中国の国家自然科学基金 (31770968) と天津研究プログラムのアプリケーション基盤と高度な技術 (17JCZDJC33400) の支援に感謝しております。

1. ヘパリン含有 Starpeg ナノコーティングの作製
<ol><li>
ヘパリン染色コハク酸 (ヘパリン-NHS) の合成
	<ol>
<li>ヘパリンの 0.69 g を量り、2.0 mL の冷たい脱イオン水に溶解します。</li>
		<li>NHS の 0.23 g を量り、0.5 mL の丸底フラスコに冷たい脱イオン水に溶解します。</li>
		<li>EDC の 0.77 g を量り、0.5 mL の丸底フラスコに冷たい脱イオン水に溶解します。</li>
		<li>丸底フラスコの NHS と EDC ソリューションをミックスします。室温で 30 分間室温でベンチに混合液を残します。</li>
		<li>EDC と NHS の過剰を削除する 10 分間 5,031 x gで EDC NHS の混合物を遠心分離機します。</li>
		<li>混合液と 5,031 x gで 10 分間遠心する冷たいエタノール 30 mL を追加します。<ol>
<li>2 回繰り返します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
StarPEG ヘパリン ナノコーティングの準備
	<ol>
<li>丸底フラスコに 1.0 mL の 10% (w/v) starPEG-(NH2)8を追加します。</li>
		<li>同じ丸底フラスコに 10% (w/v) ヘパリン NHS の 0.67 mL を追加します。</li>
		<li>粘度の明確な解を得るために 20 分間の 25 ° c の定温器に starPEG-(NH2)8とヘパリン NHS の混合液を配置します。 注: 蛍光に分類されたヘパリン (FAM ヘパリン) が必要でした、実験の作製手順は同じ星 - ペグ-(NH2)8は 5(6) - を添加した脱イオン水に溶解したことを除いてcarboxyfluorescein N- 染色エステル 0.1% (モル比) starPEG-(NH2)8の。)</li>
	</ol>
</li>
	<li>
フーリエ変換の赤外分光法 (FT-IR) によるヘパリン ペグ ナノコーティングのキャラクタリゼーション
	<ol>
<li>始める前に、アセトンと脱イオン水瑪瑙臼・杵・ ペレット化装置 (直径 13 mm の小さなディスク) をすすいでください。使用前にオーブンでガラス製品を乾燥させます。</li>
		<li>ミックス約 0.1-1% ヘパリン ペグ サンプル KBr の微粉の 200-250 mg。</li>
		<li>めのう乳鉢でヘパリン ペグと KBr の混合物を配置し、2 μ m の直径を持つ小さなペレットに細かく粉砕します。</li>
		<li>ペレット化装置に混合物を転送します。透明ペレットを形成するために 1-2 分のための真空の高圧縮力 (8 T/cm2) を適用します。</li>
		<li>ペレット化デバイスからサンプル ペレットを軽く引いてください。ひび割れが発生しないようにあまりにもハードを引っ張らないように注意してください。</li>
		<li>サンプルの化学構造を決定するフーリエ変換赤外分光にサンプル ペレットを非常に慎重に転送します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
スキャンの電子顕微鏡 (SEM) によるヘパリン ペグ ナノコーティングの内部の多孔質構造の検討
	<ol>
<li>次の手順では、標準の 48 ウェルの細胞培養プレートとピペットを準備します。</li>
		<li>48 ウェル培養プレートのウェルに、ヘパリン PEG 溶液をピペットします。</li>
		<li>24 時間-80 ° C でプレートを固定します。</li>
		<li>Lypophilize 真空環境下で-50 ° C でサンプル (0.1 Pa) 24 時間。</li>
		<li>アルミ スタブの粘着面に試料を分散します。</li>
		<li>金箔サンプルをコートし、内部の多孔質構造を観察するスキャンの電子顕微鏡下で観察。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
原子間力顕微鏡 (AFM) によるヘパリン ペグ ナノコーティング面の検討
	<ol>
<li>ピラニア溶液で石英ガラスをきれい (70% H2SO4, 30% H2O2) 40 分 80 ° C で。</li>
		<li>10 分間トルエン、メタノール 10 分でスライドを超音波照射します。</li>
		<li>真空乾燥によってスライドを乾燥させます。</li>
		<li>3-アミノプロピル-プタデカフルオロテトラヒドロデシルトリエトキシシラン ソリューション (2% トルエン溶液)、振盪たっぷりスライドを洗います。</li>
		<li>超音波照射の 10 分、10 分間トルエン メタノールのスライド</li>
		<li>標準のピペットを使用してスライドの表面に 3% ヘパリン止め釘の解決の場所 100 μ L。</li>
		<li>原子間力顕微鏡下でヘパリン ペグの表面を調べる (50-80 kHz の共振周波数力定数の 0.350 N m 21、先端半径 600 nm)。</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. マウス膵島表面工学ヘパリン ペグ ナノコーティング
<ol><li>
マウス膵島表面被覆ヘパリン ペグ ナノコーティング
	<ol>
<li>コラゲナーゼ消化と histopaque グラデーション浄化以前にゼウス19の報告によってマウスの膵島を抽出します。</li>
		<li>1.5 mL チューブに解剖顕微鏡の下で 200 の小島を手で摘みます。</li>
		<li>500 μ L の PBS を追加すると、島と 503 × gで 1 分間遠心します。</li>
		<li>上澄みを取るそしてヘパリン止め釘の解決の 250 μ L を追加し、10 分ヘパリン止め釘の解決と混ぜて島を許可するように上下にピペットの氷の混合物を保ちます。</li>
		<li>503 × gで 1 分間遠心します。</li>
		<li>上澄みを除去し、500 μ L の PBS を追加します。上下のピペットをよく混ぜます。</li>
		<li>1 分 503 × gで遠心分離し、上澄みを除去し、さらに使用するため島を維持します。マウス島ヘパリン PEG 被覆の検討、FAM ヘパリン ペグ小島塗装手順を次の使用しています。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
マウス島 FAM ヘパリン ペグ ナノコーティングでコーティングの検討
	<ol>
<li>コーティングへ 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 の 1-2 の mL を追加し、非課金細菌培養皿に膵島を転送します。</li>
		<li>倒立蛍光顕微鏡下で FAM ヘパリン ペグ ナノコーティング コーティング島の形態と蛍光信号を観察します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ヘパリン ペグの機能コーティング マウス膵島の非コーティングと比較して
<ol><li>
ヘパリン PEG 被覆マウス島の生存率
	<ol>
<li>ヘパリン PEG 被覆マウス島の 20 手で摘むし、96 ウェル細胞培養プレートの 1 つのウェルに配置します。</li>
		<li>各ウェルの 20 ヘパリン PEG 被覆マウス島で合計 10 の井戸を埋めます。</li>
		<li>Noncoated コントロール島の 20 を手で摘むし、同じ 96 ウェルの細胞培養プレートの 1 つのウェルに配置。</li>
		<li>各ウェルの 20 の noncoated コントロール島で合計 10 井戸を埋めます。</li>
		<li>島を含む 96 ウェル プレートの各ウェルに 10% 牛胎児血清添加 RPMI 1640 200 μ L を入れて、14 日間培養を維持します。</li>
		<li>2 日おきの島文化メディアを交換します。</li>
		<li>ライブ/死んで文化で 14 日間の終わりにキットを染色し、倒立蛍光顕微鏡下で観察の小島を扱います。</li>
		<li>倒立蛍光顕微鏡下で各膵島内の PI+ (赤) のセルをカウントします。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヘパリン ・ ペッグの血行再建被覆マウス島体外
	<ol>
<li>あらかじめ培養プレートを含む実験のすべてのプラスチックを冷たいやピペット ヒントを使用する前に少なくとも 12 時間。</li>
		<li>場所 24 ウェル冷却パッド。氷を 250 μ l 添加 24 ウェル細胞培養プレートの各ウェルに冷たい成長因子減少マトリゲル。少なくとも 30 分のための 4 ° C でコーティングされた 24 ウェル プレートを配置します。</li>
		<li>冷蔵庫の中にマトリックス ソリューションを設定すると、マウスの膵島マイル スヴェン 1 (MS1) 内皮を trypsinize します。<ol>
<li>組織培養用フラスコから文化のすべてのメディアを削除します。5 ml の PBS のフラスコをすすいでください。</li>
			<li>PBS を取り外して、トリプシン-EDTA の 3 mL を加えます。標準のインキュベーターで 3 分の 37 ° C で孵化させなさい。</li>
			<li>セルをデタッチし、5 mL の血清添加培地を追加に、フラスコの底を軽くたたきます。</li>
		</ol>
</li>
		<li>15 mL 遠心管 1,000 x gで 5 分間遠心し、細胞を収集します。</li>
		<li>上清を離陸し、5 mL の PBS を追加します。上下のピペットをよく混ぜます。</li>
		<li>1,000 x gで 5 分遠心し、上清を脱ぐ。</li>
		<li>チューブに血清添加 DMEM メディアを追加し、マトリックスのソリューション コート 24 ウェル プレートの各ウェルに 50,000 細胞を播きます。</li>
		<li>各ウェルに 5 のヘパリン PEG 被覆島または小島 noncoated コントロールを追加します。</li>
		<li>各ウェルに血清添加 DMEM メディアを 500 μ L/ウェルの合計に追加します。</li>
		<li>光学顕微鏡の下で 4 時間および 24 時間培養後のチューブ形成を観察します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ヘパリン PEG 被覆小島のグルコース刺激によるインスリン分泌 注: ナノコーティング マウス膵の機能に影響を与えるかどうかを評価するためにヘパリン PEG 被覆と noncoated 島のグルコース刺激によるインスリン分泌を評価しました。<ol>
<li>30 ヘパリン PEG 被覆島または小島 noncoated コントロール 1 つ 1.5 mL チューブに手で摘みます。コーティングされた小島の 10 管の合計と noncoated 島の各を準備します。</li>
		<li>2 ミリ モル/L ブドウ糖20を添加した生理食塩水 1 mL を追加し、37 ° C 2 時間インキュベートします。 注: 生理的食塩水のレシピ、表 1を参照してください。インキュベーターで孵化中に緩んでチューブのキャップをしてください。</li>
		<li>可能な限りのソリューションを削除します。</li>
		<li>30 分の 37 ° C で 20 ミリ モル/L のグルコースを添加した生理的食塩水の 600 μ L を追加することによって島を刺激します。</li>
		<li>商業インシュリン ELISA を用いた ELISA 定量キット インスリン各管からの上清 200 μ L を収集します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
	<li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Netrin-1+ameliorates+myocardial+infarction-induced+myocardial+injury:+mechanisms+of+action+in+rats+and+diabetic+mice.">Netrin-1 ameliorates myocardial infarction-induced myocardial injury: mechanisms of action in rats and diabetic mice.</a> Hum Gene Ther. 25 (9), 787-797 (2014).</li><li>Ke, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Co-transplantation+of+skin-derived+precursors+and+collagen+sponge+facilitates+diabetic+wound+healing+by+promoting+local+vascular+regeneration.">Co-transplantation of skin-derived precursors and collagen sponge facilitates diabetic wound healing by promoting local vascular regeneration.</a> Cell Physiol Biochem. 37 (5), 1725-1737 (2015).</li><li>Saxon, E., Bertozzi, C. 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L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+bioactive+multilayered+nanocoatings+on+pancreatic+islet+cells:+incorporation+of+alpha1-antitrypsin+into+the+coatings.">Assembly of bioactive multilayered nanocoatings on pancreatic islet cells: incorporation of alpha1-antitrypsin into the coatings.</a> Chem Commun (Camb). 51 (53), 10652-10655 (2015).</li><li>Lou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pancreatic+islet+surface+bioengineering+with+a+heparin-incorporated+starPEG+nanofilm.">Pancreatic islet surface bioengineering with a heparin-incorporated starPEG nanofilm.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 78, 24-31 (2017).</li><li>Orlando, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+strategies+aimed+at+reconstitution+of+the+beta-cell+compartment+in+type+1+diabetes.">Cell replacement strategies aimed at reconstitution of the beta-cell compartment in type 1 diabetes.</a> Diabetes. 63 (5), 1433-1444 (2014).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng Part B Rev. 22 (1), 34-36 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J Diabetes Complications. 29 (5), 737-743 (2015).</li><li>Kizilel, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Encapsulation+of+pancreatic+islets+with+nano-thin+functional+polyethylene+glycol+coatings+for+enhanced+insulin+secretion.">Encapsulation of pancreatic islets with nano-thin functional polyethylene glycol coatings for enhanced insulin secretion.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 2217-2228 (2010).</li><li>Zhi, Z. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nano-scale+encapsulation+enhances+allograft+survival+and+function+of+islets+transplanted+in+a+mouse+model+of+diabetes.">Nano-scale encapsulation enhances allograft survival and function of islets transplanted in a mouse model of diabetes.</a> Diabetologia. 55, 1081-1090 (2012).</li><li>Gattas-Asfura, K. M., Stabler, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-by-layer+deposition+of+antifouling+coatings+on+stainless+steel+via+catechol-amine+reaction.">Layer-by-layer deposition of antifouling coatings on stainless steel via catechol-amine reaction.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 5, 9964-9974 (2013).</li><li>Kollmer, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+function+of+alginate-encapsulated+islets.">Long-term function of alginate-encapsulated islets.</a> Tissue Eng. Part B Rev. 22 (1), 34-46 (2015).</li><li>Yang, H. K., Yoon, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Current+status+of+encapsulated+islet+transplantation.">Current status of encapsulated islet transplantation.</a> J. Diabetes Complicat. 29, 737-747 (2015).</li><li>Zmuda, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+murine+islet+isolation+and+subcapsular+kidney+transplantation.">A method for murine islet isolation and subcapsular kidney transplantation.</a> J. Vis. Exp. (50), e2096 (2011).</li><li>Gey, G. O., Gey, M. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+maintenance+of+human+normal+cells+and+tumor+cells+in+continuous+culture.+I.+Preliminary+report:+Cultivation+of+mesoblastic+tumors+and+normal+tissue+and+notes+on+methods+of+cultivation.">The maintenance of human normal cells and tumor cells in continuous culture. I. Preliminary report: Cultivation of mesoblastic tumors and normal tissue and notes on methods of cultivation.</a> Am. J. Cancer. 27, 45-76 (1936).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-selective+azide+incorporation+into+endogenous+RNase+A+via+a+"chemistry"+approach.">Site-selective azide incorporation into endogenous RNase A via a "chemistry" approach.</a> Org. Biomol. Chem. 11, 353-361 (2013).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anchoring+of+vascular+endothelial+growth+factor+to+surface-immobilized+heparin+on+pancreatic+islets:+implications+for+stimulating+islet+angiogenesis.">Anchoring of vascular endothelial growth factor to surface-immobilized heparin on pancreatic islets: implications for stimulating islet angiogenesis.</a> Tissue Eng. Part A. 16, 961-970 (2010).</li><li>Cabric, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Islet+surface+heparinization+prevents+the+instant+blood-mediated+inflammatory+reaction+in+islet+transplantation.">Islet surface heparinization prevents the instant blood-mediated inflammatory reaction in islet transplantation.</a> Diabetes. 56, 2008-2015 (2007).</li><li>Asif, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heparinization+of+cell+surfaces+with+short+peptide-conjugated+PEG-lipid+regulates+thromboinflammation+in+transplantation+of+human+MSCs+and+hepatocytes.">Heparinization of cell surfaces with short peptide-conjugated PEG-lipid regulates thromboinflammation in transplantation of human MSCs and hepatocytes.</a> Acta Biomater. 35, 194-205 (2016).</li><li>Teramura, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microencapsulation+of+cells,+including+islets,+within+stable+ultra-thin+membrane+of+maleimide-conjugated+PEG-lipid+with+multifunctional+crosslinkers.">Microencapsulation of cells, including islets, within stable ultra-thin membrane of maleimide-conjugated PEG-lipid with multifunctional crosslinkers.</a> Biomaterials. 34 (11), 2683-2893 (2013).</li><li>Zhi, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multilayer+nanoencapsulation:+A+nanomedicine+technology+for+diabetes+research+and+management.">Multilayer nanoencapsulation: A nanomedicine technology for diabetes research and management.</a> Diabetes Res. Clin. Pract. 100, 162-169 (2013).</li></ol>

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この記事での生活のための"簡単-導入するため「アプローチを示す細胞表層工学ナノコーティングのN-グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングと膵島表面膜のアミン グループ。確かに、細胞膜内のアミノ基は非常に反応性とその結果、以前の研究は14 の生理学的条件下で活性化のN- hydroxysuccinimidyl (NHS) エステルの第一アミノ基間の相互作用を報告しています。 ,16,21。さらに、広範な研究は、カプセル化膵島の中にヘパリン、高硫酸化グリコサミノグリカンおよび細胞外のマトリックスの重要なコンポーネントの結合が強化された移植後につながることを報告しています。血行再建術と減らされた IBMIR22,23。ペグの生体適合性とヘパリンの多価の特性を考えた、ナノコーティングの作製中に読み込む最大のヘパリンの 8 武装ペグを使いました。ヘパリン -NHS、その後 -NH2基と反応が膵島細胞膜上で変更されました。ヘパリン法人 PEG によって共有結合形成 (細胞膜) の NH の2と - Hep ペグの NHS の間小島は容易に「コーティングする」を有効にすれば、このように膵の外側の表面にナノ薄層 (ナノコーティング) を形成小島。
現在のアプローチはまた擬似 bioorthogonal 化学 -NHS (のナノコーティング) と -NH2膵島細胞の間に島をマイクロ カプセル化の主要な高分子として PEG を選択以前に公開されたメソッドから別膜が使用されました。膵島細胞の安定性を考慮したコーティング、プラズマなどの複雑な環境では特には血行再建後の移植することが重要であり生存、NHS - と -NH2間の地層より安定したに比べてペグと細胞膜24、静電相互作用9,15,24,25,26またはビオチン間生物学的連結間の疎水性相互作用ストレプトアビジン14。
さらに、膵島と対照をなしても多層蒸着14,16,25, 本手法の拡張膵島取扱い期間で LBL のアプローチに依存しているコーティング方法必要最小限です。膵島のコーティングの期間の処理および非常に短いこれらの要因の両方は、島の生存率は頻繁に既に酵素消化中に破損した ECM による侵害の次膵島分離膵島移植後生存に不可欠です。しかし、現在のアプローチの 1 つの制限は、これを介して外のコーティングの厚さを増やすまたは層堆積の数を減らすことによって制御できる LBL とは異なり Hep ペグ ナノコーティングの厚さを当分の間合わせて調整することはできません、です。
さらに、-NHS と -NH2行われる、現在のアプローチ間の化学反応は細胞の軽度の状態により表面ない工学は膵島、しかしほとんどの細胞療法に限る。さらに、ヘパリンはサイトカイン ・生理活性分子の範囲との対話を知られていることを考えると、Hep ペグ ナノコーティング述べる無制限生物調停の成立の可能性があるオープンなプラットフォームと同様複雑な細胞表層工学のためのインターフェイス。

細胞ベースの治療法の治療効果は、低細胞保持と貧しい人々 の生存1,2によって制限されます。細胞療法の転帰を改善、細胞表層工学酵素操作を介して、するためにペプチド共役、bioorthogonal 化学、生体材料の物理的なカプセル化されて悪用された3,4、 5,6,7,8,9,10。現在のプロトコルは、極薄ヘパリン-株式会社 starPEG (ヘパリン-PEG) ナノコーティングを細胞表面に適用することによって「簡単-導入するため「法を用いた生細胞の表面加工を目指しています。膵島の表面加工が発表されたランゲルハンス島と現在臨床膵島移植の中傷の成果の異種の性質として紹介。
確かに、臨床膵島移植、肝門脈に膵島を直接注入によって実行されます現在、この操作はのみ選択的患者のドナー材料と低治療有効性の不足のため11. アルギン酸の炎症関連線維症の12、化学的不安定性による理想的な未満が従来、アルギン酸がカプセル化膵島と表面改質のための最も一般的に使用される生体材料にされています。 13。さらに、100 に 200 μ m の間の範囲島の本来のサイズと比較して、アルギン酸アイレット マイクロ カプセルが大きくなり、400 と 800 μ m の間で及ぶこれは酸素の生理学的な拡散距離を超えます。等角アイレット カプセル化、すなわち。 はそれから開発され、膵島ボリュームの大幅な変更することなく島をカプセル化します。したがって、ナノの成膜から成るペグ、テトラフルオロ エチレン、シリコン膜や多層ナノコーティング (「--層」[LBL] 技法として知られている) が報告されたが、改良体外アイレット生存14 の結果17,18,, ,,1516LBL は頻繁にアプローチが必要な広範な膵島の生存を危険にさらす可能性があります複数のレイヤーの沈着量の期間を渡す.また、生体膜層のナノと膵島の表面の疎水性相互作用静電または共有結合性の相互作用に依存するナノの不安定性も懸念9,14を発生させます,15,16,22,23,24,25,26。
門脈内の膵島移植の治療成績を妨げる別の要因は、インスタント血液を介した炎症反応 (IBMIR) 血、血小板凝集の結果で移植膵島の直接的接触によるもの凝固、免疫悪影響または望ましくない細胞活性9。これらの問題に対処するため星形ポリエチレン ・ グリコール (starPEG) から成る超薄型ナノコーティングは確立された生体適合性と汎用性膵島ハウジングの材質として準備されました。高硫酸化グリコサミノグリカン、ヘパリンは抗炎症、抗凝固剤のプロパティのプロ血管新生増殖因子22を勧誘することによって血管新生を促進する能力 starPEG ナノコーティングでも設立 23。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>AAJ207798</td><td></td></tr><tr><td>Streptozototin</td><td>Sigma</td><td>S0130</td><td></td></tr><tr><td>Histopaque</td><td>Sigma</td><td>10831</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>31800022</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>16000-044</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin Streptomycin</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>15140</td><td></td></tr><tr><td>Cell Dissociation Solution</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>13150-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>GIBCO, by Life Technologies</td><td>12800017</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8644</td><td></td></tr><tr><td>488 phalloidin</td><td>Sigma</td><td>A12379</td><td></td></tr><tr><td>CFSE</td><td>Sigma</td><td>21888-25mg-F</td><td></td></tr><tr><td>Annexin V/PI apoptosis kit</td><td>Dojindo</td><td>AD10</td><td></td></tr><tr><td>DAPI Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>Collagenase from Clostridium, Type XI</td><td>Sigma</td><td>C7657</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149</td><td></td></tr><tr><td>NHS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56480</td><td></td></tr><tr><td>EDC</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>3449</td><td></td></tr><tr><td>8-armed PEG</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>1685176</td><td></td></tr><tr><td>FAM</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M041100</td><td></td></tr><tr><td>5(6)-carboxyfluorescein N-succinimidyl ester</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21888</td><td></td></tr><tr><td>KBr</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>32036</td><td></td></tr><tr><td>3-aminopropyl-triethoxysilane&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>toluene</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>S-15497-20X</td><td></td></tr><tr><td>Live/dead staining kit</td><td>Biovision, US</td><td>K501</td><td></td></tr><tr><td>BD Matrigel&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt;, basement membrane matrix, growth factor reduced</td><td>BD Bioscience</td><td>354230</td><td></td></tr><tr><td>Sodium chloride, 99.5%</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>105864</td><td></td></tr><tr><td>Potassium chloride, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>991468</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate, 99.7%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>988639</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium chloride hexahydrate, 99%, ACS reagent</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>182158</td><td></td></tr><tr><td>Potassium dihydrogen phosphate, 99%, extra pure</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>128839</td><td></td></tr><tr><td>Magnesium sulfate heptahydrate, 99%, for analysis</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>119370</td><td></td></tr><tr><td>Calcium chloride solution volumetric, 1.0 M CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J&amp;amp;K Scientific Ltd</td><td>21114</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900933</td><td></td></tr><tr><td>Rat/Mouse Insulin ELISA kit</td><td>Millipore-linco</td><td>EZRMI-13K</td><td></td></tr></tbody></table>

surface engineering of pancreatic islets with a heparinized starpeg nanocoating

細胞表層工学は、ホストの免疫の攻撃から注入された細胞を保護します。移植機能を改善するために細胞の風景を変形することがも、移植後の生存。このプロトコルは、極薄ヘパリン-株式会社 starPEG (Hep PEG) ナノコーティングを使用して膵島の表面加工を目指しています。ヘパリン染色コハク酸 (ヘパリン-NHS) 膵島表面工学 Hep ペグ ナノコーティングを生成するためのカルボキシル基を n--(3-dimethylamino propyl) を使用しての改造によって合成されたN'-エチル カルボジイミド塩酸 (EDC) とNヒドロキシスクシンイミド (NHS)。Hep PEG 混合物はアミノ末端 8 武装 starPEG (starPEG-(NH2)8) とヘパリン NHS の架橋によって形成されたし。膵島の表面コーティング、マウスの膵島はコラゲナーゼの消化力と Histopaque を使用してグラデーションの浄化によって分離されました。膵島は、NHS と膵島細胞膜のアミン グループの結合を許可する 10 分間氷冷 Hep PEG 溶液と扱われたし。Hep ペグとナノコーティングは膵島のサイズに最小限の変更とボリュームと Hep ペグと小島のパリン投与群も膵島移植中にインスタントの血液を介した炎症反応を減らすことができます。この「簡単-導入するため"のアプローチ、細胞生存率を損なうことなく生きている細胞の表面加工の穏やかなです。無制限機能生物学的仲介人および生活のため多層表面の結合を可能にするオープンなプラットフォームを提供します、また Hep ペグ ナノコーティングをヘパリンが複数サイトカインに結合親和性を示していることを考えると、細胞表面バイオ エンジニア リング。

ヘパリン ペグ ナノコーティングは starPEG-(NH2)8と EDC と NHS カップリング剤 (図 1) として使用してヘパリンの抱合によって合成されました。FT-IR によるヘパリン ペグ ナノコーティングの化学構造を調べたし、3,300-3,600 cm-1ヘパリン (図 2 の水酸基に対応するヘパリンの特徴的なピークが観察される可能性が図 2のように、赤)。3,300-3,600 cm-1 (図 2 青) でピークの振幅の減少は、starPEG-(NH2)8アミド基とヘパリン カルボニル基と共役を表します。アミドに対応する振幅ピーク 1,650 cm-1のカルボニルの伸縮振動も減少しました、ヘパリンを染色コハク酸のカルボキシル基とアミンの starPEG-(NH2) 十分な反応を示す8. ヘパリン ペグ ナノコーティングの表面構造を原子間力顕微鏡で調べた、ルーらを示し、ナノコーティングされた約 30 nm まで小さな多孔性機能 (黒い斑点) が幅 2 μ m と高さ100 に 200 の間で直径10nm。スキャンの電子顕微鏡検査から得られたデータはまた、生体内で配信中に細胞の生存に適したことを示唆しているヘパリン ・ ペッグ (図 3) の高い相互接続された多孔質の構造を確認します。
マウス単離膵島の表面塗装を調べたし、緑の蛍光性によって示されているナノコーティングの薄層だった小島ボリューム/サイズで明らかに変化を引き起こすことがなく均等に堆積コーティングされた島の表面に図 4に示されるように。コーティングの中には、小島、生存を維持するために氷の上を維持することをお勧めします。同様に、コーティング期間 10 分この場合、また最適化された膵性の保守を実現します。それは、ナノコーティングのよりよい観察のため電子顕微鏡として以前に報告された9,16コート小島の断面を検査するだろうとより適切なデータが生成されますが注目に値する文化で生きている島ではなく固定と埋め込まれた島。
についての生存と機能コーティング島、小島血行再建術との機能のin vitro評価をされています。ヘパリンの有益な特性を考慮した膵島表面にヘパリン化は文化とその生存の膵島を血行再建術を促進できます。我々 は、堅牢な膵島文化 (図 5) で生存をヘパリン PEG 被覆マウス島に展示を観察しました。血管形成を大幅に高度なヘパリン ペグと共培養した膵島内皮細胞 (MS1) からも明らかコーティングした細長い微小血管のような構造とネットワークのような血管構造 (図 6 で示された島).
ナノコーティング プロセスはヘパリン PEG 被覆小島の効果グルコース刺激によるインスリン分泌能力を発生しません。ブドウ糖 (2 ミリ モル/L; の sub-stimulatory レベルを添加した生理食塩水で灌流膵インスリン分泌の低下がみられたすべての治療群で図 7)。小島にグルコース (血糖値 20 mmol/L) の超生理的レベルで刺激されたときインスリン分泌の増加はすべての治療群で観察されました。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2.jpg"> 図 1:膵島表面工学 Hep ペグ ナノコーティングの化学構造。小島塗料は、ヘパリン NHS と細胞膜と星 - ペグ-(NH2)8内第一級アミンと共有結合で架橋によって達成されました。各ヘパリン分子では、NHS グループ各に変更された複数のカルボキシル基のグループを所有しています。NHS 活性化カルボキシル基がフォーム アミド結合、Hep ペグと島のナノコーティングが安定しており、タンパク質の第一アミンと反応します。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig1v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2.jpg"> 図 2:スター - ペグ-(NH2)8ヘパリンで Hep ペグ ナノコーティングの赤外線スペクトルは乾燥状態です。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig2v2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig3.jpg"> 図 3:乾燥状態で Hep ペグの電子顕微鏡画像をスキャンします。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig3large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig4.jpg"> 図 4:ヘパリン ペグの代表的な画像被覆蛍光顕微鏡下で小島。 ヘパリンは、FAM (緑色で表示) と事前ラベルでした。イメージは、100 の島の代表です。スケールバー = 100 μ m.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig4large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig5.jpg"> 図 5:ヘパリン PEG 被覆島展示堅牢なアイレット生存します。Nの手段の mean± 標準エラーとして表示される(A)データ = グループあたり 50 の島。(B)生きている細胞は赤で緑と死んだ細胞で示されていた。スケールバー = 100 μ m の範囲の画像が 50 の島の代表。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig5large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig6.jpg"> 図 6:ヘパリン ペグ ナノコーティング内小島血行再建術が容易になります。ヘパリン PEG 被覆島と noncoated コントロール小島 MS1 細胞のマトリゲル管形成。4、24 h. スケール バーで撮影を行った = 100 μ m.<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig6large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56879/56879fig7.jpg"> 図 7:ヘパリン ペグ ナノコーティングは膵インスリン分泌機能の変化を生じません。ヘパリン-PEG 被覆島と noncoated コントロール島 (30) が 2 ミリ モル/L (白いバー) にさらされたまたは 30 分 20 ミリ モル/L ブドウ糖にインスリン分泌 20 mmol/L (黒いバー) ブドウ糖は、コーティング間で比較した島を制御し、。データは、 nの手段の平均 ± 標準誤差として表示されます = 10。<a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56879/56879fig7large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Surface Engineering of Pancreatic Islets with a Heparinized StarPEG Nanocoating

ヘパリン StarPEG ナノコーティングと膵島の表面加工

このプロトコルを目指して、ナノコーティングのN-グループと膵島のアミン グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングを使用して膵島の表面加工細胞膜。

Cell surface engineering can protect implanted cells from host immune attack. It can also reshape cellular landscape to improve graft function and ...

surface-engineering-pancreatic-islets-with-heparinized-starpeg

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Bioengineering

7.3K ビュー.  Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College. このプロトコルを目指して、ナノコーティングのN-グループと膵島のアミン グループ間の擬似 bioorthogonal 化学を介してヘパリン含有 starPEG ナノコーティングを使用して膵島の表面加工細胞膜。

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Staining Protocols for Human Pancreatic Islets

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and beta mass ranges from 500 to 1500 mg 1-3. With this known heterogeneity, a standard processing and staining procedure was developed so that pancreatic regions were clearly defined and islets characterized using rigorous histopathology and immunolocalization examinations. 
Standardized procedures for processing human pancreas recovered from organ donors are described in part 1 of this series. The pancreas is processed into 3 main regions (head, body, tail) followed by transverse sections. Transverse sections from the pancreas head are further divided, as indicated based on size, and numbered alphabetically to denote subsections. This standardization allows for a complete cross sectional analysis of the head region including the uncinate region which contains islets composed primarily of pancreatic polypeptide cells to the tail region.
The current report comprises part 2 of this series and describes the procedures used for serial sectioning and histopathological characterization of the pancreatic paraffin sections with an emphasis on islet endocrine cells, replication, and T-cell infiltrates. Pathology of pancreatic sections is intended to characterize both exocrine, ductular, and endocrine components. The exocrine compartment is evaluated for the presence of pancreatitis (active or chronic), atrophy, fibrosis, and fat, as well as the duct system, particularly in relationship to the presence of pancreatic intraductal neoplasia4. Islets are evaluated for morphology, size, and density, endocrine cells, inflammation, fibrosis, amyloid, and the presence of replicating or apoptotic cells using H&amp;E and IHC stains. 
The final component described in part 2 is the provision of the stained slides as digitized whole slide images. The digitized slides are organized by case and pancreas region in an online pathology database creating a virtual biobank. Access to this online collection is currently provided to over 200 clinicians and scientists involved in type 1 diabetes research. The online database provides a means for rapid and complete data sharing and for investigators to select blocks for paraffin or frozen serial sections.

This video demonstrates procedures for characterization of human pancreatic islets using hematoxylin and eosin (H&E) and immunohistochemistry (IHC). Pancreatic sections from head, body, and tail regions are stained by both H&amp;E and IHC to determine islet endocrine composition (insulin, glucagon, and pancreatic polypeptide), cell replication (Ki67), and inflammatory infiltrates (H&E, CD3). The uncinate region is localized using IHC for pancreatic polypeptide.

ヒト膵島の染色プロトコル

Estimates of islet area and numbers and endocrine cell composition in the adult human pancreas vary from several hundred thousand to several million and ...

医学

Scaffold-supported Transplantation of Islets in the Epididymal Fat Pad of Diabetic Mice

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy may incur acute whole blood reactions and result in poor islet engraftment. Here, we report a robust protocol for the transplantation of islets at the extrahepatic transplantation site-the epididymal fat pad (EFP)-in a diabetic mouse model. A protocol to isolate and purify islets at high yields from C57BL/6J mice is described, as well as a transplantation method performed by seeding islets onto a decellularized scaffold (DCS) and implanting them at the EFP site in syngeneic C57BL/6J mice rendered diabetic by streptozotocin. The DCS graft containing 500 islets reversed the hyperglycemic condition within 10 days, while the free islets without DCS required at least 30 days. The normoglycemia was maintained for up to 3 months until the graft was explanted. In conclusion, DCS enhanced the engraftment of islets into the extrahepatic site of the EFP, which could easily be retrieved and might provide a reproducible and useful platform for investigating the scaffold materials, as well as other transplantation parameters required for a successful islet engraftment.

This protocol demonstrates murine islet isolation and seeding onto a decellularized scaffold. Scaffold-supported islets were transplanted into the epididymal fat pad of streptozotocin (STZ)-induced diabetic mice. Islets survived at the transplantation site and reversed the hyperglycemic condition.

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

Islet transplantation has been clinically proven to be effective at treating type 1 diabetes. However, the current intrahepatic transplantation strategy ...

生物工学

A Murine Pancreatic Islet Cell-based Screening for Diabetogenic Environmental Chemicals

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to the development of type 2 diabetes mellitus (T2DM). Although the mechanisms for the chemical-induced &#946; cell damage were unclear and likely to be complex, one recurring finding is that these chemicals induce oxidative stress leading to the generation of excessive reactive oxygen species (ROS) which induce damage to the &#946; cell. To identify potential diabetogenic environmental chemicals, we isolated pancreatic islet cells from C57BL/6 mice and cultured islet cells in 96-well cell culture plates; then, the islet cells were dosed with chemicals and the ROS generation was detected by 2',7'-dichlorofluorescein (DCFH-DA) fluorescent dye. Using this method, we found that bisphenol A (BPA), Benzo[a]pyrene (BaP), and polychlorinated biphenyls (PCBs), could induce high levels of ROS, suggesting that they may potentially induce damage in islet cells. This method should be useful for screening diabetogenic xenobiotics. In addition, the cultured islet cells may also be adapted for in vitro analysis of chemical-induced toxicity in pancreatic cells.

Here we present a protocol to isolate mouse pancreatic islet cells for screening the ROS inductions by the xenobiotics in order to identify the potential diabetogenic xenobiotic chemicals.

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

Exposure to certain environmental chemicals in human and animals has been found to cause cellular damage of the pancreatic &#946; cells which will lead to ...

免疫・感染学

Pancreatic Tissue-Derived Extracellular Matrix Bioink for Printing 3D Cell-Laden Pancreatic Tissue Constructs

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary complications. However, islet transplantation still has several limitations such as the low viability of transplanted islets due to poor islet engraftment and hostile environments. In addition, the insulin-producing cells differentiated from human pluripotent stem cells have limited ability to secrete sufficient hormones that can regulate the blood glucose level; therefore, improving the maturation by culturing cells with proper microenvironmental cues is strongly required. In this article, we elucidate protocols for preparing a pancreatic tissue-derived decellularized extracellular matrix (pdECM) bioink to provide a beneficial microenvironment that can increase glucose sensitivity of pancreatic islets, followed by describing the processes for generating 3D pancreatic tissue constructs using a microextrusion-based bioprinting technique.

Decellularized extracellular matrix (dECM) can provide suitable microenvironmental cues to recapitulate the inherent functions of target tissues in an engineered construct. This article elucidates the protocols for the decellularization of pancreatic tissue, evaluation of pancreatic tissue-derived dECM bioink, and generation of 3D pancreatic tissue constructs using a bioprinting technique.

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

The transplantation of pancreatic islets is a promising treatment for patients who suffer from type 1 diabetes accompanied by hypoglycemia and secondary ...

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those obtained with whole pancreas transplantation. The protocols currently used for human islet isolation are under scrutiny because they are based on the enzymatic digestion of the organ, whereby the pancreas is demolished, its connections to the body are lost and islets are irreversibly damaged. Islet damage is characterized by critical factors such as the destruction of the extracellular matrix (ECM), which represents the 3D framework of the islet niche and whose loss is incompatible with islet euphysiology. Researchers are proposing the use of ECM-based scaffolds derived from the mammalian pancreas to address this problem and ultimately improve islet viability, function, and lifespan. Currently available methods to obtain such scaffolds are harsh because they are largely detergent based. Thus, we propose a new, detergent-free method that creates less ECM damage and can preserve critical components of pancreatic ECM. The results show that the newly developed decellularization protocol allowed the achievement of complete DNA clearance while the ECM components were retained. The ECM obtained was tested for cytotoxicity and encapsulated with human pancreatic islets which showed a positive cellular behavior with insulin secretion when stimulated with glucose challenge. Collectively, we propose a new method for the decellularization of the human pancreas without the use of conventional ionic and non-ionic chemical detergents. This protocol and the ECM obtained with it could be of use for both in vitro and in vivo applications.

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix ECM Production

The protocol described in this manuscript explains the steps for the fabrication of a soluble extracellular matrix (ECM) from the human pancreas. The solubilized ECM powder obtained through this protocol may be used for the recapitulation of pancreatic islets&#8217; microenvironment in vitro and, potentially, in vivo settings.

Islet transplantation (ITx) has the potential to become the standard of care in beta cell replacement medicine but its results remain inferior to those ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

生物学

Visualization of Endogenous Mitophagy Complexes In Situ in Human Pancreatic Beta Cells Utilizing Proximity Ligation Assay

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated insulin release. Assessment of mitophagy is challenging and often requires genetic reporters or multiple complementary techniques not easily utilized in tissue samples, such as primary human pancreatic islets. Here we demonstrate a robust approach to visualize and quantify formation of key endogenous mitophagy complexes in primary human pancreatic islets. Utilizing the sensitive proximity ligation assay technique to detect interaction of the mitophagy regulators NRDP1 and USP8, we are able to specifically quantify formation of essential mitophagy complexes in situ. By coupling this approach to counterstaining for the transcription factor PDX1, we can quantify mitophagy complexes, and the factors that can impair mitophagy, specifically within beta cells. The methodology we describe overcomes the need for large quantities of cellular extracts required for other protein-protein interaction studies, such as immunoprecipitation (IP) or mass spectrometry, and is ideal for precious human islet&#160;samples generally not available in sufficient quantities for these approaches. Further, this methodology obviates the need for flow sorting techniques to purify beta cells from a heterogeneous islet population for downstream protein applications. Thus, we describe a valuable protocol for visualization of mitophagy highly compatible for use in heterogeneous and limited cell populations.

This protocol outlines a method for quantitative analysis of mitophagy protein complex formation specifically in beta cells from primary human islet samples. This technique thus allows analysis of mitophagy from limited biological material, which are crucial in precious human pancreatic beta cell samples.

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

Mitophagy is an essential mitochondrial quality control pathway, which is crucial for pancreatic islet beta cell bioenergetics to fuel glucose-stimulated ...

A Simple High Efficiency Protocol for Pancreatic Islet Isolation from Mice

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other important biological functions. The islets primarily consist of five types of hormone-secreting cells: &#945; cells secrete glucagon, &#946; cells secrete insulin, &#948; cells secrete somatostatin, &#949; cells secrete ghrelin, and PP cells secrete pancreatic polypeptide. Sixty to 80% of the cells in the islets are &#946; cells, which are the most important cell population to study insulin secretion. Pancreatic islets are a crucial model system to study ex vivo insulin secretion. Acquiring high quality islets is of great importance for diabetes research. Most islet isolation procedures require technically difficult to access site of collagenase injection, harsh and complex digestion procedures, and multiple density gradient purification steps. This paper features a simple high yield mouse islet isolation method with detailed descriptions and realistic demonstrations, showing the following specific steps: 1) injection of collagenase P at the ampulla of Vater, a small area joining the pancreatic duct and the common bile duct, 2) enzymatic digestion and mechanical separation of the exocrine pancreas, and 3) a single gradient purification step. The advantages of this method are the injection of digestive enzyme using the more accessible ampulla of Vater, more complete digestion using combination of enzymatic and mechanical approaches, and a simpler single gradient purification step. This protocol produces approximately 250&#8212;350 islets per mouse; and islets are suitable for various ex vivo studies. Possible caveats of this procedure are potentially damaged islets due to enzymatic digestion and/or prolonged gradient incubation, all of which can be largely avoided by careful ad justification of incubation time.

This islet isolation protocol described a novel route of collagenase injection to digest the exocrine tissue and a simplified gradient procedure to purify the islets from mice. It involves enzymatic digestion, gradient separation/purification, and islet hand-picking. Successful isolation can yield 250&#8211;350 high quality and fully functional islets per mouse.

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

Pancreatic islets, also called the Islets of Langerhans, are a cluster of endocrine cells which produces hormones for glucose regulation and other ...

Pancreatic Islet Embedding for Paraffin Sections

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a mixed cell population in a structured architecture that impacts function, and human islets are widely variable in cell type composition. Current frequently used methods to study cultured islets include molecular studies performed on whole islets, lumping disparate islet cell types together, or microscopy or molecular studies on dispersed islet cells, disrupting islet architecture. For in vivo islet studies, paraffin-embedded pancreas sectioning is a powerful technique to assess cell-specific outcomes in the native pancreatic environment. Studying post-culture islets by paraffin sectioning would offer several advantages: detection of multiple outcomes on the same islets (potentially even the exact-same islets, using serial sections), cell-type-specific measurements, and maintaining native islet cell-cell and cell-substratum interactions both during experimental exposure and for analysis. However, existing techniques for embedding isolated islets post-culture are inefficient, time consuming, prone to loss of material, and generally produce sections with inadequate islet numbers to be useful for quantifying outcomes. Clinical pathology laboratory cell block preparation facilities are inaccessible and impractical for basic research laboratories. We have developed an improved, simplified bench-top method that generates sections with robust yield and distribution of islets. Fixed islets are resuspended in warm histological agarose gel and pipetted into a flat disc on a standard glass slide, such that the islets are distributed in a plane. After standard dehydration and embedding, multiple (10+) 4 - 5 &#181;m sections can be cut from the same islet block. Using this method, histological&#160;and immunofluorescent analyses can be performed on mouse, rat, and human islets. This is an effective, inexpensive, time-saving approach to assess cell-type-specific, intact-architecture outcomes from cultured islets.

Ex vivo pancreatic islet studies are important for diabetes research. Existing techniques to study cultured islets in their native 3-dimensional architecture are time consuming, inefficient, and infrequently used. This work describes a new, simple, and efficient method for generating high-quality paraffin sections of whole cultured islets.

パラフィン セクションの埋め込み膵島

Experiments using isolated pancreatic islets are important for diabetes research, but islets are expensive and of limited abundance. Islets contain a ...

Isolated Pancreatic Islet Treatment and Apoptosis Measurement

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of fluorescence staining techniques and confocal microscopy to assess cell viability, apoptosis, and &#946;-cell-specific death. Isolated mouse islets were treated with varying concentrations of a cytokine cocktail, including TNF-&#945;, IL-1&#946;, and IFN-&#947;, to mimic immune-mediated apoptosis during the development of type 1 diabetes. The viability of islet cells was evaluated with FDA/PI dual staining, where FDA conversion to fluorescein indicated viable cells, and PI marked membrane-compromised cells. YOPRO-1 and nuclear staining provided additional data on apoptosis, with Annexin-V confirming early apoptotic cells. Quantitative analysis revealed significant increases in apoptosis and cell death rates in cytokine-treated islets. To specifically assess effects on &#946;-cells, Zn2+ selective indicator staining was used to label insulin-producing cells through the zinc association in insulin granules, revealing substantial &#946;-cell loss following treatment of islets with pro-inflammatory cytokines for 24 h. These multi-staining protocols effectively capture and quantify the extent of cytokine-induced damage in islets and can be used to evaluate therapeutics designed to prevent &#946;-cell apoptosis in early type 1 diabetes.

This study utilizes multi-staining fluorescence-based markers of cell death and apoptosis combined with confocal microscopy to assess cytokine-induced apoptosis and &#946;-cell-specific death in pancreatic islets. It reveals spatial and temporal changes in cell death and apoptosis in response to extracellular stimuli.

単離された膵島治療とアポトーシス測定

This study investigates the effect of pro-inflammatory cytokines on pancreatic islets, particularly insulin-producing &#946;-cells, using a combination of ...

ヘパリン StarPEG ナノコーティングと膵島の表面加工

要約

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この動画の章

ヒト膵島の染色プロトコル

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

パラフィンセクションの埋め込み膵島

単離された膵島治療とアポトーシス測定

ヘパリン StarPEG ナノコーティングと膵島の表面加工

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ヒト膵島の染色プロトコル

糖尿病マウスの精巣上体脂肪細胞における膵島支持骨格移植

マウスの膵島細胞ベースの糖尿病誘発環境化学物質のスクリーニング

3D細胞-細胞-膵組織コンストラクトを印刷するための膵組織由来細胞外マトリックスバイオインク

Detergent-Free Decellularization of the Human Pancreas for Soluble Extracellular Matrix (ECM) Production

マウス膵島の単離と細胞内cAMP測定法

近接リゲーションアッセイを利用したヒト膵臓ベータ細胞における内因性ミトファジー複合体の可視化

マウスからの膵島分離のための簡単な高効率プロトコル

パラフィン セクションの埋め込み膵島

単離された膵島治療とアポトーシス測定

パラフィンセクションの埋め込み膵島