この作業は、教育および研究 (BMBF 01EO1003 および BMBF 01EO1503) ドイツの大臣によって支えられました。

雄マウスの年齢 8 ~ 12 週間ラインラント = プファルツ州 (承認番号 23 177-07/G12-1-002 と 23 177-07/G15-1-051) から動物実験に倫理委員会の承認の下で古い実験を行った。
1. マウスの麻酔や手術の準備
<ol>
	<li>手術前に良好な健康状態と動物の状態を確認します。術前に体重、食糧や水の消費量だけでなく、全身状態 (外観、姿勢、自発的行動) の 2-3 日に一度動物を監視します。</li>
	<li>腹腔内にミダゾラム (5 mg/kg 体重)、メデトミジン (0.5 mg/kg 体重)、フェンタニル (0.05 mg/kg 体重) と麻酔のマスターの組合せを準備 (i. p.) 26 G 針で 1 mL 注射器で 200 μ L/30 g マウスを注入します。</li>
	<li>浸透圧ポンプ注入と IVM の実験のための動物の準備は、プラットフォームを温暖化 39 ° C と操作フィールドで実行されます。滅菌消毒風呂のすべてのツール、地球温暖化のプラットフォームを消毒してください。</li>
	<li>手続き中に眼軟膏を動物の目を保護します。浸透圧ポンプ注入前にカミソリで毛を削除します。頸動脈と頸静脈カテーテルの注入を IVM 実験の隔離のための脱毛クリームと綿棒を使用します。2 つの皮膚の消毒剤を使用して動物の皮を消毒: 1 つの防腐剤と消毒剤のポビドン ヨードとの 1 つを含む皮膚アルコール ・ ベースのソリューションで防腐剤の含まれている octenidine。</li>
	<li>麻酔 (「antisedan ミックス」) atipamezol (0.05 mg/kg 体重) とフルマゼニル (0.01 mg/kgbody 重量) を敵に回したマスター ミックスを調製し皮下に 26 G 針で 1 mL 注射器で 200 μ L/マウスを準備 (サウスカロライナ) 注入。</li>
</ol>
2. 浸透圧ポンプの準備と移植
注: 浸透圧のポンプを使用して皮下 AngII 注入によって記述されていた詳細に Luら17
<ol>
	<li>滅菌生理食塩水の凍結乾燥粉末を再構成することによって、AngII を準備し、動物の重量とポンプの配信レートで濃度を調整します。プラスチック チューブ (ガラス管を使用していない) に再構成された AngII をしてください。</li>
	<li>7 日間の 1 mg/(kg·d) を提供する AngII ソリューションでポンプを入力します。調製後ポンプを維持、4-6 時間滅菌生理食塩水で最低 37 ° C で</li>
	<li>リア混ぜ麻酔の注射は足の反射と温かみのある操作フィールド上に配置後は、マウスの完全な麻酔をテストします。麻酔導入は 10-15 分かかります、暗い環境で動物を配置している場合、良い作品します。</li>
	<li>マウスの腰をそるし、アルコールの皮膚消毒と消毒します。</li>
	<li>はさみを使って背骨に垂直な 1 cm の切開を行います。海峡の止血を使用してポンプのためのポケットを作成し、ポンプを挿入 (まず司会の流れ)。ポケット傷口に圧力がないとポンプの自由な移動を許可する必要があります。</li>
	<li>炎症; を制限するために縫合糸、およびないクリップで傷を閉じる皮膚消毒剤で消毒します。</li>
	<li>Antisedan ミックスを 200 μ l 添加の皮下注射による麻酔の反感を買う、そのケージにマウスを戻ります。</li>
	<li>ブプレノルフィンによる術後鎮痛を行う (0.075 mg/kg 皮下) 動物の行動に応じてオンデマンド手術後 1 時間。</li>
</ol>
3. 頸静脈カテーテル注入と頸動脈の準備
<ol>
	<li>麻酔の注射と後部食品反射を混ぜて位麻酔動物背 recumbence 39 ° C 手術板上軟膏をつけ、温度を維持するために直腸プローブを持つ後マウスの完全な麻酔をテストします。プロシージャの間にそれらを保護するために目。</li>
	<li>首毛、脱毛クリームを使用してを削除します。普及し、毛が脱落する開始まで 2 分間クリームをこする綿棒を使用します。さらに 2 分後ヘラでクリームと毛を削除し、アルコールの皮膚消毒で皮膚を消毒します。</li>
	<li>顕微鏡下で手術を行います。頸部、気管の横に 1 cm の縦皮膚で 1 〜 1.5 cm の切開を行います。最初の切開の両方の下肢を垂直に他の 2 つの切開を行います。</li>
	<li>慎重に皮膚の横にある組織、左内頚静脈と気管を覆っている皮膚の部分を取り外します。</li>
	<li>慎重に分離; 耳下腺2 カーブタイプ鉗子と利子のゾーンから舌下腺と顎下腺。カットにまたは損傷腺、頸静脈、頸動脈の最高アクセスを許可するようにそれらを配置しないでください。</li>
	<li>頸静脈を分離するには、細い鉗子を使用して、ゆっくりと開き、クローズして周囲の組織から血管を優しく解放します。静脈が完全にきれいになったら容器の下に鉗子を配置し、それの下で 10 cm の 2 つの 7-0 縫合糸を配置します。</li>
	<li>2 つの結び目の頭部に近位の縫合を閉じます。その他の縫合の 1 つの結び目を準備が終了しません。</li>
	<li>37 ° C; 片手で鉗子を滅菌生理食塩水で満たされたカテーテル (0.61 mm 外径、内径 0.28 mm) を保持します。他の手で、薄いはさみや湾曲した 26 G 針で容器に小切開を確認します。その後、頚静脈にカテーテルを挿入し、2 回結び目を閉じます。完全な固定を確保するために、カテーテルの上頭の近位の縫合を閉じます。</li>
	<li>特定し頚動脈を準備するには、区域を薄いカーブタイプ鉗子を使用して気管を解剖します。</li>
	<li>頸動脈が周囲の組織から解放されたら、船から (それは頸動脈に隣接する白い線のように見える) 迷走神経を削除 (しかしそれをカットされません)。細い鉗子をクローズし、ゆっくりと優しく神経を動員して開くことができます。</li>
	<li>両方の動脈が完全にクリーンな最初の頚動脈下鉗子を置き、船下小黒 3 mm 幅 x 2.5 cm の長さのプラスチック片を配置します。伸び過ぎて血管が血流が容器ホルダーが配置される存在であることを確認する非常に重要です。容器ホルダーに 2 つ目の動脈を置きます。顕微鏡下で直接マウスを挿入しない場合は気管上腺を戻すし、37 ° C ゾーンの乾燥を避けるために滅菌生理食塩水を適用します。</li>
</ol>
4. ローリングと白血球の付着の評価する LysM + セル IVM の/
<ol>
	<li>アクリジン オレンジ 2 mg/mL 原液-20 ° C で保存からを準備し、それを 1 mL の注射器の滅菌生理食塩水 (最終濃度が 0.5 mg/mL) で 1:4 希釈します。</li></ol>注射器を光から保護し、マウスを一回あたり 200 μ L を使用します。<ol>
		<li>さまざまな条件をテスト: アクリジン オレンジ頸静脈カテーテル; (1) 注射((この状態で内頸静脈カテーテルが注入なし); 尾外側静脈に直接アクリジン オレンジの注入 2)(3) アクリジン オレンジ蛍光 LysMCre+IRG+を用いたマウス (ここは再び頸静脈カテーテルが注入なし) することがなく測定。</li>
	</ol>
	
	<li>カテーテルは、場所と 2 つの頸動脈が分離、顕微鏡下でマウスを置きます。長距離コンデンサーと 10 X を使用して高速ワイド フィールド蛍光顕微鏡を用いた測定を行う (NA 0.3) 分光器、ビームスプリッター、電荷結合素子カメラと水浸対物レンズです。画像の獲得およびリアルタイム イメージング システムの分析を実行します。</li>
	<li>血管内皮細胞表面で頸動脈の真ん中に対物レンズの焦点を合わせます。アクリジン オレンジの 50 μ L (0.5 mg/mL) (最初の注入用カテーテルのデッド ボリュームを考慮に入れなさい) をゆっくりと注入します。画像ごとに 120 ミリ秒の露光時間で 100 の画像を記録するソフトウェアを設定します。</li>
	<li>各ビデオの動脈上の異なる場所で内頚動脈 (左と右) あたりの 4 つのビデオを作る。蛍光信号が小さくなる場合は、アクリジン オレンジの別の 50 μ L を挿入します。</li>
	<li>すべてのビデオを記録した後頚部転位によって、動物を安楽死させます。</li>
	<li>毎秒 10 枚で動画の速度を設定して各ビデオの容器の中央に置かれた 200 μ x 250 μ m 四角形ビューでローリングと付着性細胞を定量化します。ローリングと付着性のセルを数える;付着性のセルは、セルを移動しない、または 10 の s ビデオ内血管内皮細胞からデタッチとして定義されます。定量化を簡素化し、赤い蛍光を用いたチャネルを削除し、ローリングと付着細胞をカウントする緑の蛍光性を使用します。</li>
	<li>アクリジン オレンジを用いた実験では、血管内皮細胞によって作られたバック グラウンドを除去するために蛍光性の手動によるしきい値を確認します。</li>

<ol>
	<li>Lewington, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-specific+relevance+of+usual+blood+pressure+to+vascular+mortality:+a+meta-analysis+of+individual+data+for+one+million+adults+in+61+prospective+studies.">Age-specific relevance of usual blood pressure to vascular mortality: a meta-analysis of individual data for one million adults in 61 prospective studies.</a> Lancet. 360, 1903-1913 (2002).</li><li>Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mosaic+theory+revisited:+common+molecular+mechanisms+coordinating+diverse+organ+and+cellular+events+in+hypertension.">The mosaic theory revisited: common molecular mechanisms coordinating diverse organ and cellular events in hypertension.</a> J Am Soc Hypertens. 7, 68-74 (2013).</li><li>Guzik, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+the+T+cell+in+the+genesis+of+angiotensin+II+induced+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Role of the T cell in the genesis of angiotensin II induced hypertension and vascular dysfunction.</a> J Exp Med. 204, 2449-2460 (2007).</li><li>De Ciuceis, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+vascular+remodeling,+endothelial+dysfunction,+and+oxidative+stress+in+resistance+arteries+of+angiotensin+II-infused+macrophage+colony-stimulating+factor-deficient+mice:+evidence+for+a+role+in+inflammation+in+angiotensin-induced+vascular+injury.">Reduced vascular remodeling, endothelial dysfunction, and oxidative stress in resistance arteries of angiotensin II-infused macrophage colony-stimulating factor-deficient mice: evidence for a role in inflammation in angiotensin-induced vascular injury.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25, 2106-2113 (2005).</li><li>Wenzel, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysozyme+M-positive+monocytes+mediate+angiotensin+II-induced+arterial+hypertension+and+vascular+dysfunction.">Lysozyme M-positive monocytes mediate angiotensin II-induced arterial hypertension and vascular dysfunction.</a> Circulation. 124, 1370-1381 (2011).</li><li>Kossmann, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Platelet-localized+FXI+promotes+a+vascular+coagulation-inflammatory+circuit+in+arterial+hypertension.">Platelet-localized FXI promotes a vascular coagulation-inflammatory circuit in arterial hypertension.</a> Sci Transl Med. 9, (2017).</li><li>Rodriguez-Iturbe, B., Pons, H., Johnson, R. 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S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endothelial+cells+suppress+monocyte+activation+through+secretion+of+extracellular+vesicles+containing+antiinflammatory+microRNAs.">Endothelial cells suppress monocyte activation through secretion of extracellular vesicles containing antiinflammatory microRNAs.</a> Blood. 125, 3202-3212 (2015).</li><li>Colognato, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+expression+and+regulation+of+protease-activated+receptors+in+human+peripheral+monocytes+and+monocyte-derived+antigen-presenting+cells.">Differential expression and regulation of protease-activated receptors in human peripheral monocytes and monocyte-derived antigen-presenting cells.</a> Blood. 102, 2645-2652 (2003).</li><li>Schaffner, A., Rhyn, P., Schoedon, G., Schaer, D. 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著者がある何も開示するには

高血圧5の開発に関与する LysM+単球は以前示した。LysM+の免疫細胞がロールし、AngII 注入に応えて内皮層に準拠を示します。この発見は、LysMCre+IRG+を使用して得られたアクリジン オレンジ6,10の注入と白血球の可視化による生体内で高血圧症における免疫細胞の役割を探る私たちの以前の研究からマウス。したがって、内皮に付着した細胞の種類の識別は不可能だった。
IVM は血管の検査や、血管に直接細胞の生体内観察の非常に便利なツールが、高血圧症の炎症性のコンテキストで外科的に挿入されたカテーテルの助けを借りて、染料を注入することの影響は不明のまま。カテーテルとアクリジン オレンジの潜在的な効果を評価する射出我々 は IRG+マウス LysMCre+の利点を取った。AngII 注入増加 LysM+細胞を血管内皮細胞に圧延の。頸静脈へのカテーテルの挿入増幅効果とカテーテル インプラントなしでマウスと比較されたカテーテルと計測 AngII 注入マウスよりローリングと付着した白血球が検出されました。これはその注入のコンテキストにおける全身性炎症反応は創傷治癒のオーバーレイされる高血圧18に見られる免疫反応を頸動脈カテーテル原因のことを示します。また、頸動脈、頸静脈の近接のため頚静脈に影響を与える追加免疫活性化を発生している可能性があります。この効果が直接に尾静脈注射が行われたとき存在していないので効果が期限であると仮定ことができます染料ではなく、カテーテルの挿入のプロシージャに。我々 は実験中に生体内のプロセスに干渉されていない蛍光蛋白質を表現する遺伝子改変レポーター マウスの重要性を示します。さらに、蛍光トレーサーの尾静脈注射頸静脈カテーテル注射に可能な選択肢があります。
プロシージャの 1 つの重要なステップは、AngII 注入です。ポンプによって血圧の尾カフ評価 AngII 配信の有効性を制御するために可能です。血圧は、注入の 2−3 日後増やす必要があります。炎症 LysM+細胞活性化に影響を及ぼす可能性を制限するには、ポンプが注入されて切開の閉鎖は、クリップではなく縫合すべきであります。1 つの制限は、尾静脈注射に関する注意されなければならない: 最高の可能なデータ収集をするためには、4 つのビデオ、通常各頸動脈の撮影します。蛍光信号が小さくなる、アクリジン オレンジの 50 μ L を注入が、尾の注入といくつかの注射をして、頸動脈を対物レンズの下で安定させるためにより困難です。頸静脈カテーテルの存在の期間かもしれない免疫細胞活性化を調節するもそれがカテーテル注入19後 4 h を作製した多血小板血漿の凝固活性化に影響を与えるので。カテーテル注入のこの側面はさらに調べる必要があります。
最後に、頸静脈カテーテル注入 AngII 注入後 LysM+細胞の活性化の影響を感謝して、たとえ完全には推定不可能で準備、皮膚の除去、および潜在的な LysM+セルに頸動脈の分離の役割活性化。ような蛍光レポーター マウスの使用を終えて LysMCre+IRG+マウス生体内イメージングのため動物の準備時に容器の完全性の混乱を避けるためにお勧めします。

動脈高血圧症は、心血管疾患と死亡のリスクを増加させるし、アテローム性動脈硬化、冠動脈疾患、動脈または静脈の最も1の開発を促進します。高血圧の開発は、環境、遺伝、内分泌、および血行力学的要因の相互作用に依存します。現在、高血圧2の病因に重要な役割を果たすには免疫と関連炎症も歓迎です。
T リンパ球、単球、マクロファージは免疫細胞の中で AngII 誘発血管炎症と高血圧、活性酸素種3をトリガーする能力に関連する部分で作因的に関与する見つかりました。大食細胞のコロニー刺激因子欠損のマウスは、血圧上昇や血管炎症4に関する AngII に還元反応を示した。前作、AngII 血圧5LysM + 単球の血管機能不全や炎症ドライブを見せてください。最近では、血小板とトロンビン依存性血管炎症6を誘発する血管壁が凝固第 XI 因子が協力して経路について述べる。高血圧症における免疫系の役割について現在のナレッジ最近要約されロドリゲス Iturbeらによって審査します。7
高血圧の開発に免疫細胞の関与が明らかになったのでモデルと容器と免疫細胞の相互作用を研究する手法が必要となった。血管の落射蛍光 IVM は循環血液細胞と内皮細胞8,9,10の生体内での相互作用を観察する役に立つツールです。この手法により、dna (などアクリジン オレンジ) 間をインターカ レート染料の注入は、有核細胞 (循環と同様、内皮から) を視覚化できます。分離された血小板が前のヴィヴォローダミン 6 G のステンド グラスやジクロルフルオレッセン (DCF) を注入して、動脈または静脈の損傷モデルにおける血小板血栓を視覚化することができます。
頸静脈カテーテルのトレーサーを注入するために使用またはマークの通常、血小板。単球の活性化に効果があると、内皮の変化と凝固カスケードの後続活性化両方知られています。血管内皮細胞障害はすぐにその後単球の魅力と活性化11組織をシールする内皮下マトリックス分子を介して血小板の活性化に します。それどころか、そのまま血管内皮細胞が抗凝固特性 (例えば、組織因子経路阻害剤またはトロンボモジュリン経由)12と単球などの分泌を直接抑制効果を持っている知られています。マイクロ Rna の13を含む細胞小胞。単球は組織因子、凝固カスケードのエクスプレス プロテアーゼ活性化受容体 (PARs) トロンビンによってアクティブにすることができ、単球活性化14,15 に参加する外因性活性剤を生成する知られています。.したがって、任意の活性化血小板または血管損傷による血液凝固カスケードの可能性があります予期しない単球活性化に対する影響とみられる現象を妨げる。IRG トランスジェニック LysM Cre トランスジェニック マウス、二重蛍光 Cre レポーター マウス (LysMCre+IRG+) の助けを借りて、提案する LysM+のカテーテルでの代替方法で注射の効果の詳細に検討するには動脈高血圧症16マウス モデルにおける骨髄単球性細胞。

<table><tbody><tr><td>Midazolam</td><td>Ratiopharm GmbH</td><td></td><td>Anesthesia mix</td></tr><tr><td>Medetomidine</td><td>Pfizer Deutschland GmbH</td><td></td><td>Anesthesia mix</td></tr><tr><td>Fentanyl</td><td>Janssen-Cilag GmbH</td><td></td><td>Anesthesia mix</td></tr><tr><td>Alzane</td><td>Zoetis</td><td></td><td>Antisedan mix</td></tr><tr><td>Flumazenil</td><td>Hikma pharma</td><td></td><td>Antisedan mix</td></tr><tr><td>Braunol</td><td>B Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Octeniderm</td><td>Sch&amp;uuml;lke</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Osmotic pumps</td><td>Alzet</td><td>1007D</td><td>Osmotic pump implantation</td></tr><tr><td>Angiotensin II</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Osmotic pump implantation</td></tr><tr><td>7-0 prolene suture</td><td>Ethicon</td><td></td><td>Osmotic pump implantation</td></tr><tr><td>Acridine orange</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Catheter</td><td>Smiths Medical Deutschland GmbH</td><td></td><td>Inside diameter, 0.28 mm; outer diameter, 0.61 mm</td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX51WI fluorescence microscope</td><td></td></tr><tr><td>Beam Splitter</td><td>Photometrics</td><td>CMR-DV2-SYS - DualView2 MicroImager</td><td></td></tr><tr><td>Objective</td><td>Olympus</td><td>UMPLFLN10X</td><td>Water immersion objective with a monochromator</td></tr><tr><td>Camera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>ORCA-R2</td><td></td></tr><tr><td>Image acquisition and analysis software</td><td>Olympus</td><td>Realtime Imaging System eXcellence RT</td><td></td></tr><tr><td>Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Jax 008705</td><td>B6.Cg-Tg(CAG-DsRed,-EGFP)5Gae/J</td></tr><tr><td>Mice</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>Jax 004781</td><td>LysM Cre (B6.129P2-&lt;em&gt;Lyz2&lt;sup&gt;tm1(cre)Ifo&lt;/sup&gt;&lt;/em&gt;/J )</td></tr></tbody></table>

visualizing leukocyte rolling and adhesion in angiotensin ii-infused mice: techniques and pitfalls

落射蛍光生体ビデオ顕微鏡 (IVM) 血管は、免疫細胞の活性化と役割する能力を評価し、内皮層に付着する確立された方法です。循環し、蛍光色素や蛍光体結合抗体の注射によって細胞の可視化、使用されます。また、蛍光レポーター マウスを使用できます。特定リゾチーム M における白血球の相互作用+ (LysM+) 単球は、血管壁に血管機能不全や動脈高血圧を促進する上で極めて重要な役割を再生します。ここで視覚化し、白血球ローリングとアンジオテンシン II (AngII) 頚動脈で密着性を定量化する手法を提案する-マウス IVM の血圧。
カテーテルの注入は、血管壁を損傷、変更された血液細胞の反応に 。別の射出成形技術と LysMCre+IRG+で白血球を視覚化する投与経路を比較したマウスの赤色けい光たんぱく質の広範な表現とする LysM で緑の蛍光蛋白質の条件式+細胞。AngII 注入マウスを用いて LysM+細胞の活性化を研究、圧延および内皮に白血球の付着が増加します。我々 はどちらかアクリジン オレンジ、頚を使用してカテーテルを注入または直接尾静脈し、の量を比較しても圧延付着細胞と。わかった頸静脈カテーテル注入自体圧延の数が増加に付着する LysM+細胞偽注入 LysMCre+IRG+マウス コントロールと比較して.この活性化は、AngII 注入マウスの拡張だった。興味深いことに、アクリジン オレンジ直接尾静脈増加しなかった LysM+細胞接着を注入または偽注入マウスでローリングします。それによって、実験中に生体内のプロセスに干渉されていない蛍光蛋白質を表現する遺伝子改変レポーター マウスの重要性を示しました。さらに、蛍光トレーサーの尾静脈注射頸静脈カテーテル注射に可能な選択肢があります。

頸動脈 LysMCre+IRG+の AngII で注入されたマウスは、IVM を用いて観察しました。アクリジン オレンジは、頸静脈カテーテルを用いた注入しました。(これは容器との相互作用細胞型の差別に開いている残ったので船との対話可能性がありますもすべての有核循環細胞と比較して血管壁との接触する LysM+細胞の割合を見てを目指しました私たちの以前の作品からの質問)。ベースラインで頸静脈カテーテルの存在する LysM+細胞 (図 2 aD) の付着が発生します。同じ細胞が蛍光、アクリジン オレンジ注射後がまた内皮細胞が蛍光 (図 2 b, E)。内皮を制限するバック グラウンドの低減は、蛍光関連後、データ示す核付着細胞はすべている LysM+ (図 2f)。私たちの以前の結果を確認して、LysMCre+IRG+が AngII の LysM+細胞の活性化に及ぼす影響を観察するためのよいモデルであることを示す AngII 注入後は、これらの結果が当てはまります。
アクリジン オレンジ LysMCre+IRG+で AngII 注入後 LysM+細胞の活性化での投与経路の役割を評価しました。AngII 輸液、白血球の血管内皮細胞の相互作用の 1 週間後 LysMCre+IRG+の頚動脈でマウスがイメージし、IVM アクリジン オレンジ インジェクション尾静脈、頸静脈カテーテルを介しての有無で可視化しました。カテーテルや注射、なし LysM+細胞の圧延有意に増加した後 AngII 注入未処理マウスと接着に比べて増加して (図 3)。アクリジン オレンジ増加頸静脈カテーテルの接着と AngII で圧延の注入は、カテーテル (図 3) なしのマウスと比較して大きい程度にマウスを扱われます。アクリジン オレンジの尾静脈内の注入とアクリジン オレンジ (図 3) の注入を受信しなかったマウスと比較する転がりと同様の接着になります。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig1.jpg"> 
図 1。アンジオテンシン II 注入する LysM+の評価方式セル圧延とマウスで接着。LysMCre+IRG+マウス 7 日わいて AngII とアクリジン オレンジの尾静脈、頸静脈カテーテルを通じて注入の有無 LysM+をローリングし同様に付着、頸動脈の細胞の定量を行ったインジェクション。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig2.jpg"> 
図 2。LysM+細胞接着、圧延 LysMCre+の頚動脈の IRG+マウスの査定。LysM 接着+細胞 LysMCre+の IRG+マウス (A, D) 前に、頸静脈カテーテル (B, E) アクリジン注入後。赤と緑の蛍光を記録した、(緑) の LysM+細胞と平滑筋細胞 (赤) で表示されています。アクリジン オレンジの注入後、内皮細胞でも緑色で表示されますが、背景の蛍光性を削除することによりセルの視覚化 (C, F) を核だけを循環します。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56948/56948fig3.jpg"> 
図 3。アンジオテンシン II の蛍光色素の投与経路の評価は、IRG+マウス LysMCre+を注入しました。ローリング (A) と (B) LysM+を付着の定量細胞偽運営または AngII 注入動物と頸静脈カテーテルを用いたアクリジン オレンジの尾静脈注射による注入の有無。さまざまな条件 (C) の代表的な写真。結果は、平均の平均 ± 標準誤差です。2 ウェイ ANOVA を行った、ボンフェローニのホックを投稿テスト、n = 3-12/グループ;p &#60; 0.05。<a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56948/56948fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Visualizing Leukocyte Rolling and Adhesion in Angiotensin II-Infused Mice: Techniques and Pitfalls

この原稿は、トランスジェニック レポーター マウスの使用は、アンジオテンシン II による高血圧は血管の生体顕微鏡を使用して免疫細胞の活性化を評価する蛍光色素の異なる投与経路について説明しますと、ロールし、内皮に付着する機能。

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

Epifluorescence intravital video microscopy (IVM) of blood vessels is an established method to evaluate the activation of immune cells and their ability ...

visualizing-leukocyte-rolling-adhesion-angiotensin-ii-infused-mice

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

8.6K ビュー.  University Medical Center Mainz. この原稿は、トランスジェニック レポーター マウスの使用は、アンジオテンシン II による高血圧は血管の生体顕微鏡を使用して免疫細胞の活性化を評価する蛍光色素の異なる投与経路について説明しますと、ロールし、内皮に付着する機能。

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Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists. The value of 2P microscopy is that it provides rich spatiotemporal information regarding cell behaviors within intact tissues and in live mice. Leukocyte recruitment plays a significant role in host defense against infection and when unchecked, can contribute to inflammatory and autoimmune diseases. Studying leukocyte recruitment in vivo is technically challenging since cells are moving rapidly within vessels located deep within light scattering tissues. To date, most intravital imaging studies require surgical preparation to expose the blood vessels and tissues. To avoid the tissue damage and inflammation induced by surgery itself, here, we describe a non-invasive single-cell imaging approach that can be used to study leukocyte trafficking in the mouse footpad and phalanges. We discuss the technical aspects of our 2P imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

Non-invasive Imaging of Leukocyte Homing and Migration in vivo

Here, we describe a non-invasive two-photon (2P) microscopy approach to study leukocyte homing in the mouse footpad. We discuss the technical aspects of our tissue imaging preparation and walk the reader through a typical experiment from initial set up to execution and data collection.

白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで</em

Two-photon (2P) microscopy is a high resolution imaging technique that has been broadly adapted by biologists.  The value of 2P microscopy is that it ...

免疫・感染学

Imaging Leukocyte Adhesion to the Vascular Endothelium at High Intraluminal Pressure

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. In the vasculature hypertension is associated with endothelial dysfunction and increased inflammation leading to atherosclerosis and various disease states such as chronic kidney disease2, stroke3 and heart failure4. An initial step in vascular inflammation leading to atherogenesis is the adhesion cascade which involves the rolling, tethering, adherence and subsequent transmigration of leukocytes through the endothelium. Recruitment and accumulation of leukocytes to the endothelium is mediated by an upregulation of adhesion molecules such as vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM-1), intracellular cell adhesion molecule-1 (ICAM-1) and E-selectin as well as increases in cytokine and chemokine release and an upregulation of reactive oxygen species5. In vitro methods such as static adhesion assays help to determine mechanisms involved in cell-to-cell adhesion as well as the analysis of cell adhesion molecules. Methods employed in previous in vitro studies have demonstrated that acute increases in pressure on the endothelium can lead to monocyte adhesion, an upregulation of adhesion molecules and inflammatory markers6 however, similar to many in vitro assays, these findings have not been performed in real time under physiological flow conditions, nor with whole blood. Therefore, in vivo assays are increasingly utilised in animal models to demonstrate vascular inflammation and plaque development. Intravital microscopy is now widely used to assess leukocyte adhesion, rolling, migration and transmigration7-9. When combining the effects of pressure on leukocyte to endothelial adhesion the in vivo studies are less extensive. One such study examines the real time effects of flow and shear on arterial growth and remodelling but inflammatory markers were only assessed via immunohistochemistry10. Here we present a model for recording leukocyte adhesion in real time in intact pressurised blood vessels using whole blood perfusion. The methodology is a modification of an ex vivo vessel chamber perfusion model9 which enables real-time analysis of leukocyte -endothelial adhesive interactions in intact vessels. Our modification enables the manipulation of the intraluminal pressure up to 200 mmHg allowing for study not only under physiological flow conditions but also pressure conditions. While pressure myography systems have been previously demonstrated to observe vessel wall and lumen diameter11 as well as vessel contraction this is the first time demonstrating leukocyte-endothelial interactions in real time. Here we demonstrate the technique using carotid arteries harvested from rats and cannulated to a custom-made flow chamber coupled to a fluorescent microscope. The vessel chamber is equipped with a large bottom coverglass allowing a large diameter objective lens with short working distance to image the vessel. Furthermore, selected agonist and/or antagonists can be utilized to further investigate the mechanisms controlling cell adhesion. Advantages of this method over intravital microscopy include no involvement of invasive surgery and therefore a higher throughput can be obtained. This method also enables the use of localised inhibitor treatment to the desired vessel whereas intravital only enables systemic inhibitor treatment.

This is a method to visualise leukocyte adhesion to the endothelium in harvested pressurised vessels. The technique enables studying vascular adhesion under shear flow with differing intraluminal pressures up to 200 mmHg thus mimic-ing the pathophysiological conditions of high blood pressure.

高腔内圧で血管内皮へのイメージングの白血球接着

Worldwide, hypertension is reported to be in approximately a quarter of the population and is the leading biomedical risk factor for mortality worldwide. ...

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury leading to permanent pathological damage. Existing conventional assays allow the analysis of leukocyte adhesion molecules only after the extraction of leukocytes from the blood. This requires the blood to undergo several steps before peripheral blood leukocytes (PBLs) can be ready for analysis, which in turn can stimulate PBLs influencing the research findings. The autoperfused micro flow chamber assay, however, allows scientists to study early leukocytes functional dysregulation using the systemic flow of a live mouse while having the freedom of manipulating a coated chamber. Through a disease model, the functional expression of leukocyte adhesion molecules can be assessed and quantified in a micro-glass chamber coated with immobilized endothelial adhesion molecules ex vivo. In this model, the blood flows between the right common carotid artery and left external jugular vein of a live mouse under anesthesia, allowing the interaction of native PBLs in the chamber. Real-time experimental analysis is achieved with the assistance of an intravital microscope as well as a Harvard Apparatus pressure device. The application of a flow regulator at the input point of the glass chamber allows comparable physiological flow conditions amongst the experiments. Leukocyte rolling velocity is the main outcome and is measured using the National Institutes of Health open-access software ImageJ. In summary, the autoperfused micro flow chamber assay provides an optimal physiological environment to study leukocytes endothelial interaction and allows researchers to draw accurate conclusions when studying inflammation.

Assessing Leukocyte-endothelial Interactions Under Flow Conditions in an Ex Vivo Autoperfused Microflow Chamber Assay

Here, we present a protocol that allows the investigator to assess leukocyte recruitment dynamics ex vivo by connecting a chamber coated with endothelial-derived adhesion molecules to the circulatory system of a mouse. This method offers significant advantages since it allows for leukocyte assessment under relative biological conditions.

におけるフローの状況の下で白血球 - 内皮相互作用を評価する<em&gt;エクスビボ</em&gt; Autoperfusedマイクロフローチャンバーアッセイ

Leukocyte-endothelial interactions are early and critical events in acute and chronic inflammation and can, when dysregulated, mediate tissue injury ...

生物工学

Real-time Imaging of Endothelial Cell-cell Junctions During Neutrophil Transmigration Under Physiological Flow

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known as leukocyte transendothelial migration. Two routes for leukocytes to cross the endothelial monolayer have been described: the paracellular route, i.e., through the cell-cell junctions and the transcellular route, i.e., through the endothelial cell body. However, it has been technically difficult to discriminate between the para- and transcellular route. We developed a simple in vitro assay to study the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during neutrophil transendothelial migration under physiological flow conditions. Prior to neutrophil perfusion, endothelial cells were briefly treated with fluorescently-labeled antibodies against VE-cadherin and PECAM-1. These antibodies did not interfere with the function of both proteins, as was determined by electrical cell-substrate impedance sensing and FRAP measurements. Using this assay, we were able to follow the distribution of endogenous VE-cadherin and PECAM-1 during transendothelial migration under flow conditions and discriminate between the para- and transcellular migration routes of the leukocytes across the endothelium.

Leukocytes cross the endothelial monolayer using the paracellular or the transcellular route. We developed a simple assay to follow the distribution of endogenous junctional VE-cadherin and PECAM-1 during leukocyte transendothelial migration under physiological flow to discriminate between the two transmigration routes.

好中球遊出の下で生理的流れの間に内皮細胞 - 細胞接合のリアルタイムイメージング

During inflammation, leukocytes leave the circulation and cross the endothelium to fight invading pathogens in underlying tissues. This process is known ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in vivo is crucial for understanding the molecular basis of leukocyte transendothelial migration and interaction with vascular endothelium. One powerful approach involves intravital microscopy on transgenic mice expressing fluorescent proteins in cells of interest.
Here we present a protocol for imaging monocytes and neutrophils in the CX3CR1gfp/wt mouse i.v. injected with orange dye-labeled neutrophils with an inverted confocal microscope. Time-lapse movies gathered from 30 min&#160;to several hours of imaging allow the analysis of leukocyte behavior in mesenteric veins under both steady state and inflammatory conditions. We also describe the steps to locally induce blood vessel inflammation with TLR2/TLR1 agonist Pam3SK4 and monitor the subsequent recruitment of neutrophils and monocytes.
The presented technique can also be used to monitor other populations of leukocytes and investigate molecules implicated in leukocyte recruitment or trafficking using other stimuli or transgenic mice.

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Leukocyte Infiltration of Cremaster Muscle in Mice Assessed by Intravital Microscopy

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The current protocol represents a practical and reproducible method to visualize the leukocyte endothelium interaction leading to leukocyte recruitment in skeletal muscle derived tissue within the intact organism of the mouse. The model is applicable to all fields of research that focus on granulocyte activation and their role in disease.
We provide a step by step protocol to guide through the method and to highlight potential pitfalls and technical difficulties. The protocol covers the following aspects: experimental settings and required material, anesthesia of the mouse, dissection of the cremaster muscle as well as tracheal and carotid cannulation, IVM recordings and offline analysis. Data formats like adherent leukocytes, rolling flux (RF) and rolling flux fraction (RFF) are explained in detail and appropriate applications are discussed. Representative results from dystrophin deficient mdx mice are provided in the results section.
IVM is a powerful tool to assess leukocyte recruitment in an in vivo setting; however, delineating for example endothelial and leukocyte function may require a combination with ex vivo setups like flow chamber experiments. Furthermore, the genetic background of animals of interest may greatly influence baseline recruitment, requiring individual fine tuning of the protocol provided. Despite its limitations, IVM may serve as a platform to readily translate in vitro findings into a living vertebrate organism.

Here, we show how to perform intravital microscopy on post-capillary venules of the mouse cremaster muscle. Commonly applied to different models of inflammation and sepsis, particularly those induced by chemokines and cytokines, we highlight its relevance in the study of muscolopathies involving exaggerated muscular leukocyte infiltration.

インビタル顕微鏡で評価されたマウスにおけるクレマスター筋の白血球浸潤

Intravital microscopy (IVM) is widely used to monitor physiological and pathophysiological processes within the leukocyte recruitment cascade in vivo. The ...

Imaging Molecular Adhesion in Cell Rolling by Adhesion Footprint Assay

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of inflammation. This phenomenon occurs in postcapillary venules, where blood flow pushes leukocytes in a rolling motion on the endothelial cells. Stable rolling requires a delicate balance between adhesion bond formation and their mechanically-driven dissociation, allowing the cell to remain attached to the surface while rolling in the direction of flow. Unlike other adhesion processes occurring in relatively static environments, rolling adhesion is highly dynamic as the rolling cells travel over thousands of microns at tens of microns per second. Consequently, conventional mechanobiology methods such as traction force microscopy are unsuitable for measuring the individual adhesion events and the associated molecular forces due to the short timescale and high sensitivity required. Here, we describe our latest implementation of the adhesion footprint assay to image the P-selectin: PSGL-1 interactions in rolling adhesion at the molecular level. This method utilizes irreversible DNA-based tension gauge tethers to produce a permanent history of molecular adhesion events in the form of fluorescence tracks. These tracks can be imaged in two ways: (1) stitching together thousands of diffraction-limited images to produce a large field of view, enabling the extraction of adhesion footprint of each rolling cell over thousands of microns in length, (2) performing DNA-PAINT to reconstruct super-resolution images of the fluorescence tracks within a small field of view. In this study, the adhesion footprint assay was used to study HL-60 cells rolling at different shear stresses. In doing so, we were able to image the spatial distribution of the P-selectin: PSGL-1 interaction and gain insight into their molecular forces through fluorescence intensity. Thus, this method provides the groundwork for the quantitative investigation of the various cell-surface interactions involved in rolling adhesion at the molecular level.

This protocol presents the experimental procedures to perform the adhesion footprint assay to image the adhesion events during fast cell rolling adhesion.

接着フットプリントアッセイによる細胞転動における分子接着性のイメージング

Rolling adhesion, facilitated by selectin-mediated interactions, is a highly dynamic, passive motility in recruiting leukocytes to the site of ...

生物学

Quantification of Diabetes-induced Adherent Leukocytes in Retinal Vasculature

Leukostasis refers to the attachment of leukocytes to the luminal wall of the vasculature. This interaction of leukocytes with the wall of blood vessels is characteristic of inflammation and has been causally linked to capillary occlusion in a variety of tissues and diseases, including diabetic retinopathy. 
Leukostasis has been reported for years as a life-threatening complication of hyperleukocytosis and can only be diagnosed clinically. Given the importance of the phenomenon, intensive research has been done to understand the potential mechanism(s) that lead to its manifestation; however, there is no gold-standard technique in laboratory settings to visualize and quantify the severity of the event.
In the method summarized below, the vasculature is initially perfused with a buffer to remove blood, and then, concanavalin A is perfused into the vasculature where it binds to all exposed cell walls and causes especially bright staining of leukocytes. If the perfusion to remove all unbound blood cells was successful, the remaining fluorescently labeled leukocytes are bound to the vasculature, and they can be manually quantified using any available fluorescence microscope.

We demonstrate a method to label the walls of the retinal vasculature and adherent leukocytes. These adherent leukocytes can then be counted under a fluorescence microscope as a parameter of inflammation or the response of that inflammation to therapies.

網膜血管系における糖尿病誘発性付着性白血球の定量化

Leukostasis refers to the attachment of leukocytes to the luminal wall of the vasculature. This interaction of leukocytes with the wall of blood vessels ...

白血球ローリングとアンジオテンシン II に注入されたマウスにおける付着の可視化: 技術と落とし穴

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白血球ホーミングと移行の非侵襲的イメージング in vivoで