E-Selectin-Mediated Leukocyte Rolling on Microvascular Endothelium

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone and inflamed tissues.  E-selectin expression is constitutive on dermal and bone microvessels and is inducible by pro-inflammatory cytokines, such as IL-1&#945;/  and TNF-&#945;, on microvessels in inflamed tissues.  This lectin receptor mediates weak binding interactions with carbohydrate counter-receptor ligands on circulating leukocytes, which results in a characteristic  rolling  behavior.  Because these interactions precede more stable adhesive events and diapedesis activity, characterization of leukocyte rolling activity and identification of leukocyte E-selectin ligands have been major goals in studies of leukocyte trafficking and inflammation and in the development of anti-inflammatory therapeutics (1-5).  The intent of this report is to provide a visual, comprehensive description of the most widely-used technology for studying E-selectin   E-selectin ligand interactions under physiologic blood flow conditions.  Our laboratory in conjunction with the Harvard Skin Disease Research Center uses a state-of-the-art parallel-plate flow chamber apparatus accompanied by digital visualization and new recording software, NIS-Elements.  This technology allows us to analyze adhesion events in real time for onscreen visualization as well as record rolling activity in a video format.  Cell adhesion parameters, such as rolling frequency, shear resistance and binding/tethering efficiency, are calculated with NIS-Elements software, exported to an Excel spreadsheet and subjected to statistical analysis.  In the demonstration presented here, we employed the parallel-plate flow chamber to investigate E-selectin-dependent leukocyte rolling activity on live human bone marrow endothelial cells (hBMEC).  Human hematopoietic progenitor KG1a cells, which express a high level of E-selectin ligand, were used as our leukocyte model, while an immortalized hBMEC cell line, HBMEC-60 cells, was used as our endothelial cell model (6).  To induce and simulate native E-selectin expression in the flow chamber, HBMEC-60 cells were first activated with IL-1 .  Our video presentation showed that parallel-plate flow analysis is a suitable method for studying physiologic E-selectin-mediated leukocyte rolling activities and that functional characterization of leukocyte E-selectin ligand(s) in the flow chamber can be ascertained by implementing protease or glycosidase digestions.

This report provides a visual depiction of parallel-plate flow chamber analysis for studying leukocyte endothelial interactions under physiologic shear stress. This method is particularly useful for investigating the role of endothelial (E)-selectin and leukocyte E-selectin ligands that trigger leukocyte rolling on endothelial cell surfaces.

微小血管内皮上で生理的E -セレクチンを介した白血球のローリングの分析

E-selectin is a type-1 membrane protein on microvascular endothelial cells that helps initiate recruitment of circulating leukocytes to cutaneous, bone ...

生物学

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価する<em&gt;エクスビボ</em&gt; Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

A Flow Adhesion Assay to Study Leucocyte Recruitment to Human Hepatic Sinusoidal Endothelium Under Conditions of Shear Stress

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the development of fibrosis and progression to cirrhosis. Understanding the molecular mechanisms that mediate leucocyte recruitment to the liver could identify important therapeutic targets for liver disease. The key interaction during leucocyte recruitment is that of inflammatory cells with endothelium under conditions of shear stress. Recruitment to the liver occurs within the low shear channels of the hepatic sinusoids which are lined by hepatic sinusoidal endothelial cells (HSEC). The conditions within the hepatic sinusoids can be recapitulated by perfusing leucocytes through channels lined by human HSEC monolayers at specific flow rates. In these conditions leucocytes undergo a brief tethering step followed by activation and firm adhesion, followed by a crawling step and subsequent transmigration across the endothelial layer. Using phase contrast microscopy, each step of this &#39;adhesion cascade&#39; can be visualized and recorded followed by offline analysis. Endothelial cells or leucocytes can be pretreated with inhibitors to determine the role of specific molecules during this process.

Leucocyte recruitment to the liver occurs within the specialized channels of the hepatic sinusoids which are lined by unique hepatic sinusoidal endothelial cells. Phase contrast microscopy of leucocyte recruitment across human hepatic sinusoidal endothelium under conditions of physiological shear stress can facilitate the elucidation of the molecular mechanisms which underlie this process.

せん断応力のヒト肝類洞内皮条件のことを白血球の募集を研究するフロー接着アッセイ

Leucocyte infiltration into human liver tissue is a common process in all adult inflammatory liver diseases. Chronic infiltration can drive the ...

免疫・感染学

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells (hiPSC-ECs)

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected tissues via a well-characterized cascade of pro-adhesive receptors which are upregulated on the leukocyte cell surface upon the inflammatory trigger. Inflammatory responses differ between individuals in the population and the genetic background can contribute to these differences. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have been shown to be a reliable source of ECs (hiPSC-ECs), thus representing an unlimited source of cells that capture the genetic identity and any genetic variants or mutations of the donor. hiPSC-ECs can therefore be used for modeling inflammatory responses in donor-specific cells. Inflammatory responses can be modeled by determining leukocyte adhesion to the hiPSC-ECs under physiological flow. This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

Microfluidic Assay for the Assessment of Leukocyte Adhesion to Human Induced Pluripotent Stem Cell-derived Endothelial Cells hiPSC-ECs

This step-by-step protocol provides a detailed description of the experimental setup and data analysis for the assessment of inflammatory responses in hiPSC-ECs and the analysis of leukocyte adhesion under physiological flow.

ひと誘導多能性幹細胞由来血管内皮細胞 (による ECs) へ白血球接着の評価のためのマイクロ流体アッセイ

Endothelial cells (ECs) are essential for the regulation of inflammatory responses by either limiting or facilitating leukocyte recruitment into affected ...

発生生物学

Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we describe two in vitro &#8220;vascular&#8221; models for studying the recruitment of circulating neutrophils from flow by inflamed endothelial cells. A major advantage of these models is the ability to analyze each step in the leukocyte adhesion cascade in order, as would occur in vivo. We also describe how both models can be adapted to study the role of stromal cells, in this case mesenchymal stem cells (MSC), in regulating leukocyte recruitment.
Primary endothelial cells were cultured alone or together with human MSC in direct contact on Ibidi microslides or on opposite sides of a Transwell filter for 24 hr. Cultures were stimulated with tumor necrosis factor alpha (TNF&#945;) for 4 hr and incorporated into a flow-based adhesion assay. A bolus of neutrophils was perfused over the endothelium for 4 min. The capture of flowing neutrophils and their interactions with the endothelium was visualized by phase-contrast microscopy.
In both models, cytokine-stimulation increased endothelial recruitment of flowing neutrophils in a dose-dependent manner. Analysis of the behavior of recruited neutrophils showed a dose-dependent decrease in rolling and a dose-dependent increase in transmigration through the endothelium. In co-culture, MSC suppressed neutrophil adhesion to TNF&#945;-stimulated endothelium.
Our flow based-adhesion models mimic the initial phases of leukocyte recruitment from the circulation. In addition to leukocytes, they can be used to examine the recruitment of other cell types, such as therapeutically administered MSC or circulating tumor cells. Our multi-layered co-culture models have shown that MSC communicate with endothelium to modify their response to pro-inflammatory cytokines, altering the recruitment of neutrophils. Further research using such models is required to fully understand how stromal cells from different tissues and conditions (inflammatory disorders or cancer) influence the recruitment of leukocytes during inflammation.

The ability of inflamed endothelium to recruit leukocytes from flow is regulated by mesenchymal stromal cells. We describe two in vitro models incorporating primary human cells that can be used to assess neutrophil recruitment from flow and examine the role that mesenchymal stromal cells play in regulating this process.

フローから白血球の補充に間質細胞の影響を分析する

Stromal cells regulate the recruitment of circulating leukocytes during inflammation through cross-talk with neighboring endothelial cells. Here we ...

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Simultaneous Study of the Recruitment of Monocyte Subpopulations Under Flow In Vitro

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development and autoimmune diseases. This is facilitated through a process of capture from free flow onto the luminal surface of activated endothelial cells, followed by their adhesion and transendothelial migration (transmigration) into the underlying affected tissue. However, the mechanisms that support the preferential and context-dependent recruitment of monocyte subpopulations are still not fully understood. Therefore, we have developed a method that allows the recruitment of different monocyte subpopulations to be simultaneously visualized and measured under flow. This method, based on time-lapse confocal imaging, allows for the unambiguous distinction between adherent and transmigrated monocytes. Here, we describe how this method can be used to simultaneously study the recruitment cascade of pro-angiogenic and non-angiogenic monocytes in vitro. Furthermore, this method can be extended to study the different steps of recruitment of up to three monocyte populations.

Here, we present an integrated protocol that measures monocyte subpopulation trafficking under flow in vitro by use of specific surface markers and confocal fluorescence microscopy. This protocol can be used to explore sequential recruitment steps as well as to profile other leukocyte subtypes using other specific surface markers.

体外流れ球サブポピュレーションの募集の同時研究

The recruitment of monocytes from the blood to targeted peripheral tissues is critical to the inflammatory process during tissue injury, tumor development ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

An In Vitro Flow Investigation of the Effect of Stromal Cells on Leukocyte Recruitment

Source: Munir, H. et al., <a href="https://appjove.unicartagenaproxy.elogim.com/v/52480">Analyzing the Effects of Stromal Cells on the Recruitment of Leukocytes from Flow.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2015)
The video demonstrates a method for investigating the impact of stromal cells on leukocyte recruitment. In a parallel plate flow chamber model, pro-inflammatory cytokines induce the expression of adhesion receptors by endothelial cells, facilitating neutrophil recruitment and migration. The cross-talk between stromal cells and endothelial cells diminishes neutrophil recruitment to the endothelial cells.

白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

All procedures involving sample collection have been performed in accordance with the institute&#39;s IRB guidelines.
1. Isolation and Culture of Primary ...