CMは、C1-インヒビター欠損症（HAEi）、Viralen van Het UMC Utrecht、およびLandsteiner for Blood Transfusion Research（LSBR）の国際患者医療機関からの資金援助を認めています。

この研究のものを含む、 生体外での研究目的のために、血液の採取を承認した大学医療センターユトレヒトの地方医療倫理委員会。 1.ソリューションの準備<ol><li> 10mMのHEPES、0.5mMのNa 2 HPO 4、145mMのNaCl、5mMのKCl、1mMのMgSO 4 、および5.55mMのD-グルクロン酸を溶解することによって4-（2-ヒドロキシエチル）-1-ピペラジンエタンスルホン酸（HEPES）タイロード緩衝液を調製する。蒸留水中のグルコース。 <ol><li>緩衝液の2つの変異体を作製する：pHレベルをそれぞれ6.5および7.4に設定する。実験の毎日のために新鮮な緩衝液を作る。 10 ng / mLのプロスタサイクリンを補充する。 </li></ol></li><li> 50mM Trisと150mM NaClを蒸留水に溶解し、pHを9.0に調整してTRIS緩衝食塩水（TBS）を調製します。 </li><li> 85 mMクエン酸三ナトリウム、71 mMクエン酸、111 mM D-グルコースを溶解して酸クエン酸デキストロース（ACD）を調製する。澄んだ水。 </li><li> HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）に2％（v / v）パラホルムアルデヒド（PFA）を加えて固定液を調製する。溶解させるために加熱し（50〜70℃）、pHを7.4に設定する。等分し、-20℃で保存する。使用前に37℃で解凍する。 </li><li> 1％（m / v）のヒト血清アルブミン（HSA）をHEPESタイロードバッファー（pH 7.4）に溶解してブロッキングバッファーを調製する</li><li> グリセロール12gにポリビニルアルコール4.8gを加えてポリビニルアルコール溶液を調製し、よく混合する。 12mLの蒸留水を加え、室温で一晩回転器に放置する。 <ol><li> 0.2M Tris-HCl（pH8.5）24mLを添加する。 30分間混合しながら50℃に加熱する。 1.25gの1,4-ジアザビシクロ[2.2.2]オクタン（DABCO）を添加し、よく混合する。 1,500 xgで5分間遠心分離する。等分した上清（15-20のスライドには1mLで十分です）を-20℃で保存します。アリコートは一度使用してください。 </li></ol></li></ol>カバーガラスの準備<ol><li> Degreaseカバー原液（25×50mm 2 ）中に希釈していないクロム硫酸で一晩インキュベートする。カバーグラスを蒸留水ですすぎ、オーブンで60℃で一晩乾燥させます。 </li><li>パラフィン膜（10×15cm 2 ）のストリップを実験室のベンチの上に水滴で付着させ、パラフィン膜を平滑にして空気を除去する。パラフィン膜上に10μg/ mLのVWFまたは100μg/ mLのフィブリノーゲンの80μLのピペットを滴下する。眼鏡を滴の上に置きます。タンパク質溶液は2つの表面の間に広がり、ガラスの裏面全体を覆う。室温（RT）で1.5時間インキュベートする。 </li><li>パラフィン膜を除去し、コーティングされた面をブロッキング緩衝液を含む4ウェルプレートに入れて、カバーガラスを置いてブロックする。 37℃で1時間または4℃で一晩インキュベートする。対照として、VWFまたはフィブリノゲンでコーティングされていないカバーガラスをブロックする。 </li></ol>血小板富化血漿（PRP）の調製</p&gt; <ol><li>静脈穿刺によりクエン酸塩全血（最終濃度：0.32％クエン酸ナトリウム（M / V））を採取する。 </li><li>ブレーキなしで160 xgおよびRTで15分間血液を遠心分離する。プラスチックのパスツールピペットで上清（ すなわち、 PRP）を集める。 注：遠心分離後、3つの層が上から下に観察される：PRP、白血球、および赤血球。白と赤のセルは含めないでください。典型的には、9mLの血液チューブを遠心分離した後、3mLのPRPを収集することができる。 </li><li>実験が洗浄された血小板を用いて行われる場合は、セクション4に進む。 PRPが必要な場合は、次の手順に進みます。 </li><li> PRPを採取した後、残りの血液（赤血球を含む）を再び2,000 xgで10分間、ブレーキをかけずに遠心します。血小板欠乏血漿（PPP）を含む上清を集める。 注：通常、この2回目の遠心分離ステップ後に2 mLを集めることができます。 </li><li> pの数を数えるラットレットをPRPに添加し、150,000血小板/μLの濃度までPPPで希釈する（ステップ3.4）。 注：希釈PRPの総量は、ドナーの血小板数に依存する。血小板数はドナー間で大きく異なり、PRP希釈は個々の基準で評価する必要があります。血小板数は、150,000〜450,000血小板/μLの範囲内で正常とみなされます。 </li><li>セクション5に進みます。 </li></ol> 4.洗浄された血小板の調製<ol><li>細胞分析装置を用いてPRP中の平均血小板容積（MPV）を決定する。 注：これは血小板プレ活性化の指標です11 。血小板を静止させるための正常なMPVは、7.5〜11.5fLである11 。 MPVは、血小板洗浄処置中に1.5fL以上増加してはならない。 </li><li>血小板の前活性化を防ぐためにPRPに1/10容量のACDを加え、ブレーキなしで400 xgおよびRTで15分間遠心する。 suを削除するHEPESタイロードバッファー（pH 6.5）中でペレットを注意深くPRPの元の容量に再懸濁する。 </li><li> 10μg/ mLの濃度にTBSを添加することによってプロスタサイクリンのアリコートを解凍する;それを氷上に保つ。 </li><li>血小板の活性化を防ぐために、再懸濁した血小板にプロスタサイクリンを10ng / mLの最終濃度で添加し、すぐにブレーキなしで400xgおよび室温で15分間遠心する。上清を除去し、HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）中で注意深くペレットを再懸濁する。 </li><li>血小板の数をカウントし（ステップ3.5）、MPVの変化を決定する（ステップ4.1）（MPVは1.5fLを超えて変化してはならない）。 </li><li> HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）を用いて150,000血小板/μLの濃度に血小板数を調整する。実験に先立ち、血小板をRTで30分間回復させる。隔離後4時間以内に洗浄した血小板を実験に使用する。 </li></ol> 5.フローチェンバーアセンブリ12を使用しています。さらなる分析のために優先的に除去可能なカバーガラスを保持することができる限り、様々な商業的に製造されたフローチャンバを使用することができる。記載された実験に使用されるフローチャンバーは、ポリ（メチルメタクリレート）から作られ、顕微鏡インサートステージに正確に適合する。それは、入口と出口（ 図1A〜C ; 1,2）、および真空接続（ 図1AおよびC ; 3）を含む。カスタマイズされたシリコンシート（ 図1AおよびD ; 4）が上に配置される。カバーガラス（ 図1A ; 6）をチャンバーにしっかりと取り付けるために、2つの切り欠きが真空チャンネルを形成します（ 図1AおよびD ; 5）。中央の切り欠きが流路を形成する（ 図1A </strong&gt;とD ; 7;幅2.0mm、高さ0.125mm）。入口および出口は流路に接続され、真空は真空チャネルに接続される。 <ol><li>フローチャンバーの上部を蒸留水で覆い、カスタマイズされたシリコンシートを滑らかな面を下にして水の上に置きます。シートを所定の位置に保持したまま余分な水分を除去してシートを定位置に浮かせます。 注：このシリコーンシートは再使用可能です（シリコーンはその不活性特性で知られています）。一般に、血小板はそれに付着することが観察されていない。シートは洗剤で拭き取ることができ、材料が損傷するまで（ すなわち 、特にチャネル間の領域で裂ける）、再使用することができる。一般に、シートは1日に複数の実験を行って20日間使用することができる。 </li><li> 60℃で1時間フローチャンバーをインキュベートして残留水を蒸発させて、シリコーンシートをフローチャンバーにしっかりと接着させます。 </li><li>プラスチックのパスツールピペットで、HEPES Tyrode緩衝液（pH7.4）を流路に流した。コーティングされた面を下にして、カバーガラス（セクション2を参照）をフローチャネル上に置きます。真空ポンプを真空接続部に接続します（ 図1Aおよび図 C ; 3）。 10kPaの圧力をかけてください。 </li></ol> 6.血小板の前染色および抗体の調製<ol><li> 血小板染色 <ol><li>洗浄した血小板を10μg/ mLのDAPIと共に30分間37℃で暗所でインキュベートする。結合していないDAPIを洗い流し、血小板活性化を防ぐために、プロスタサイクリンを最終濃度10ng / mLで添加し、即座にブレーキなしで400xgおよびRTで15分間遠心分離する。 </li><li>血小板ペレットをHEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）で再構成して、150,000血小板/μLの血小板濃度にする。 </li></ol></li><li> 抗体の調製 <ol><li>ビオチン標識抗体とAlexa標識strepを混合するタビジンを1：1のモル比で含む。使用前に室温で最低10分間インキュベートする（ステップ7.6）。 注：ビオチン標識効率は、バッチごとに異なる場合があります。標的分子の視覚化に問題がある場合、成功したビオチン化および特異的ビオチン化抗体の標的結合特性を確認するための対照実験を実施すべきである。 </li></ol></li></ol> 7.灌流<ol><li>蛍光顕微鏡と顕微鏡ソフトウェアを起動します。 表1に示す顕微鏡設定を使用します。 注：顕微鏡ソフトウエアに適切な実験をロードすることにより、血小板および選択された蛍光標識抗体および/または色素の生細胞視覚化および記録のための顕微鏡および記録設定を開始する。室温でフロー実験を行う。 </li><li>チューブに10 mLシリンジを接続し、1％HSA bloを吸引して吸入チューブをブロックする入口チューブに緩衝液を入れる。 RTで15分間インキュベートする。 HEPES Tyrode緩衝液（pH 7.4）を吸入管に吸引することによって吸入管をすすぐ。 </li><li>ブロックされたインレットチューブと未処理のアウトレットチューブを直径1.02 mm、長さ約20-30 cmでチャンバーの入口と出口に接続します。出口チューブに10 mLのシリンジを接続します（より正確には、容量を小さくしてください）。シリンジポンプの電源を入れます。 注記：シリンジの直径は、ポンプに設定された流量と組み合わせて、容積流量を決定します。流路の表面積と共に、せん断速度は、式13に従って計算することができる 以下。したがって、シリンジポンプの流量を変更することによって、または流路の寸法を変更することによってせん断速度を操作することが可能である。せん断速度800〜1,600s -1は、典型的には動脈血流をモデルとし、25〜100s -1モデルは静脈血フロー。この設定では、7.5μL/分の流速は25s -1のせん断速度をもたらす。 せん断速度= 6Q / h 2 w -1 s -1 ここで、Q =容積流量（mL / s）、h =高さチャンネル（cm）（0.0125cm、これはシリコーンシートの厚さ）、w =幅チャンネル（cm）（このチャンバーでは0.2cm）。 </li><li> 100倍の対物レンズ（1000倍の全増幅）に1滴の浸漬オイルを置き、ガラス面を下にして顕微鏡にチャンバーを取り付けます。 </li><li>インレットチューブをHEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）を入れたチューブに入れます。出口チューブに接続されたシリンジのプランジャーを手動で引っ張り、溶液をチャンバーに通してシステムから空気を除去します。シリンジポンプ（ 図1B およびC ; 8）にシリンジを置き、ポンプを短時間作動させてプランジャーを締め、安定した流れを確保します。 </li><li>血小板懸濁液またはPRPに抗体および/または色素を慎重に添加する。プラスチックピペットで混合し、混合物を1.5mLチューブに移す。 注：せん断速度25s -1 （7.5μL/分）での典型的な30分間の灌流のために、最低225μLの血小板懸濁液が必要である。代表的な結果に用いた抗体を表2に示す。 </li><li> HEPES Tyrodeの緩衝液（pH 7.4）から、PRPまたは洗浄した血小板、抗体および/または色素（ 図1B およびC ; 9）の入った1.5mLチューブに注入チューブを押し込みながら移動させます。 注記：チューブを移動するとき、チューブに空気が入るのを防ぐために、チューブを絞る（空気を押し出す）ことが重要です。同様の方法で入口チューブを別のチューブに移動させることにより、後続のステップで様々な試薬で接着血小板を治療することが可能である。潜在的に有用な試薬のリストを表3に示す 。 </li><li> 「ライブ映像を選択するn &quot;オプションを使用して、カバーガラスの表面に顕微鏡を向け、血小板がフローチャンバーに達するまで1,600 s-1 （484μL/分） の剪断速度でポンプを始動させます。シリンジポンプの設定を7.5μL/分の流量に変更することにより、せん断速度を25 s-1に戻します。 </li><li>カバーグラスのコーティングされた面の表面をモニターし、最初の血小板が付着し始めるのを待って顕微鏡をこの血小板に合焦させ、ソフトウェアで実験を開始して記録を開始する。ここで使用される録画設定については、 表1を参照してください。 </li><li>ライブ録画を視覚的に追跡します。 30分後、シリンジポンプを停止する。 注：実験中に血小板にフォーカスが当たっていることを確認してください。典型的には、20〜30枚の血小板が視野内に1,000倍の倍率で付着する。これは流路全体で約2,000〜3,000の血小板である。 </li><li> 使用して固定フローチャンバー（オプション）。 <ol><li>シリンジポンプが停止した後にフローが停止したら、注入チューブ（空気なし）を固定溶液に移します。ポンプを再起動し、手順7.8で述べたのと同じ流量で最低10分間、チャンネルを通して固定バッファーを流します。 </li></ol></li><li>顕微鏡からチャンバーを取り出し、ガラスから浸漬油をきれいにし、真空を外し、18Gの針でカバーガラスをチャンバーから慎重に取り出します。 注記：カバーガラスが破損してシリコンシートが損傷するのを防止します。 </li><li>蒸留水で予め濡らした組織の上にある4ウェルプレートにカバースライド（細胞を上向きにして）を置く。 注：これにより、カバーガラスがウェルの表面に付着するのを防ぎ、乾燥を防ぎます。 </li><li>カバーグラスの上に750μLの固定液をピペットで入れ、室温で1時間インキュベートする。試料を直接分析することができない場合、安定した固定を確実にするために、4℃で0.5％PFA（HEPES Tyrode緩衝液、pH 7.4で希釈）に保存してください。イメージングのためにカバーガラスを処理するには、セクション8に進んでください。 </li><li>使用後、チャンバー、配管、およびシートを蒸留水ですすぎ、洗剤溶液で一晩インキュベートする。チャンバーやその他の部品を再使用する前に、蒸留水ですすいでください。 </li><li>すべてのメタデータを含む顕微鏡生データファイルを保存します。必要に応じて、ムービーを.MOV、h.264圧縮、または.AVIを非圧縮にエクスポートします。別々のフレームをJPEGまたはTIFファイルとして保存します。 </li></ol>共焦点蛍光顕微鏡の試料調製<ol><li>カバーグラスを新しい4ウェルプレートに移し、3 mLのHEPESタイロードバッファー（pH 7.4）で5回リンスします。 3mL /ウェルのブロッキング緩衝液を添加し、室温で1時間インキュベートする。 </li><li>ブロッキングバッファを削除します。 HEPESタイロード緩衝液（pH 7.4）中に0.15％グリシン（M / V）3mL /ウェルを添加する。 Rで15分間インキュベートするT. </li><li>グリシン溶液を除去し、3mL /ウェルのブロッキング緩衝液で5回洗浄する。必要に応じて、追加の染色のためにブロッキング緩衝液で希釈したフルオロフォア結合抗体を添加する。暗所でRTで1時間インキュベートする。 </li><li>ブロッキングバッファーで5回、蒸留水で2回洗浄する。細胞に触れることなく、余分な液体をティッシュで（縁の内側から）取り除いてガラスを乾燥させます。 </li><li>顕微鏡スライド上に60μLのポリビニルアルコール溶液をピペットで加える。細胞を落とした上にカバーガラスを置き、ポリビニルアルコールを2つの表面の間に広げます。暗所でRTで一晩インキュベートする。 </li><li>共焦点顕微鏡法で細胞を分析する14 。 </li><li>すべてのメタデータを含む記録されたスタックデータの生データファイルを保存します。必要に応じて、RAWデータファイルをMOV、h.264圧縮ファイル、または.AVI非圧縮ファイルに処理します。別々のスタックをJPEGまたはTIFファイルとして保存します。 </li></ol>

<ol>
	<li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=von+Willebrand+factor,+Jedi+knight+of+the+bloodstream.">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li><li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+granule+exocytosis:+a+comparison+with+chromaffin+cells.">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11 (2013).</li><li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines.">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li><li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein.">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li><li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules:+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis.">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li><li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+&#945;-granules.">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet &#945;-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li><li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells,+their+extracellular+matrix,+and+purified+components.">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li><li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro.">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li><li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation.">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li><li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity.">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li><li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation:+methodological+issues.">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li><li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood.">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li><li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH.">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li><li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spinning-disk+confocal+microscopy:+present+technology+and+future+trends.">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li><li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules,+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome,+and+appears+identical+to+granulophysin.">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li><li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes.">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li><li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control:+Alternatives+for+ADAMTS13.">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li><li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy.">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li><li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact.">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

世界中で、血栓症は死亡および罹患率の主要な原因であり、血小板はその発症の中心的役割を果たす。この研究は、血小板脱顆粒の生細胞イメージングのための方法を記載している。一般に、血小板が活性化されると、全ての顆粒状の内容物が直接溶液中に放出されると想定される。付随する結果は、これが必ずしも当てはまらないことを示唆している。接着および脱顆粒の間、血小板はか?...

血小板は、血流中を循環する無核細胞である。彼らの主な機能は、損傷の部位での血管侵害を封鎖し、失血を防ぐことである。損傷のこれらの部位では、内皮下コラーゲン繊維が露出され、続いて多量体タンパク質、フォンビルブラント因子（VWF）によって覆われる。 VWFは、細胞表面1上の糖タンパク質Ibα-IX-V複合体に依存し、血小板の速度を減速させる機構において血小板と循環して相互作用する。これは、高剪断速度において特に重要である。その後、血小板は、コラーゲンから活性化インパルスを受けながら形態学的変化を受ける。これは不可逆的な広がりをもたらし、最終的には血小板の凝集をもたらす。両方のプロセスは、血小板 - 血小板のクロストークを促進するために顆粒内容物の分泌に依存する。とりわけ、血小板α顆粒は、血小板接着を助け、橋渡しするためにフィブリノゲンおよびVWFを含むインテグリン依存的に血小板を結合する。血小板高密度顆粒は、カルシウムおよびアデノシン二リン酸（ADP）を含む無機化合物2を含み、血小板活性化を強化するのに役立つ。さらに、血小板は、（アレルギー性）炎症3 、補体制御タンパク質4および血管新生因子5,6のメディエーターを含有し、これらの内容物が様々な条件下でどのように差異的に放出されるかおよびどのように放出されるかについての疑問を生じさせる。 1980年代以来、血流モデルにおける血小板機能の研究は、血栓性メカニズムの研究にとって重要である7 。それ以来、多くの技術的進歩がなされており、フィブリン形成を含むフローモデルは、現在、治療用血小板濃縮物の生体外での潜在能力をアッセイするために開発されている血栓形態に及ぼす剪断速度の乱れの影響を調べる9 。安定した接着および生理学的血栓形成（止血）対病理学的な血栓形成（血栓症）を促進する分子および細胞 - 生物学的機構の相違は非常に微妙であり、これらの亜細胞のリアルタイム視覚化を可能にする流れモデルの開発を促すプロセス。 そのような設定が価値があるプロセスの例は、細胞内ポリリン酸の（再）分布と、これがフィブリン超微細構造10に与える時間依存性の影響を明らかにするための凝固因子の動員である。研究はしばしばエンドポイント分析に限定されます。記載された方法の主な目的は、血小板活性化の間に起こる動的細胞内プロセスのリアルタイムの視覚的調査を可能にすることである。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1340">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid (HEPES)&#160;</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">441476L</td>
			<td style="width:372px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Na2HPO4</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">S-0876</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31434</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">KCl</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td style="width:227px;">31248</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;">MgSO4</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.05886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-glucose</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.04074</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Prostacyclin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Cayman Chemical</td>
			<td style="width:227px;">18220</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tri-sodium citrate</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.06448</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Citric acid&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Merck KGaA</td>
			<td style="width:227px;">1.00244</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover glasses</td>
			<td style="width:295px;">Menzel-Gl&#228;ser</td>
			<td style="width:227px;">BBAD02400500#A</td>
			<td>24x50mm, No. 1 = 0.13-0.16 mm thickness.</td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:447px;">Chromosulfuric acid (2% CrO3)</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td>07404</td>
			<td>CAS [65272-70-0].</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Von Willebrand factor (VWF)</td>
			<td style="width:295px;">in-house purified</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Fibrinogen</td>
			<td style="width:295px;">Enzyme Research Laboratories</td>
			<td style="width:227px;">FIB3L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4 well dish, non-treated</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">267061</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Human Serum Albumin Fraction V</td>
			<td style="width:295px;">Haem Technologies Inc.</td>
			<td style="width:227px;">823022</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Blood collection tubes, 9 ml, 9NC Coagulation Sodium Citrate 3.2%</td>
			<td style="width:295px;">Greiner Bio-One</td>
			<td style="width:227px;">455322</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Cell analyser&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abbott Diagnostics</td>
			<td style="width:227px;">CELL-DYN hematology analyzer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>30525-89-4&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;">Syringe pump</td>
			<td style="width:295px;">Harvard Apparatus, Holliston, MA</td>
			<td style="width:227px;">Harvard apparatus 22</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">10 mL syringe with 14.5 mm diameter</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td style="width:227px;">305959</td>
			<td>Luer-Lok syringe</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD63-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB134331</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Anti-CD62P-biotin&#160;</td>
			<td style="width:295px;">R&#38;D Systems</td>
			<td style="width:227px;">Dy137</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4&#8217;,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI)</td>
			<td style="width:295px;">Polysciences Inc.&#160;</td>
			<td style="width:227px;">9224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Streptavidin, Alexa Fluor 488 conjugate</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>S11223&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td>444963-0000-000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Detergent solution</td>
			<td>Unilever, Biotex</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>56-40-6&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Polyvinyl alcohol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>9002-89-5</td>
			<td>Mowiol 40-88.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tris hydrochloride</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>1185-53-1&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1,4-Diazabicyclo[2.2.2]octane (DABCO)</td>
			<td style="width:295px;">Sigma</td>
			<td>280-57-9</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sheep Anti-hVWF pAb</td>
			<td>Abcam&#160;</td>
			<td style="width:227px;">AB9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Alexa fluor 488-NHS</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">A20000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol</td>
			<td style="width:295px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:227px;">15523-1L-R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Parafinn film</td>
			<td style="width:295px;">Bemis</td>
			<td style="width:227px;">PM-996</td>
			<td>4 in. x 125 ft. Roll.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone sheet non-reinforced</td>
			<td style="width:295px;">Nagor</td>
			<td style="width:227px;">NA 500-1</td>
			<td>200mmx150mmx0.125mm.</td>
		</tr>
		<tr height="19">
			<td height="19" style="height:19px;width:447px;">Customized cut silicone sheet with perfusion and vacuum channels</td>
			<td style="width:295px;">in-house made</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Made of Silicone sheet non-reinforced (Nagor, NA 500-1)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">1.5 mL tubes</td>
			<td style="width:295px;">Eppendorf AG</td>
			<td style="width:227px;">T9661-1000AE</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Fluorescent microscope</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss Observer Z1&#160;</td>
			<td style="width:227px;"></td>
			<td>Equiped with LED excitation lights.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope software</td>
			<td style="width:295px;">Zeiss ZEN 2</td>
			<td style="width:227px;">blue edition</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">18 G needle (18 G x 1 1/2&#34;)</td>
			<td style="width:295px;">BD biosciences</td>
			<td>305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">NaCl</td>
			<td style="width:295px;">Riedel de Haen</td>
			<td style="width:227px;">31248375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Tris</td>
			<td style="width:295px;">Roche</td>
			<td style="width:227px;">10708976</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Plastic pasteur pipet</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">612-1681</td>
			<td>&#160;7 ml non sterile, graduated up to 3ml.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Silicone tubing</td>
			<td style="width:295px;">VWR</td>
			<td style="width:227px;">228-0656</td>
			<td>Inner diamete. x Outer diameter x Wall thickness = 1.02 x 2.16 x 0.57 mm.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:447px;">Microscope slides</td>
			<td style="width:295px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:227px;">ABAA000001##12E</td>
			<td>76 x 26 x 1 mm, ground edges 45&#176;, frosted end.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of platelet degranulation and secretion under flow

血小板は、止血における重要な役割を果たし、血管侵害を封鎖するための血栓の形成である。それらは血栓症、脈管構造を閉塞させ、器官を傷つける血栓の形成にも関わり、生命を脅かす結果となる。これは、血小板機能に関する科学的研究と、フロー条件下で起こる細胞生物学的プロセスを追跡する方法の開発を促す。 血小板の生物学における2つの重要な現象である血小板の接着と凝集の研究には、さまざまなフローモデルが利用できます。この研究は、活性化の間の流れの下でのリアルタイム血小板脱顆粒を研究する方法を記載している。この方法は、広視野の逆LEDベースの蛍光顕微鏡の下に置かれたシリンジポンプ装置に連結されたフローチャンバを利用する。ここで説明する設定は、蛍光標識された抗体またはフルオレセインによって送達される複数のフルオロフォアの同時励起を可能にする染料。生細胞イメージング実験後、カバーガラスは、静的顕微鏡法（ すなわち、共焦点顕微鏡法または走査型電子顕微鏡法）を用いて、さらに処理および分析することができる。

図1は、フローチャンバおよび実験装置の画像を示す。シリコンシートの位置および寸法;チュービング接続。 図2は、フローチャンバーの寸法の詳細を示しています。 図3およびムービー1は、固定化されたVWF上の血小板接着および広がりの画像の時系列を示す。 CD63は、休止血小板<sup class...

Watch this Scientific Journal Video about Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow at JoVE.com

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biology

11.5K ビュー.  University Medical Center Utrecht. この研究では、血小板の接着、広がり、および分泌の流れを調べるための蛍光顕微鏡検査に基づく方法を説明しています。この多目的プラットフォームは、血栓症および止血に関する機械的研究のための血小板機能の調査を可能にする。 

ビデオ: Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy (FSM)

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique advantage of FSM is its ability to capture the movement and turnover kinetics (assembly/disassembly) of the F-actin network within living cells. This technique is particularly useful in deriving quantitative measurements of F-actin dynamics when paired with computer vision software (qFSM).  We describe  the selection, microinjection and visualization of fluorescent actin probes in living cells. Importantly, similar procedures are applicable to visualizing other macomolecular assemblies. FSM has been demonstrated for microtubules, intermediate filaments, and adhesion complexes.  

Live Cell Imaging of F-actin Dynamics via Fluorescent Speckle Microscopy FSM

Selection, microinjection, and imaging of fluorescently-labeled F-actin via fluorescent speckle microscopy (FSM).

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

In this protocol we describe the use of Fluorescent Speckle Microscopy (FSM) to capture high-resolution images of actin dynamics in PtK1 cells. A unique ...

生物学

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

Fluorescent Labeling of COS-7 Expressing SNAP-tag Fusion Proteins for Live Cell Imaging

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. These systems offer a broad selection of fluorescent substrates optimized for a range of imaging instrumentation. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again. There are two steps to using this system: cloning and expression of the protein of interest as a SNAP-tag fusion, and labeling of the fusion with the SNAP-tag substrate of choice. The SNAP-tag is a small protein based on human O6-alkylguanine-DNA-alkyltransferase (hAGT), a DNA repair protein. SNAP-tag labels are dyes conjugated to guanine or chloropyrimidine leaving groups via a benzyl linker. In the labeling reaction, the substituted benzyl group of the substrate is covalently attached to the SNAP-tag. CLIP-tag is a modified version of SNAP-tag, engineered to react with benzylcytosine rather than benzylguanine derivatives. When used in conjunction with SNAP-tag, CLIP-tag enables the orthogonal and complementary labeling of two proteins simultaneously in the same cells.

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest in live cells. Once cloned and expressed, the tagged protein can be used with a variety of substrates for numerous downstream applications without having to clone again.

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

SNAP-tag and CLIP-tag protein labeling systems enable the specific, covalent attachment of molecules, including fluorescent dyes, to a protein of interest ...

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we showed that D. discoideum is remarkably resilient to protein aggregation and can be used to gain insights into the cellular protein quality control system. However, the use of D. discoideum as a model system poses several challenges to microscopy-based experimental approaches, such as the high motility of the cells and their susceptibility to photo-toxicity. The latter proves to be especially challenging when studying protein homeostasis, as the phototoxic effects can induce a cellular stress response and thus alter to behavior of the protein quality control system. 
Temperature increase is a commonly used way to induce cellular stress. Here, we describe a temperature-controllable imaging protocol, which allows observing temperature-induced perturbations in D. discoideum. Moreover, when applied at normal growth temperature, this imaging protocol can also noticeably reduce photo-toxicity, thus allowing imaging with higher intensities. This can be particularly useful when imaging proteins with very low expression levels. Moreover, the high mobility of the cells often requires the acquisition of multiple fields of view to follow individual cells, and the number of fields needs to be balanced against the desired time interval and exposure time.

Studying the Protein Quality Control System of D. discoideum Using Temperature-controlled Live Cell Imaging

The social amoebae Dictyostelium discoideum has recently been established as a system to study protein misfolding and proteostasis. Here, we describe a new imaging-based methodology to study temperature-induced protein aggregation and the cellular stress response in D. discoideum.

タンパク質の品質管理システムを学びます<em&gt; D。 discoideumの</em&gt;温度制御された生細胞イメージングを用い

The complex lifestyle of the social amoebae Dictyostelium discoideum makes it a valuable model for the study of various biological processes. Recently, we ...

Mixed Primary Cultures of Murine Small Intestine Intended for the Study of Gut Hormone Secretion and Live Cell Imaging of Enteroendocrine Cells

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal epithelium. Despite their physiological importance, enteroendocrine cells represent only a small fraction of the epithelial cell population and in the past, their characterization has presented a considerable challenge resulting in a reliance on cell line models. Here, we provide a detailed protocol for the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary cultures have been used to identify the signaling pathways underlying the stimulation and inhibition of gut peptide secretion in response to a number of nutrients and neuropeptides as well as pharmacological agents. Furthermore, in combination with the use of transgenic fluorescent reporter mice, we have demonstrated that these primary cultures become a powerful tool for the examination of fluorescently-tagged enteroendocrine cells at the intracellular level, using methods such as patch clamping and single-cell calcium and cAMP-FRET imaging.

This protocol describes the isolation and culture of mixed murine small intestinal cells. These primary intestinal cultures enable the investigation of signaling pathways underlying gut peptide secretion using a number of techniques.

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

The gut is the largest endocrine organ of the body, with hormone-secreting enteroendocrine cells located along the length of the gastrointestinal ...

LDL Cholesterol Uptake Assay Using Live Cell Imaging Analysis with Cell Health Monitoring

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic disorder, cardiovascular disease, and kidney disease. Currently, there is no available method to assess LDL uptake while simultaneously monitoring for health of the cells. The current study presents a protocol, using a live cell imaging analysis system, to acquire serial measurements of LDL influx with concurrent monitoring for cell health. This novel technique is tested in three human cell lines (hepatic, renal tubular epithelial, and coronary artery endothelial cells) over a four-hour time course. Moreover, the sensitivity of this technique is validated with well-known LDL uptake inhibitors, Dynasore and recombinant PCSK9 protein, as well as by an LDL uptake promoter, Simvastatin. Taken together, this method provides a medium-to-high throughput platform for simultaneously screening pharmacological activity as well as monitoring of cell morphology, hence cytotoxicity of compounds regulating LDL influx. The analysis can be used with different imaging systems and analytical software.

This protocol provides an efficient approach to measuring LDL cholesterol uptake with real time influx rates using a live cell imaging system in various cell types. This technique provides a platform to screen the pharmacological activity of compounds affecting LDL influx while monitoring for cell morphology and hence potential cytotoxicity.

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

The regulation of LDL cholesterol uptake through LDLR-mediated endocytosis is an important area of study in various major pathologies including metabolic ...

Application of Membrane and Cell Wall Selective Fluorescent Dyes for Live-Cell Imaging of Filamentous Fungi

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two decades ago and since then continues to contribute greatly to our understanding of the filamentous fungal lifestyle. This paper provides a practical guide for the utilization of the two membrane dyes FM 1-43 and FM 4-64 and the four cell wall stains Calcofluor White M2R, Solophenyl Flavine 7GFE 500, Pontamine Fast Scarlet 48 and Congo Red. The focus is on their low-dose application to ascertain artefact-free staining, their co-imaging properties, and their quantitative evaluation. The presented methods are applicable to all filamentous fungal samples that can be prepared in the described ways. The fundamental staining approaches can serve as starting points for adaptations to species that might require different cultivation conditions. First, biophysical and biochemical properties are reviewed as their understanding is essential for using these dyes as truly vital fluorescent stains. Secondly, step-by-step protocols are presented that detail the preparation of various fungal sample types for fluorescent live-cell imaging. Finally, example experiments illustrate different approaches to: (1) identify defects in the spatio-temporal organization of endocytosis in genetic mutants, (2) comparatively characterize shared and distinct co-localization of GFP-labeled target proteins in the endocytic pathway, (3) identify morphogenetic cell wall defects in a genetic mutant, and (4) monitor cell wall biogenesis in real time.

Vital fluorescent dyes are essential tools for live-cell imaging analyses in modern fungal cell biology. This paper details the application of established and lesser-known fluorescent dyes for tracking plasma membrane dynamics, endo-/exocytosis and cell wall morphogenesis in filamentous fungi.

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

The application of membrane and cell wall selective fluorescent dyes for live-cell imaging analyses of organelle dynamics in fungal cells started two ...

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

タンパク質の品質管理システムを学びます

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

LDL コレステロールの取り込みアッセイセルにライブセルイメージングを使用して正常性の監視

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

要約

さらに動画を探す

この動画の章

蛍光を経由してF -アクチンダイナミクスの生細胞イメージングでは、顕微鏡のスペックル（FSM）

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

COS - 7の蛍光標識は、生細胞イメージングのためにSNAP - Tag融合タンパク質を発現する

生細胞イメージングとの胚上皮細胞の定量分析アフリカツメガエル

DNA損傷応答タンパク質の2次元および3次元生細胞イメージング

初期のオートファジーイベントの細胞イメージングライブOmegasomesを以降

タンパク質の品質管理システムを学びます

腸ホルモン分泌の研究と腸内分泌細胞の生細胞イメージングを対象ネズミ小腸の混合初代培養

LDL コレステロールの取り込みアッセイ セルにライブセル イメージングを使用して正常性の監視

糸状菌の生細胞イメージングのための膜および細胞壁選択的蛍光色素の応用

LDL コレステロールの取り込みアッセイセルにライブセルイメージングを使用して正常性の監視