Name: imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time
Uploaded: 2015-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 28 s
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This work was supported by EMBO (to Y.E.), Foundation Machaon (to Y.E.) and SNSF (to B.A.I.). We thank the Bioimaging Core Facility for the availability of the Nikon A1r microscope and technical assistance. We thank Mrs. Clarissa Bartley for English correction.

注：動物の手順は、スイスのジュネーブで動物ケアの機関倫理委員会、州立獣医事務所に基づいて行われました。認証番号GE / 14分の63。 骨髄からの単一細胞懸濁液の調製<ol><li>頸椎脱臼により犠牲マウス（8〜12週齢）。 70％エタノールで後ろ足を滅菌します。後ろ足から肌を削除します。 </li><li>マウスの大腿骨と脛骨を解剖し、メスで脚から組織を除去します。 PBSで満たされた培養皿に90％のエタノールと場所で足を洗うこと。 </li><li>膝関節でメスと独立と大腿骨と脛骨から培養フード、クリーンな組織の下で。骨の両端をカット。 </li><li> 23G針および調製培地を充填した1mlシリンジ（フェノールレッドを含まないDMEM / F12、1％ラット血清）を用いて、各骨からフラッシュ骨髄、50 mlのチューブにねじ。微妙23G NEを通じて継代することにより、細胞凝集体を混乱させるedleと1mlシリンジ。準備中で25ミリリットルに全量を。 </li><li>遠心分離機250×gで、5分間、4°C。上清を捨てます。 1ml中に再懸濁ペレットを赤血球溶解RBLCバッファー15ml中のチューブをネジ（8.3グラムのNH 4 Clを 、蒸留水で1リットルに完全に1グラムのNaHCO 3、1ミリリットルのEDTA（100 mM）の、0.22μmのフィルタ処理）。氷上で30秒インキュベートします。 </li><li>準備中と遠心分離250×gでの10ミリリットルを追加し、5分、4℃。 2ミリリットルの調製培地中の上清と再懸濁を捨てます。 </li></ol>ネガティブ選択により2好中球濃縮<ol><li>マウスの好中球濃縮カクテル（細胞単離プラットフォームキットなどEasySepなど）を150μlを追加します。混合し、氷上で10分間インキュベートします。 </li><li>フェノールレッドを含まないDMEM 10mlのを追加します。一度裏返し、遠心分離機250×gで、3分、4°C。 </li><li>上清を捨てます。下部チューブラウンド5ミリリットルポリスチレン中1.75ミリリットル準備中で再懸濁ペレット。 250μlのビオを追加選択カクテルインチ混合し、氷上で10分間インキュベートします。 </li><li>粒子を再懸濁するために30秒間（細胞単離プラットフォームキットから）磁性粒子を渦。細胞懸濁液に500μlの磁性粒子を追加します。混合し、氷上で10分間インキュベートします。 </li><li>磁石にチューブを置きます。 3分を待ちます。 </li><li>目的の非標識細胞を収集するために、下部のチューブ新ラウンド5ミリリットルポリスチレン上に磁石を反転。チューブにぶら下がって最後の一滴を取ってはいけません。不要な細胞は、磁石内部チューブ内に残ります。バイオハザード廃棄物の中に、このチューブを捨てます。 </li><li>磁石に新しいチューブを置きます。 3分を待ちます。 </li><li>新しい15mlを希望する非標識細胞を収集するためにスクリュー管に磁石を反転。チューブにぶら下がって最後の一滴を取ってはいけません。 </li><li>フェノールレッドを含まないDMEMで5ミリリットルへの完全なボリューム。 </li></ol>好中球の3ラベリング<ol><li>このような細胞トラッカーオレンジ（使用濃度としてオレンジ色の色素の0.5μLを追加1μM、CMRA - クロロ - rodol酢酸、DMSO中の10mMストック）。 37℃で2分間インキュベートします。 </li><li>準備中の2.5ミリリットルを追加します。遠心分離機250×gで、5分間、4°C。 </li><li>上清を捨てます。 1.5mlチューブで1ミリリットル準備中で再懸濁ペレット。 </li><li>血球計数器でカウントするアリコートを取ります。 </li><li> 37℃で5分間インキュベートします。遠心分離機250×gで、5分間、4°C。 </li><li>上清を捨てます。 1mlのPBS中に再懸濁ペレット。遠心250×gで5分間、洗浄するために4℃。 </li><li>上清を捨てます。 100μlのPBSあたり10×10 6個の細胞として再懸濁ペレット。静脈内注射するまで氷上で保管してください。注：細胞は、可能な限り迅速に静脈注射する必要があります。 6-12x10 6好中球/マウスは、通常、得られます。 </li></ol>生体顕微鏡4.マウスの準備注：ステップ4.1）および4.2）は、IC上の標識された好中球の延長待ち時間を回避するために、実験の開始時に実行されるべきですE。 <ol><li> （8-12週齢）CX 3 CR1 GFPマウスを計量。 </li><li> （PBS中1.75ミリグラム/キログラムacepromazoneケタミン60 mgの/ kgで、キシラジン4.5mgの/キログラム）麻酔薬の800μLを準備します。 </li><li>マウスを麻酔。マウスを200μl/ 20gで射出IP。ピンチと呼吸数をチェックすることにより、TOEによって制御麻酔。 </li><li>静脈内に実験者の都合で、外側尾静脈または眼窩洞を使用して、好中球（100μlのPBS中の10×10 6細胞 ）を注入します。 </li><li>加熱パッドの上にマウスを置くと、眼のゲルで目を保護します。 </li><li>ガラスカバースリップ（直径35mm）の直径30mmの穴を有する10cmの組織培養皿に入れます。使用する油は、カバーガラスと接触している組織培養皿を維持することです。 </li><li>腹膜を露出するようにはさみで腹部の皮膚を切開。腸を露出するようにハサミで腹膜を切開。 </li><li> Pに200μlのPBSを（37℃に予熱）を追加しますeritoneal空洞。あなたの手でマウスを取り、腸は穏やかな圧力で腹腔から外れているので、それは、下向きに回します。組織培養皿にマウスを置きます。 </li><li>静かに腸間膜の血管を露出させるためにカバースリップ上に滅菌綿棒で腸をderoll。 </li><li>バンドにティッシュペーパーをカットし、37℃で加熱し、PBSでそれらを濡らし。蠕動運動から生じる運動を減少させるためにティッシュペーパーの作品で腸を固定。 </li><li>倒立顕微鏡のカスタムメイドのトレイステージに、37℃に温度調節チャンバー内に組織培養皿やマウスを置きます。後肢に麻酔薬SCを含む注射器を導入。注：また、マウスマスクで酸素（0.5 L /分）を受信することができます。 </li><li>つま先をつまんや呼吸数を30分毎にチェックすることによって、麻酔のための制御マウス。必要に応じて、適切に麻酔を維持するために、麻酔薬のブースト（20μl）を提供します。 NOTE：血管系の乾燥は避けるべきです。したがって、その湿度を定期的に37°Cに加温したPBS腸を固定するために使用される紙組織を湿潤することによって維持されます。 </li></ol> 5.生体顕微鏡を用いてin vivoで炎症を起こした船舶に好中球および単球挙動を測定<ol><li>レーザー誘起光毒性を避けるために必要な最低限の電力で488と561-にレーザーを設定します。我々の実験では、0.5％未満です。好中球、単球におけるGFPとオレンジ染料の強度は、通常、0.3％が十分であるように明るいです。注：これは、我々のシステムで0.15 mWの0.25へのレーザーパワーを表します。 </li><li>倒立顕微鏡の20X乾燥対物レンズを使用して開いたピンホールで2.2秒で512×512ピクセル（ すなわち、635ミクロン）の画像を取得します。低レーザ出力で十分な信号を確実に、10〜20μmの間にZ深度を使用してください。 注：我々は、通常12〜16の間のZ深度で実験を行います56;メートル。発表の数字や映画の場合には、Z深度は20μmです。位相差は、内皮壁の同定を可能にし、イメージングは​​腸間膜静脈に行われます。パトロール細胞が関心のある分野を記録し、5〜10ミクロン/分6の速度で、非常にゆっくりと移動するので、すべての20秒で十分です。記載されている設定では、電動ステージが同時に関心を最大7つのフィールドを記録することができます。 </li><li>彼らは最初の映画の獲得30分前の準備から回復することを可能にしているマウスと顕微鏡の恒温槽内の腸間膜血管を置きます。この間、関心のいくつかのフィールドを選択します。客観的に最も近い血管の管腔表面に焦点を当てています。必要に応じて、フォーカスを設定する内皮のわずかな自家蛍光を利用します。 注：マウスの​​準備中に手術は少し内皮を強調しています。その結果、好中球のローリングと/または単球をマウスの準備の後の最初の15分間で観察することができます。 </li><li>定常状態の条件の下で30分、1画像ごとに20秒間の最初の映画を記録します。 注：ソフトウェアが2.2秒の関心の各フィールドを取得し、電動ステージが自動的に他の1つのフィールドから移動します。なお、記録映画の30分の間に戻って20秒以内に最初の位置に戻ります。 </li><li>血管の炎症を開始するには、画像化された血管に直接TLR2 / TLR1アゴニストPam3CSK4 12を100μgを含む20μlのPBSのドロップを追加します。 </li><li>興味のある各フィールドのフォーカスを制御します。 注：取得の過程で、z軸上の焦点のわずかな変化が常に存在します。 10-20ミクロンのZ深さにもかかわらず、これは、蛍光強度の減少をもたらすことができます。必要に応じてそのため、手動で、各ムービーの最後に関心の各フィールドを再び焦点を合わせます。 30分-期間についてとに3時間まで記録映画TAL炎症の開始後。 </li><li>実験の最後に、頚椎脱臼により麻酔したマウスを生け贄に捧げます。 </li></ol>白血球の動画ファイルと追跡の6世代注：ニコン収集ソフトウェアが.nd2ファイルを生成しますが、次の手順では、他のソフトウェアとブランドと同様です。 <ol><li> TIFFシリーズとしてエクスポートファイル。 </li><li> ImageJソフトウェア（に行く<a href="http://rsb.info.nih.gov/ij/">http://rsb.info.nih.gov/ij/）。</a> TIFFシリーズをインポートします。別のファイルとして各チャネル。 </li><li>バックグラウンドノイズを低減するために、緑と赤のチャンネル（処理&gt;フィルタ&gt;中央...）2.0ピクセルの半径のメディアンフィルタを適用します。 </li><li> （バイナリを作る&gt;プロセス&gt;バイナリ）のバイナリにファイルを変換します。各画像のしきい値を計算するためのソフトウェアを有効にします。 </li><li>一つの画像シリーズ（画像&gt;カラー&gt; ...チャンネルをマージ）にチャンネルをマージします。 GREEで単球を選択nチャネル、赤チャネルと灰色のチャネルでの透過光中の好中球。 </li><li> RGBの各色に積み重ねられた画像を変換する（画像&gt;カラー&gt; RGBにスタック）。 </li><li> .AVIなどのファイルを保存します</li><li>データがインポートされ、IMARISソフトウェア（ビットプレーン）にまとめられています。単球および好中球の運動はその後、スポットトラッキングウィザードを使用して追跡されます。 </li></ol>

<ol>
	<li>Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Getting+to+the+site+of+inflammation:+the+leukocyte+adhesion+cascade+updated.">Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated.</a> Nat Rev Immunol. 7, 678-689 (2007).</li><li>Nourshargh, S., Hordijk, P. L., Sixt, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breaching+multiple+barriers:+leukocyte+motility+through+venular+walls+and+the+interstitium.">Breaching multiple barriers: leukocyte motility through venular walls and the interstitium.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 11, 366-378 (2010).</li><li>Nourshargh, S., Alon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+migration+into+inflamed+tissues.">Leukocyte migration into inflamed tissues.</a> Immunity. 41, 694-707 (2014).</li><li>Ley, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chapter+11.+Intravital+microscopic+investigation+of+leukocyte+interactions+with+the+blood+vessel+wall.">Chapter 11. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nr4a1-dependent+Ly6C(low)+monocytes+monitor+endothelial+cells+and+orchestrate+their+disposal.">Nr4a1-dependent Ly6C(low) monocytes monitor endothelial cells and orchestrate their disposal.</a> Cell. 153, 362-375 (2013).</li><li>Hamon, P., Rodero, M. P., Combadiere, C., Boissonnas, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+mouse+bone+marrow+monocytes+in+vivo.">Tracking mouse bone marrow monocytes in vivo.</a> J Vis Exp. , (2015).</li><li>Iqbal, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+CD68+promoter+GFP+transgenic+mice+allow+analysis+of+monocyte+to+macrophage+differentiation+in+vivo.">Human CD68 promoter GFP transgenic mice allow analysis of monocyte to macrophage differentiation in vivo.</a> Blood. 124, e33-e44 (2014).</li><li>Jenne, C. N., Wong, C. H., Petri, B., Kubes, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+spinning-disk+confocal+microscopy+for+the+intravital+analysis+of+platelet+dynamics+in+response+to+systemic+and+local+inflammation.">The use of spinning-disk confocal microscopy for the intravital analysis of platelet dynamics in response to systemic and local inflammation.</a> PloS One. 6, e25109 (2011).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

この原稿に記載された方法論は、効率的に定常状態および炎症状態下腸間膜静脈に単球および好中球の挙動を研究するための一貫したアプローチを提供します。 準備の重要なステップは、PBSで湿っ組織と腸の固定化です。正しく実行した場合、腸間膜血管がうまく画像取得のためのカバースリップ上に露出されています。これは、腸間膜静脈の白血球の挙動を監視する?...

<html>好中球および単球は、継続的に血液中を循環自然免疫系の細胞です。傷害または感染すると、炎症性シグナルは、ここで、細胞性免疫応答1-3を開始し 、破損して感染した組織への白血球の漏出を誘導します。白血球動員の迅速性は、免疫応答の肯定的な結果を決定します。これらの複雑なプロセスは、白血球に関与する分子の洞察を得る.TO循環白血球と内皮1-3との間の接着の連絡先を確立するために役立つ炎症を起こした内皮に存在する特定の分子（例えば、セレクチン、内皮に結合したケモカイン）に依存しています採用カスケードは、細胞動員の動態を可視化するために、各セル/集団の挙動を追跡することが重要です。効果的な方法は、目的の細胞内で蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスに生体顕微鏡を含みます。 現在までの内容は&quot;&gt;、生体顕微鏡を用いて、いくつかの方法が画像に開発された血管系4,5。例えば、耳の真皮の血管系や生体共焦点顕微鏡による腸間膜静脈の撮像は、マウスLy6C 低い単球および人間のパトロール動作を識別するために使用されましたCD14は、定常状態条件6~8の下の血管の管腔表面上のCD16 +単球を暗く。マウス精巣挙血管系モデルは、多くの場合、トランスジェニックマウスにおける炎症性または虚血状態下での好中球または炎症Ly6C 高い単球の挙動を監視するために使用される。それは場合、精巣挙がIL1β、CCL2、TNFβまたはfMLPのの陰嚢内注射を介して刺激される。2-4時間後、組織はその後、外科的に露出されており、生体共焦点顕微鏡9-11で分析しました。 以下のプロトコルは、任意のと同時に、単球および好中球を監視するための方法を記載倒立蛍光共焦点顕微鏡。また、私たちの方法は、白血球動員の動態を追跡するためにどのように前の画像と同じ容器を（定常状態）にし、炎症後及び方法について説明します。この目的のために、我々は、その単球のeGFPを発現し、IVオレンジ色素で標識されたマウスの好中球を注射されたCX 3 CR1 GFP /重量マウスを使用しています。倒立共焦点顕微鏡を使用して、（1）追跡し、定常状態と、（2）局所炎症後の同じ容器の両方の単球および好中球の動員を追跡する下パトロールLy6C 低い単球を分析することが可能です。ここでは、Pam3CSK4 12 TLR2 / TLR1アゴニストを使用して炎症状態を作成します。また、このような撮像は、特定のノックアウトマウスまたは遮断抗体6,9,13の存在下で実行した場合の白血球動員カスケードの様々な段階での関心の特定の分子の役割を決定するのに役立つことがあります。

<table><tbody><tr><td>5 ml polystyrene round bottom tubes&amp;nbsp;</td><td>Beckton Dickinson</td><td>352058</td><td></td></tr><tr><td>10x CFI Plan Apochromat 0.45&amp;nbsp;&amp;nbsp; DT:4mm&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>20x CFI Plan Apochromat VC 0.75 DT:1mm&amp;nbsp;</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Orange CMRA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C34551</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Magnet</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>18000</td><td></td></tr><tr><td>EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td><td>Stem Cell Technologies</td><td>19762</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-042</td><td></td></tr><tr><td>Immersion Oil Type A</td><td>Nikon</td><td></td><td>any viscous oil&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Life Box Temperature Control System</td><td>Life Imaging</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>NH4Cl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9434</td><td></td></tr><tr><td>Nikon A1R confocal microscope</td><td>Nikon</td><td>A1R</td><td>inverted microscope, motorized x/y/z stage, NIS elements software</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Life Technologies</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>phenol red free DMEM/F12</td><td>Life Technologies</td><td>21041-025</td><td>any phenol red free medium is suitable</td></tr><tr><td>PAM3CSK4</td><td>Invivogen</td><td>tlrl-pms</td><td>reconstitute in PBS</td></tr><tr><td>Rat serum</td><td>Stem Cell Technologies</td><td></td><td>included in EasySep Mouse Neutrophil Enrichement kit</td></tr><tr><td>Tissue culture dish 100</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr></tbody></table>

imaging neutrophils and monocytes in mesenteric veins by intravital microscopy on anaesthetized mice in real time

効率的な免疫応答は、感染または傷害の部位への血液の白血球の急速な動員に依存しています。 in vivoでの白血球遊走を調査することは、血管内皮と白血球の経内皮遊走との相互作用の分子基盤を理解するために重要です。一つの強力なアプローチは、目的の細胞に蛍光タンパク質を発現するトランスジェニックマウスの生体顕微鏡を必要とします。 ここでは、倒立型共焦点顕微鏡でオレンジ色の色素で標識された好中球を注射されたCX 3 CR1 GFP /重量マウス静脈撮像単球および好中球のためのプロトコルを提示します。タイムラプスムービーが両方の定常状態および炎症状態下腸間膜静脈の白血球の挙動の分析を可能にする画像の数時間に30分から集められました。ローカルTLR2 / TLR1アゴニストPam3SK4と血管の炎症を誘導し、subsequeを監視するために、我々はまた、手順を説明します好中球および単球のNT募集。 提示された技術はまた、白血球の他の集団を監視し、他の刺激またはトランスジェニックマウスを用いて白血球動員または輸送に関与する分子を調査するために使用することができます。

原稿を簡単にリアルタイムで麻酔したマウスの腸間膜静脈内単球および好中球の挙動を監視するために最適化されたプロトコルを記述します。 37°C-サーモスタット室の使用は、マウスの温度を維持し、また、白血球の温度依存移動によることが必須です。マウスの作製は、 図1、図2に示す顕微鏡で見たすべての領域に表示されます。透過光は、腸間膜静脈（赤矢印）と動脈（青?...

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Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

Efficient immune response is dependent on rapid mobilization of blood leukocytes to the site of infection or injury. Investigating leukocyte migration in ...

imaging-neutrophils-monocytes-mesenteric-veins-intravital-microscopy

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

10.5K ビュー.  University of Geneva. We detail a protocol to monitor the behavior of neutrophils and monocytes in mesenteric veins under steady state and inflammatory conditions using intravital confocal microscopy on anaesthetized mice.

ビデオ: Imaging Neutrophils and Monocytes in Mesenteric Veins by Intravital Microscopy on Anaesthetized Mice in Real Time

Tracking Neutrophil Intraluminal Crawling, Transendothelial Migration and Chemotaxis in Tissue by Intravital Video Microscopy

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the postcapillary venules of inflamed tissue, leukocytes initially tether and roll on the luminal surface of venular wall. Rolling leukocytes arrest on endothelium and undergo firm adhesion in response to chemokine or other chemoattractants on the venular surface. Many adherent leukocytes relocate from the initial site of adhesion to the junctional extravasation site in endothelium, a process termed intraluminal crawling3. Following crawling, leukocytes move across endothelium (transmigration) and migrate in extravascular tissue toward the source of chemoattractant (chemotaxis)4. Intravital microscopy is a powerful tool for visualizing leukocyte-endothelial cell interactions in vivo and revealing cellular and molecular mechanisms of leukocyte recruitment2,5. In this report, we provide a comprehensive description of using brightfield intravital microscopy to visualize and determine the detailed processes of neutrophil recruitment in mouse cremaster muscle in response to the gradient of a neutrophil chemoattractant. To induce neutrophil recruitment, a small piece of agarose gel (~1-mm3 size) containing neutrophil chemoattractant MIP-2 (CXCL2, a CXC chemokine) or WKYMVm (Trp-Lys-Tyr-Val-D-Met, a synthetic analog of bacterial peptide) is placed on the muscle tissue adjacent to the observed postcapillary venule. With time-lapsed video photography and computer software ImageJ, neutrophil intraluminal crawling on endothelium, neutrophil transendothelial migration and the migration and chemotaxis in tissue are visualized and tracked. This protocol allows reliable and quantitative analysis of many neutrophil recruitment parameters such as intraluminal crawling velocity, transmigration time, detachment time, migration velocity, chemotaxis velocity and chemotaxis index in tissue. We demonstrate that using this protocol, these neutrophil recruitment parameters can be stably determined and the single cell locomotion conveniently tracked in vivo.

We describe a protocol of brightfield intravital microscopy for measuring dynamic neutrophil-endothelial cell interactions during neutrophil recruitment in response to the source of a neutrophil chemoattractant in vivo. Neutrophil intraluminal crawling, transendothelial migration and chemotaxis in mouse cremaster muscle tissue are visualized with time-lapsed video photography and tracked with ImageJ.

生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

The recruitment of circulating leukocytes from blood stream to the inflamed tissue is a crucial and complex process of inflammation1,2. In the ...

免疫・感染学

Real-time Imaging of Heterotypic Platelet-neutrophil Interactions on the Activated Endothelium During Vascular Inflammation and Thrombus Formation in Live Mice

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 During thrombus formation at the site of arteriolar injury, platelets adherent to the activated endothelium and subendothelial matrix proteins support neutrophil rolling and adhesion.3 Conversely, under venular inflammatory conditions, neutrophils adherent to the activated endothelium can support adhesion and accumulation of circulating platelets. Heterotypic platelet-neutrophil aggregation requires sequential processes by the specific receptor-counter receptor interactions between cells.4 It is known that activated endothelial cells release adhesion molecules such as von Willebrand factor, thereby initiating platelet adhesion and accumulation under high shear conditions.5 Also, activated endothelial cells support neutrophil rolling and adhesion by expressing selectins and intercellular adhesion molecule-1 (ICAM-1), respectively, under low shear conditions.4 Platelet P-selectin interacts with neutrophils through P-selectin glycoprotein ligand-1 (PSGL-1), thereby inducing activation of neutrophil &beta;2 integrins and firm adhesion between two cell types. Despite the advances in in vitro experiments in which heterotypic platelet-neutrophil interactions are determined in whole blood or isolated cells,6,7 those studies cannot manipulate oxidant stress conditions during vascular disease. In this report, using fluorescently-labeled, specific antibodies against a mouse platelet and neutrophil marker, we describe a detailed intravital microscopic protocol to monitor heterotypic interactions of platelets and neutrophils on the activated endothelium during TNF-&alpha;-induced inflammation or following laser-induced injury in cremaster muscle microvessels of live mice.

Here we report an experimental technique of fluorescence intravital microscopy to visualize heterotypic platelet-neutrophil interactions on the activated endothelium during vascular inflammation and thrombus formation in live mice. This microscopic technology will be valuable to study the molecular mechanism of vascular disease and to test pharmacologic agents under pathophysiological conditions.

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

Interaction of activated platelets and leukocytes (mainly neutrophils) on the activated endothelium mediates thrombosis and vascular inflammation.1,2 ...

Intravital Microscopy of Leukocyte-endothelial and Platelet-leukocyte Interactions in Mesenterial Veins in Mice

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this protocol, we describe intravital microscopy of mesentery veins. This can be performed in a short period of time with reproducible results showing leukocyte-endothelial interactions in vivo. We describe an inflammatory setting after LPS challenge of the endothelium. But in this model one can apply many different types of inflammatory conditions, like bacterial, chemical or biological and investigate the administration of drugs and their direct effects on the living animal and its impact on leukocyte recruitment. This protocol has been applied successfully to a number of different treatments of mice and their effects on inflammatory response in vessels. Herein, we describe the visualization of leukocytes and platelets by fluorescently labeling these with rhodamine 6G. Additionally, any specific imaging can be performed using targeted fluorescently labeled molecules.

This simplified application of intravital microscopy of mesentery veins in mice can be used in different models of inflammation to observe leukocyte-endothelial and platelet-leukocyte interactions.

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

Intravital microscopy is a method that can be used to investigate different processes in different regions and vessels in living animals. In this ...

Intravital Imaging of Neutrophil Priming Using IL-1&#946; Promoter-driven DsRed Reporter Mice

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that enhances the phagocytic functionality of neutrophils. Although extensive studies have unveiled the existence and importance of neutrophil priming during infection and injury, means of visualizing this process in vivo have been unavailable. The protocol provided enables monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals by combining three methodologies: 1) DsRed reporter signal &#8212; used as a measure of priming 2) in vivo neutrophil labeling &#8212; achieved by injection of fluorescence-conjugated anti-lymphocyte antigen 6G (Ly6G) monoclonal antibody (mAb) and 3) intravital confocal imaging. Several critical steps are involved in this protocol: oxazolone-induced mouse ear skin inflammation, appropriate sedation of animals, repeated injections of anti-Ly6G mAb, and prevention of focus drift during imaging. Although a few limitations have been observed, such as the limit of continuous imaging time (~ 8 hr) in one mouse and the leakage of fluorescein isothiocyanate-dextran from blood vessels in the inflammatory state, this protocol provides a fundamental framework for intravital imaging of primed neutrophil behavior and function, which can easily be expanded to examination of other immune cells in mouse inflammation models.

This current protocol employs fluorescent reporters, in vivo labeling, and intravital imaging techniques to enable monitoring of the dynamic process of neutrophil priming in living animals.

IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング

Neutrophils are the most abundant leukocytes in human blood circulation and are quickly recruited to inflammatory sites. Priming is a critical event that ...

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, including hematopoiesis, immune regulation and tumor regulation. Commonly used methods for understanding cellular actions in the bone marrow, such as histology and blood counts, provide static information rather than capturing the dynamic action of multiple cellular components in vivo. To complement the standard methods, a window chamber (WC)-based model was developed to enable serial in vivo imaging of cells and structures in the murine bone marrow. This protocol describes a surgical procedure for installing the WC in the femur, in order to facilitate long-term optical access to the femoral bone marrow. In particular, to demonstrate its experimental utility, this WC approach was used to image and track neutrophils within the vascular network of the femur, thereby providing a novel method to visualize and quantify immune cell trafficking and regulation in the bone marrow. This method can be applied to study various biological processes in the murine bone marrow, such as hematopoiesis, stem cell transplantation, and immune responses in pathological conditions, including cancer.

Femur Window Chamber Model for In Vivo Cell Tracking in the Murine Bone Marrow

The protocol describes a novel murine femur window chamber model that can be used to track movement of cells in the femoral bone marrow in vivo. Intravital multiphoton fluorescence microscopy is used to image three components of the femoral bone marrow (vasculature, collagen matrix, and neutrophils) over time.

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル<em&gt;インビボ</emマウス骨髄内&gt;細胞トラッキング

Bone marrow is a complex organ that contains various hematopoietic and non-hematopoietic cells. These cells are involved in many biological processes, ...

Intravital Microscopy of Monocyte Homing and Tumor-Related Angiogenesis in a Murine Model of Peripheral Arterial Disease

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic stenosis. Vascular surgery is a viable option in selected cases, but for patients without indications for surgery such as progression to rest pain, critical limb ischemia, or major disruptions to life or work, there are few possibilities for mitigating their disease. Cell therapy via monocyte-enhanced perfusion through the stimulation of collateral formation is one of a few non-invasive options.
Our group examines arteriogenesis after monocyte transplantation into mice using the hindlimb ischemia model. Previously, we have demonstrated improvement in hindlimb perfusion using tetanus-stimulated syngeneic monocyte transplantation. In addition to the effects on the collateral formation, tumor growth could be affected by this therapy as well. To investigate these effects, we use a basement membrane-like matrix mouse model by injecting the extracellular matrix of the Engelbreth-Holm-Swarm sarcoma into the flank of the mouse, after occlusion of the femoral artery.
After the artificial tumor studies, we use intravital microscopy to study in vivo tumor-angiogenesis and monocyte homing within collateral arteries. Previous studies have described the histological examination of animal models, which presupposes subsequent analysis to post-mortem artifacts. Our approach visualizes monocyte homing to areas of collateralization in real time sequences, is easy to perform, and investigates the process of arteriogenesis and tumor angiogenesis in vivo.

Monocytes are important mediators of arteriogenesis in the context of peripheral arterial disease. Using a basement membrane-like matrix and intravital microscopy, this protocol investigates monocyte homing and tumor-related angiogenesis after monocyte injection in the femoral artery ligation murine model.

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

The therapeutic goal for peripheral arterial disease and ischemic heart disease is to increase blood flow to ischemic areas caused by hemodynamic ...

医学

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Multiphoton Intravital Imaging for Monitoring Leukocyte Recruitment during Arteriogenesis in a Murine Hindlimb Model

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for analyzing collateral arteries and leukocytes in arteriogenesis is ex vivo (immuno-) histological methodology. However, this technique does not allow the measurement of dynamic processes such as blood flow, shear stress, cell-cell interactions, and particle velocity. This paper presents a protocol to monitor in vivo processes in growing collateral arteries during arteriogenesis utilizing intravital imaging. The method described here is a reliable tool for dynamics measurement and offers a high-contrast analysis with minimal photo-cytotoxicity, provided by multiphoton excitation microscopy. Prior to analyzing growing collateral arteries, arteriogenesis was induced in the adductor muscle of mice by unilateral ligation of the femoral artery.
After the ligation, the preexisting collateral arteries started to grow due to increased shear stress. Twenty-four hours after surgery, the skin and subcutaneous fat above the collateral arteries were removed, constructing a pocket for further analyses. To visualize blood flow and immune cells during in vivo imaging, CD41-fluorescein isothiocyanate (FITC) (platelets) and CD45-phycoerythrin (PE) (leukocytes) antibodies were injected intravenously (i.v.) via a catheter placed in the tail vein of a mouse. This article introduces intravital multiphoton imaging as an alternative or in vivo complementation to the commonly used static ex vivo (immuno-) histological analyses to study processes relevant for arteriogenesis. In summary, this paper describes a novel and dynamic in vivo method to investigate immune cell trafficking, blood flow, and shear stress in a hindlimb model of arteriogenesis, which enhances evaluation possibilities notably.

The recruitment of leukocytes and platelets constitutes an essential component necessary for the effective growth of collateral arteries during arteriogenesis. Multiphoton microscopy is an efficient tool for tracking cell dynamics with high spatio-temporal resolution in vivo and less photo-toxicity to study leukocyte recruitment and extravasation during arteriogenesis.

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

Arteriogenesis strongly depends on leukocyte and platelet recruitment to the perivascular space of growing collateral vessels. The standard approach for ...

<meta charset="utf8"></head><body>I/R損傷時の白血球接着とNET形成における内皮PAR1の役割

Visualization of Neutrophil Extracellular Traps in Mesenteric Venules After Mesenteric Ischemia-Reperfusion Injury via Intravital Microscopy

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric vessels, leading to both local and systemic pathologies with a poor prognosis. Both ischemia and reperfusion trigger a series of cellular and molecular responses, with inflammatory cells serving as key regulators of the pathology. These interactions with the ischemic endothelium are mediated by multiple adhesion receptors. Several animal models have been established to mimic this pathology and investigate the involved molecular pathways. In this study, a microsurgical model of I/R injury is combined with intravital microscopy to visualize leukocyte rolling, adhesion, and neutrophil extracellular trap (NET) formation. This model is applied to transgenic mice deficient in endothelial PAR1 (F2r) to assess the impact of PAR1 on leukocyte rolling and NET formation 1 h after ischemia and immediately following reperfusion. In vivo, Acridine Orange leukocyte staining was employed, and NETs were visualized using a nucleic acid stain. Interestingly, reduced leukocyte adhesion and NET formation were observed in mice lacking the endothelial PAR1 receptor. This model enables the in vivo analysis of key regulators involved in I/R injury.

<meta charset="utf8"></head><body>腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

This protocol presents a method for inducing mesenteric ischemia-reperfusion injury and visualizing neutrophil extracellular traps (NETs) in mesenteric venules using intravital microscopy. Blood flow in the superior mesenteric artery was restricted for 1 h, followed by reperfusion, allowing direct quantification of leukocyte adhesion and NETosis.

腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

Intestinal ischemia-reperfusion (I/R) injury is an acute condition characterized by tissue damage resulting from restricted blood flow to the mesenteric ...

リアルタイムで麻酔したマウスに生体顕微鏡により腸間膜静脈に好中球および単球のイメージング

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生体内ビデオ顕微鏡による組織内好中球腔内クロールを追跡、経内皮移動と走

生きたマウスにおける血管炎症及び血栓形成の間に活性化内皮上に異型血小板、好中球の相互作用のリアルタイムイメージング

マウスの腸間膜静脈内の生体顕微鏡白血球 - 内皮及び血小板 - 白血球の相互作用

IL-1βプロモーター駆動のDsRedレポーターマウスを用いた好中球プライミングの生体内イメージング

以下のための大腿骨のウィンドウチャンバーモデル

単球のホーミングと末梢動脈疾患のマウスモデルにおける腫瘍関連血管新生の生体顕微鏡

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

マウス後肢モデルにおける動脈形成中の白血球動員モニタリングのための多光子生体内イメージング

腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化

腸間膜虚血再灌流障害後の腸間小静脈における好中球細胞外トラップの生体内顕微鏡による可視化