この作品は、健康の研究のカナダの協会、自然科学工学研究協議会 (レベル検出グラント)、サヴォイ財団によって支えられました。OC は、レベルから博士フェローシップによって支えられました。

動物保護委員会のラヴァル大学とカナダ評議会は、動物愛護の家畜福祉ガイドラインに従ってすべての実験を行った。
1. 事前準備 (オプション: 1 日を前もって準備)
<ol><li>人工髄液 (アプライド) ソリューション (各ノーマル、ショ糖と復旧ソリューション、1 L;テーブル 1を参照) の 3 種類を準備します。300 ± 10 mOsm25に溶液の浸透圧を調整し、氷点下に近いポイントにアプライド ショ糖をクール (0-4 ° C)。 注: 低ナトリウム切削ソリューション (アプライド ショ糖) の使用は、急性スライス26の表面的な層のニューロンの生存を保持できます。</li>
	<li>赤蛍光体 (例えば、Alexa 594) を含む修正プログラム ソリューションの 0.75 ml と緑の合成カルシウム インジケーター (例えば、オレゴン グリーンこれら 1;テーブル 1を参照)。Biocytin は、(表 1参照) 修正プログラム ソリューションの記録された細胞の形態学的同定をアドホックの記事が必要な場合に。</li>
	<li>280 ± 5 mOsm の解決策と pH 7.35 ± 0.5 の浸透圧を調整します。すべての回で冷蔵庫や氷の上のソリューションを保持します。 注: ダイナミック レンジと調査 Ca2 +イベントの性質は、カルシウム インジケーターの選択を前提する必要があります。</li>
	<li>≈ 2 μ m チップ (3-5 MΩ のピペット抵抗) と刺激ピペット ホウケイ酸シータ ガラス管 (のテーブルを参照からパッチ ピペット ホウケイ酸ガラス管 (材料の表を参照してください) からマイクロ ピペットの引き手を使用して、準備します。材料) 2-5 μ m の先端で。 注: 引き手フィラメント タイプとガラスの特定の種類のテスト結果がランプによって特定の直径と形状のピペットの引き手設定が異なります。</li>
</ol>2. 海馬スライス標本
<ol><li>マウスの麻酔 (P13 20; ひずみとマウスのセックスは対処されて実験的質問によって決まりますが) 1 ml のイソフルレン吸入麻酔室内紙タオルの上に置かれました。動物は麻酔深く動き、遅い呼吸の欠如によって証明されるよう、麻酔室からそれを削除し、ギロチンを使用しての首をはねます。</li>
	<li>鼻に頭蓋の後部からはさみの小さなペアで皮膚を切断することによって頭蓋骨を公開します。前レベルで穴を作るためのミニ骨 rongeurs の小さなペアを使用します。尾側吻側矢状縫合線に沿ってカットするはさみを使用しています。Rongeurs 各半球を覆う頭蓋骨を削除する各頭蓋骨フラップ、エレベーター方向および水平方向の背面を把握します。</li>
	<li>脳が完全に公開されている後は、小さいヘラを使って視神経を弱めます。頭蓋骨から脳を外し、酸素、冷たいアプライド ショ糖を含む継続的にシャーレに入れて (ショ糖濃度は表 1を参照)。<ol>
<li>古いマウスから組織が必要な場合は、脳抽出の前に冷えたアプライド ショ糖の 20 ml シリンジ (25 G) を使用して質の良いスライスを取得する心腔内灌流を実行します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>抽出した動物の脳から海馬スライスを準備します。<ol>
<li>約 2 分氷でいっぱいのシャーレに濾紙片を配置、フィルター紙の上に脳を転送のための脳チルをしましょう。2 つの半球を解剖します。</li>
		<li>Vibratome テーブルの上に (方向、コロナ、横、または水平方向のスライスを取得する実験の目標によって決まります) 切り裂かれた半球を接着し、冷えた酸素アプライド ショ糖で満たされた vibratome トレイに没頭します。Vibratome クーラーを使用してまたは vibratome トレイの周りの氷を置くことによって 300 μ m 約 1 ° C の温度で厚さのスライスを作る。</li>
		<li>37 ° C に加熱酸素アプライド回復を含むバースの海馬 (半球あたり最大 6 スライス) が含まれているスライスを蓄積フラット ペイント ブラシを使用して、</li>
		<li>少なくとも 45 分アプライド回復風呂にスライスを残します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 細胞のホールセルパッチク ランプ記録
<ol><li>目的の下に風呂の場所で海馬スライスの設定 (倍率: 40 倍、開口数: 0.8) 二光子励起レーザ走査顕微鏡の。継続的にお風呂を灌流、酸素アプライド通常 2.5 〜 3 mL/分の速度で 30-32 ° C で加熱します。</li>
	<li>赤外線微分干渉コントラスト (IR DIC) または Dodt SGC 顕微鏡を使用して、そのサイズ、形状、および位置を使用して興味のセルを探します。 注: 対象となるニューロンの人口に応じてトランスジェニック マウス モデルは興味のセルを簡単に検索する使用できます。この場合、この手順は、蛍光光源の使用と代替可能します。</li>
	<li>(例えば、Alexa 594) 赤の蛍光体を含むアプライド標準溶液で刺激ピペットを入力します。</li>
	<li>先端が興味のセルと同じ地域にあるので、スライスの上に (電気刺激装置に接続) 刺激ピペットを設定します。</li>
	<li>修正プログラム ソリューションとパッチ ピペットを充填し、ヘッド ステージに貼り付けて後、興味のセルのすぐ上の先端は、スライスを設定します。</li>
	<li>三方活栓のシリンジの収まるし、プラスチック製のチューブを介してパッチ ピペットに接続します。パッチ ピペットに一定の陽圧を注入 (≈ 0.1 mL) 注射器を使用しています。活栓を「閉じる」位置にしてください。</li>
	<li>増幅器制御ソフトウェア モジュールをアクティブにし、「VC」ボタンをクリックしてして電圧クランプ モードに切り替えます。電気生理学的信号の取得の電気生理学データ集録ソフトウェア (例えばclampex) を開き、それを継続的に監視する必要のある正方形電圧パルス (5 mV、10 ms) を送信して「膜テスト」アイコンをクリックピペット抵抗の変化。</li>
	<li>対象のセルの右上までパッチ ピペットを下げます。作る時に細胞膜との接触、活栓を「開く」の位置に回すことによって、圧力を削除します。 注: 細胞膜との接触が検出されるときピペット抵抗わずかな増加 (≒ 0.2 MΩ) が、セルに小さなくぼみが肯定的な圧力によって引き起こされます。</li>
	<li>ピペット抵抗のソフトウェアによって提供される 1 GΩ に達するまで、コックに装着空の注射器を使用してパッチ ピペットにわずかな否定的な圧力を適用されます。データ集録ソフトウェアの ' 膜テスト ウィンドウでクランプ-60 でセル mV。</li>
	<li>セルを開けて全体セル構成を達成するまで否定的な圧力を適用することを続行します。このセルの状態の検出は (介在ニューロンの種類に応じて 70 500 MΩ に 1 GΩ) からピペット抵抗と ' 膜テスト ウィンドウで大きな静電容量過渡の外観の急激な変化に基づいています。</li>
</ol>4. 二光子励起 Ca2 +イメージング
<ol><li>興奮性のシナプス応答に興味がある場合、GABAAの受容体ブロッカー gabazine (10 μ M) と GABAB受容体拮抗薬 CGP55845 追加 (2 μ M) アプライドお風呂に。</li>
	<li>増幅器制御ソフトウェア モジュールの「CC」ボタンをクリックしてして現在のクランプにパッチを設定および脱分極電流体注射に応答細胞の発火パターンを記録 (0.8 〜 1.0 nA, 1 s)。修正プログラム ソリューションのインジケーターを格納するセルの少なくとも 30 分を待ちます。 注: セルの発火パターンとアクティブなプロパティ使用できます。 セルのサブタイプを識別するために例えば細胞の高速スパイクします。レコード猫 (トラブルシューティングの表 2を参照) を始める前に拡散を安定させるために指標濃度が重要です。</li>
	<li>AP 誘発猫<ol>
<li>画像集録ソフトウェアを使用して画像を取得を開始します。赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。表示される応答を確保するため、AP 誤差逆伝搬効率が大幅低下する gaba 作動性介在ニューロン22で距離をまず、近位樹状突起 (≤ 50 μ m) を選択します。</li>
		<li>画像集録ソフトウェアの「長方形ツール」を使用して、対象となる領域拡大し、を切り替える、「xt" (ライン スキャン) モード。目的の樹状突起の分岐間でスキャンの位置。集録ソフトウェアのレーザー強度コント ローラー、2 光子レーザー ベースライン緑蛍光は光毒性を避けるために、少しだけ目に見える最小の電力レベルで設定します。</li>
		<li>電気生理学データ集録ソフトウェア プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェアで必要な振幅の体細胞電流注入を含む希望の期間の記録試みを作成します。<ol>
<li>画像集録ソフトウェアを使用すると、「記録開始」ボタンをクリックし、、3-10 回 1-2 s. 繰り返し継続的に蛍光画像の取得を取得。光損傷を避けるために単一スキャンの間待機、少なくとも 30 秒。デンドライトの複数のポイントでエネルギーを集録する場合は、順序効果を避けるためにランダムな順序でそれらを取る。</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>シナプス誘発猫<ol>
<li>赤い蛍光性信号を使用して興味の樹状突起を探します。</li>
		<li>興味の樹状突起上のスライスの表面に刺激ピペットを設定します。刺激ピペットは全体構成を脅かさないよう動きを最小限に抑え、所定の位置にゆっくりと下ろします。位置、樹状突起から 10-15 μ m でピペット。</li>
		<li>画像集録ソフトウェアの aspiny の樹状突起でシナプス ミクロ相分離構造の場所を視覚化するに切り替えて、'xt' (ライン スキャン) モードに沿って目的の樹状突起分岐線の位置。</li>
		<li>(電気生理学データ集録ソフトウェア) の [プロトコル] ウィンドウ、画像集録ソフトウェア試用開始後刺激ユニットをトリガー記録試用版を作成します。</li>
		<li>30 を待っている 3-5 回、1-2 s. リピート獲得のために継続的に樹状突起に沿ってスキャンする「記録開始」ボタンをクリックして取得ソフトウェアを使用して光損傷を防ぐためにスキャンの間 s。 注: スキャンの長さは、誘発イベントの速度によって調整することができますが、光損傷を防ぐために最小限に抑える必要があります (トラブルシューティングの表 2を参照)。</li>
		<li>さまざまな条件 (例えば刺激の強度/長さが異なる、薬理学的ブロッカー等の導入) で取り上げられている特定の質問に応じて、4.5.5 手順を繰り返します。</li>
		<li>集録を停止するとき、セルは、健康悪化の兆候を示しています:-45 下脱分極 mV、ベースライン (例えばブレブ、断片化; 参照表 2は樹状突起の形態学的劣化の Ca2 +レベルの増加トラブルシューティング)。</li>
		<li>細胞の形態に関する予備的な情報を入手して刺激ピペットの場所の記録を保持するには、赤のチャンネルにセルのz-スタックを取得します。取得ソフトウェアを使用して 'xyz'モードが含まれているすべてのプロセスとセル全体を画像に上下スタック制限を設定します。1 μ m で 'のステップのサイズを設定し、「記録開始」ボタンを使用してスタック取得を開始します。</li>
		<li>ときZ-スタックの取得が完了したら、ソフトウェアの「最大投射」オプションを使用して、スタックのすべての焦点の計画を重ね合わせるし、、買収の品質を確認します。その後、スライスからパッチ ピペットをゆっくりと上げます。</li>
		<li>アドホックの記事の形態学的同定のためのスライスを修正するには、すぐにフラット ペイント ブラシを使用して風呂からスライスを削除し、アプライドで満たされたシャーレ内の 2 つのフィルター ペーパー間に配置。4% パラホルムアルデヒド (PFA) ソリューション、アプライドに置き換える、4 ° C の部屋や冷蔵庫では、料理を一晩置いておきます。</li>
	</ol>
</li>
</ol>5.ポストアド ホック記録された細胞の形態学的同定のための免疫組織化学
注: PFA の固定 1 泊後スライスに格納できるリン酸バッファー (PB) アジ化ナトリウム (0.5%) と 1 ヶ月。
<ol><li>トリス緩衝生理食塩水液 (TBS) トリトン X-100 (0.3%) とのスライスを入れて、4 洗浄 (5-10 分ごと) を実行します。</li>
	<li>TBS トリトンのスライスを入れて 1 時間 10% ヤギ血清 (NGS) の 0.3%。</li>
	<li>0.3 %tbs トリトンのスライスを入れて 1% により、NGS とストレプトアビジン共役のため蛍光 (例えば、Alexa Fluor 546 共役ストレプトアビジン、1: 200) 一晩培養します。</li>
	<li>4 を洗う時間 TBS で (5-10 分)</li>
	<li>顕微鏡のスライドと共焦点顕微鏡を用いたイメージ スライスをマウントします。完全な細胞再構成をしてZを取得-スタック (ステップ サイズ: 1 μ m) 20 × 対物を使用します。Alexa-546 共役ラベルをイメージング、543 nm レーザーと 515 560 nm 検出フィルターの使用を設定します。</li>
</ol>6. 猫の解析
<ol><li>赤と緑のチャンネルからライン スキャン画像に関心 (ROIs) の地域から蛍光値を抽出し、ノイズを低減する条件ごとに複数の繰り返しの値の平均します。 注: 樹状突起上ライン スキャン取得が実行されると、それは樹枝状ミクロ相分離構造 (2-5 μ m) に対応して可能性があります、複数 Roi からデータを抽出することが可能と Ca2 +シグナル区画の研究。</li>
	<li>各 roi として Ca2 +振幅の変化を表します。 <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56776/56776eq1.jpg"> 注: ここで G はグリーン チャンネルから蛍光値G0はグリーン チャンネルからベースライン蛍光値で前刺激期間中R は赤のチャンネル18から蛍光値です。2 光子励起は非常にローカライズされた重要な背景を生成しません、背景の蛍光性の加減は必要ありません。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Williams, S. R., Mitchell, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+measurement+of+somatic+voltage+clamp+errors+in+central+neurons.">Direct measurement of somatic voltage clamp errors in central neurons.</a> Nat Neurosci. 7, 790-798 (2008).</li><li>Denk, W., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photon+upmanship:+why+multiphoton+imaging+is+more+than+a+gimmick.">Photon upmanship: why multiphoton imaging is more than a gimmick.</a> Neuron. 18, 351-357 (1997).</li><li>Yuste, R., Denk, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+spines+as+basic+functional+units+of+neuronal+integration.">Dendritic spines as basic functional units of neuronal integration.</a> Nature. 375, 682-684 (1995).</li><li>Nimchinsky, E. A., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+Function+of+Dendritic+Spines.">Structure and Function of Dendritic Spines.</a> Annu Rev Physiol. 64, 313-353 (2002).</li><li>Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+calcium+channels+in+single+spines+using+optical+fluctuation+analysis.">Analysis of calcium channels in single spines using optical fluctuation analysis.</a> Nature. 408, 589-593 (2000).</li><li>Mainen, Z. F., Malinow, R., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synaptic+calcium+transients+in+single+spines+indicate+that+NMDA+receptors+are+not+saturated.">Synaptic calcium transients in single spines indicate that NMDA receptors are not saturated.</a> Nature. 399, 151-155 (1999).</li><li>Yasuda, R., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasticity+of+calcium+channels+in+dendritic+spines.">Plasticity of calcium channels in dendritic spines.</a> Nat Neurosci. 6, 948-955 (2003).</li><li>Carter, A. G., Sabatini, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=State-dependent+calcium+signaling+in+dendritic+spines+of+striatal+medium+spiny+neurons.">State-dependent calcium signaling in dendritic spines of striatal medium spiny neurons.</a> Neuron. 44, 483-493 (2004).</li><li>Topolnik, L., Congar, P., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+metabotropicglutamate+receptor-+and+AMPA+receptor-mediated+dendritic+Ca2++signals+by+presynaptic+and+postsynaptic+activity+in+hippocampal+interneurons.">Differential regulation of metabotropicglutamate receptor- and AMPA receptor-mediated dendritic Ca2+ signals by presynaptic and postsynaptic activity in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 25, 990-1001 (2005).</li><li>Topolnik, L., Chamberland, S., Pelletier, J. G., Ran, I., Lacaille, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity-dependent+compartmentalized+regulation+of+dendritic+Ca2++signaling+in+hippocampal+interneurons.">Activity-dependent compartmentalized regulation of dendritic Ca2+ signaling in hippocampal interneurons.</a> J Neurosci. 29, 4658-4663 (2009).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+calcium+nonlinearities+switch+the+direction+of+synaptic+plasticity+in+fast-spiking+interneurons.">Dendritic calcium nonlinearities switch the direction of synaptic plasticity in fast-spiking interneurons.</a> J Neurosci. 34, 3864-3877 (2014).</li><li>Jaffe, D. B., Johnston, D., Lasser-Ross, N., Lisman, J. E., Miyakawa, H., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thespread+of+Na++spikes+determines+the+pattern+of+dendritic+Ca2++entry+into+hippocampal+neurons.">Thespread of Na+ spikes determines the pattern of dendritic Ca2+ entry into hippocampal neurons.</a> Nature. 357, 244-246 (1992).</li><li>Nakamura, T., Barbara, J. G., Nakamura, K., Ross, W. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synergistic+release+of+Ca2++from+IP3-sensitive+stores+evoked+by+synaptic+activation+of+mGluRs+paired+with+backpropagating+action+potentials.">Synergistic release of Ca2+ from IP3-sensitive stores evoked by synaptic activation of mGluRs paired with backpropagating action potentials.</a> Neuron. 24, 727-737 (1999).</li><li>Kovalchuk, Y., Eilers, J., Lisman, J., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptor-mediated+subthreshold+Ca(2+)+signals+in+spines+of+hippocampal+neurons.">NMDA receptor-mediated subthreshold Ca(2+) signals in spines of hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 20, 1791-1799 (2000).</li><li>Goldberg, J. H., Yuste, R., Tamas, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++imaging+of+mouse+neocortical+interneurone+dendrites:+contribution+of+Ca2+-permeable+AMPA+and+NMDA+receptors+to+subthreshold+Ca2++dynamics.">Ca2+ imaging of mouse neocortical interneurone dendrites: contribution of Ca2+-permeable AMPA and NMDA receptors to subthreshold Ca2+ dynamics.</a> J Physiol. 551, 67-78 (2003).</li><li>Goldberg, J. H., Lacefield, C. O., Yuste, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+dendritic+calcium+spikes+in+mouselayer+5+low+threshold+spiking+interneurones:+implications+for+control+of+pyramidal+cell+bursting.">Global dendritic calcium spikes in mouselayer 5 low threshold spiking interneurones: implications for control of pyramidal cell bursting.</a> J Physiol. 558, 465-478 (2004).</li><li>Oertner, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+imaging+of+single+synapses+in+brain+slices.">Functional imaging of single synapses in brain slices.</a> Exp Physiol. 87, 733-736 (2002).</li><li>Yasuda, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+calcium+concentration+dynamics+in+small+neuronal+compartments.">Imaging calcium concentration dynamics in small neuronal compartments.</a> Sci STKE. 219, pl5 (2004).</li><li>Maravall, M., Mainen, Z. F., Sabatini, B. L., Svoboda, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimating+intracellular+calcium+concentrations+and+buffering+without+wavelength+rationing.">Estimating intracellular calcium concentrations and buffering without wavelength rationing.</a> Biophys J. 78, 2655-2667 (2000).</li><li>Camir&#233;, O., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+compartmentalization+and+regulation+of+postsynaptic+CaTs+in+inhibitory+interneurons.">Functional compartmentalization and regulation of postsynaptic CaTs in inhibitory interneurons.</a> Cell Calcium. 52, 339-346 (2012).</li><li>Guet-McCreight, A., Camir&#233;, O., Topolnik, L., Skinner, F. 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C., Topolnik, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dendritic+Signaling+in+Inhibitory+Interneurons:+Local+Tuning+via+Group+I+Metabotropic+Glutamate+Receptors.">Dendritic Signaling in Inhibitory Interneurons: Local Tuning via Group I Metabotropic Glutamate Receptors.</a> Front Physiol. 3, 259 (2012).</li><li>Bourque, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+mechanisms+of+osmosensation+and+systemic+osmoregulation.">Central mechanisms of osmosensation and systemic osmoregulation.</a> Nat RevNeurosci. 9, 519-531 (2008).</li><li>Aghajanian, G. 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T., Sieneart, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multi-photon+laser+scanning+microscopy+using+an+acoustic+optical+deflector.">Multi-photon laser scanning microscopy using an acoustic optical deflector.</a> Biophys J. 83, 2292-2299 (2002).</li></ol>

著者ない競合する金銭的な利益やその他の利害の関係があります。

ここに示すメソッドでは、勉強して樹状 Ca2 +急性脳スライスにおける神経樹状突起におけるシグナル伝達のための 2 光子励起 Ca2 +イメージングとパッチ ・ クランプ電気生理学の組み合わせの使用方法を示します。このメソッドは両方ローカル Ca2 +標高樹枝状のセグメントと細胞の体細胞応答に電気刺激や逆伝搬 AP により誘発されるを監視することができます。樹状?...

ニューロン ネットワーク活動への貢献はそれが受け取るシナプス入力の動的な性質によって決まります。伝統的に、シナプス電流通路の軸索の電気刺激による誘発の体全体セル ホールセル記録するニューロンのシナプスの特性の優勢な方法に依存。ただし、近位に位置するシナプスの唯一の活動は正直このケース1で報告されます。さらに、シナプス固有のメカニズムを評価するためにニューロンのペアから、特定の場所に樹状突起からの録音はそれぞれ関心のシナプスと樹状突起の統合のメカニズムをターゲットに使用されています。画期的シナプスの生理学の分野では、光学的および電気生理学的手法の結婚によって達成されました。2 光子励起レーザ走査型顕微鏡 (2PLSM) Ca2 +イメージングと光遺伝学的ツールとの組み合わせでシナプスで脳スライスで特定の神経接続でのダイナミックな組織の途方もない詳細が明らかに体外とin vivo。
複数の主利点を作った 2PLSM、従来の 1 光子励起顕微鏡2から目立つ: (1) 二光子励起の非線形性質のため、蛍光が焦点のボリュームでのみ生成され、すべて放出される光子を表す有用な信号 (ピンホールのない必要);(2) より長い波長、2PLSM で使用される浸透散乱組織より効率的に;さらに、光子、2 光子励起とバック グラウンド蛍光; あまりにも希薄(3) 生成や毒性また焦点平面に制限されます。したがって、従来の共焦点顕微鏡と比較すると 2 光子システムの高コストは、にもかかわらず、2PLSM 太い生体組織における神経細胞の構造と機能の高解像度の調査のための選択の方法のまま。
散乱体内の 2PLSM の最初のアプリケーションは、樹状突起スパイン3の機能と構造のイメージをだった。Ca2 +イメージングとの組み合わせで 2PLSM として分離された生化学的なコンパートメントで棘関数を明らかにしました。以来、さまざまな神経棘と個々 のシナプス4の間の一対一の対応がある、二光子励起 Ca2 +イメージングすぐになった便利なツールそのまま組織5、個々 のシナプスの活動報告 6,7,8。さらに、2PLSM ベースの Ca2 +イメージングがうまく使われた単一カルシウム チャネルおよび組み込みとシナプスのコンダクタンスの非線形相互作用の活動を監視するし、状態とアクティビティに依存を評価するにはCa2 +シグナル神経樹状突起5,6,7,8,9,10,11の規則。
ユビキタス細胞内二次メッセンジャーであり、その細胞内の時空間的構成イオンの調節するシナプス強度の変化からの生理学的反応の方向を決定するカルシウム チャネル、デンドライトと背骨の成長としてなく、細胞死、生存。複数経路の活性化を介して樹状 Ca2 +上昇が発生します。活動電位 (Ap)、樹状突起を逆伝搬は、電位依存性カルシウム チャネル12を開き、樹状突起と棘13で比較的大域的な Ca2 +トランジェント (猫) を生成します。シナプス伝達はシナプス後 Ca2 +活性化に関連付けられて-透水性受容体 (NMDA、Ca2 +-透水性 AMPA とカイニン酸)、6、14,15猫シナプスのトリガーします。最後に、特定の条件11,12,13,16の下で樹状突起で超直線性 Ca2 +イベントを生成できます。
パッチ ・ クランプ記録との組み合わせで二光子励起 Ca2 +イメージングを採用しています合成 Ca2 +-通常は全細胞記録中にパッチ電極経由で配信される機密の蛍光インジケーター.Ca2 +動態の定量化のための標準的な方法は、デュアル表示法17,18に基づいています。よく分離発光スペクトルと 2 つの同時を使用して (例えば、赤い Ca2 +の組み合わせ-緑の Ca2 +インジケーター オレゴン グリーンこれら 1、蛍光色 4 などと区別しない染料) に比べていくつかの利点があり、単一指示薬法。最初に、Ca2 +-に依存しない染料を使用、Ca2 +イメージングを実行する (樹枝状の枝、棘) 興味の小さい構造を検索します。第二に、緑と赤の蛍光 (ΔG/R) の変化比が大きく変動する [Ca2 +]017ベースライン蛍光の変化に敏感である [Ca2 +]、メジャーとして計算されます。,18します。 さらに、蛍光変化は絶対 Ca 2 +濃度19面でキャリブレーションできます。
急性スライスで二光子励起 Ca2 +イメージング実験を実行する場合の一般的な心配は細胞の健康と高レーザー出力の通常使用による画像取得の安定性。さらに、Ca2 +イメージング実験である摂動法と細胞内 Ca2 +動態の実質的な過大評価懸念 Ca2 +インジケーターとして高度なモバイル外因性 Ca2 +という事実のためにバッファー。したがって、Ca2 +インジケーターとその濃度の選択は、神経型、猫の予想される振幅と実験の質問によって異なります。
我々 は樹状突起における gaba 作動性介在ニューロン9,10、11,20,21 Ca2 +変動の調査の 2 光子励起 Ca2 +イメージング法を適応,22. 抑制介在ショーケース多種多様な錐体細胞20のそれらとは異なる機能性の Ca2 +メカニズムの初期 Ca2 +イメージング研究の大部分は、主ニューロンで行われた中、,23,24. これらの介在ニューロン固有のメカニズム (例えばCa2 +透過性 AMPA 受容体) は、細胞活性の調節に特定の役割を果たすことがあります。二光子励起 Ca2 +イメージングでこれらの細胞の樹状突起が薄く直径樹状突起と棘の欠如から、追加の課題を提示樹状 Ca2 +シグナル介在ニューロンは詳しい調査のための魅力的なターゲットが、特に内因性 Ca2 +結合能力が高い。私たち研究の海馬介在の研究の焦点、次のプロトコル間異なる神経細胞の集団に適用したこれらの課題に対処する適応
このプロトコルは、2 つの外部の非 descanned 探知機 (NDDs)、電気光学変調器 (EOM) とグラデーション コントラスト (SGC) をスキャン Dodt を装備され、光学テーブルにインストールされて商業共焦点 2 光子顕微鏡、実行されました。顕微鏡 800 モード同期チタンサファイアレーザー多光子と結合されていました (> 3 W、140 の fs パルス、80 Hz の繰り返し率) の nm。イメージング システムは、温度制御、2 つのマニピュレーターを持つ翻訳プラットフォーム、コンピューター制御電極アンプ、デジタイザー、刺激と灌流チェンバを含む標準的な電気生理学のリグが装備されていた単位、およびデータ集録ソフトウェア。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="608">
	<tbody>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Animal Strain: Mouse CD1&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Charles River</td>
			<td style="width:159px;">022</td>
			<td style="width:63px;"></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Isoflurane</td>
			<td style="width:148px;">AbbVie Corporation</td>
			<td>0B506-099</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">CGP 55845 hydrochloride&#160;</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab120337</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Calcium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>C4901</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">D-(+)-Glucose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8270</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">HEPES</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H3375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>M8266</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Magnesium sulfate heptahydrate</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>230391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Paraformaldehyde powder, 95%</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>158127</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P3911</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Potassium gluconate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1847</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium azide&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S2002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium bicarbonate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S8875</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium chloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S5886</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sucrose&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9378</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Triton X-100&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T9284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma base&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Trizma hydrochloride&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>T3253</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Sodium phosphate dibasic dihydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>71643</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Sodium phosphate monobasic 
			monohydrate&#160;</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>S9638</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">Biocytin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:159px;">B4261</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Alexa Fluor 594 Hydrazide</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td style="width:159px;">A10438</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;">SR95531 (Gabazine)&#160;</td>
			<td style="width:148px;">Abcam</td>
			<td style="width:159px;">ab120042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Adenosine triphosphate (ATP)-Tris</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9062</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="45">
			<td height="45" style="height:45px;width:239px;"> 
			Guanosine (GTP)-Na+</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>G8877</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Oregon Green BAPTA-1</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>O6812</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Phosphocreatine di(tris) salt</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P1937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Streptavidin-conjugated Alexa-546</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>S11225</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Patch Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>World Precision Instruments</td>
			<td>1B100F-4</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			Theta Borosilicate Glass Capillaries</td>
			<td>Sutter Instrument</td>
			<td>BT-150-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			P-97 Flaming/Brown Micropipette puller</td>
			<td style="width:148px;">Sutter Instrument</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			TCS SP5 Confocal Multiphoton Microscope</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			Chameleon Ultra II Ti:Sapphire multiphoton laser&#160;</td>
			<td>Coherent</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">LAS AF Imaging Acquisition Software</td>
			<td>Leica Microsystems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Temperature Controller TC-324B</td>
			<td style="width:148px;">Warner Instruments</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:239px;"> 
			MultiClamp 700B Amplifier</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Digidata 1440A Digitizer</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Confocal Translator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Micromanipulator</td>
			<td style="width:148px;">Siskiyou</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			pClamp Data Acquisition Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:239px;"> 
			A365 Constant Current Stimulus Isolator</td>
			<td style="width:148px;">World Precision Instruments</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;"> 
			Vibraplane Optical Table</td>
			<td style="width:148px;">Kinetic Systems</td>
			<td style="width:159px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

two-photon calcium imaging in neuronal dendrites in brain slices

カルシウム (Ca2 +) 画像は、神経樹状突起における細胞内 Ca2 +シグナルの時空間ダイナミクスを調べるための強力なツールです。Ca2 +変動は様々 な膜と細胞内メカニズムを介して発生するでき、樹状の興奮性のシナプス可塑性の誘導と制御に重要な役割を果たします。したがって、樹状突起の分岐で Ca2 +シグナルの種類を記録する機能は樹状突起が情報を統合する方法を研究するグループの貴重です。2 光子顕微鏡の出現は、症状や光散乱などの生体の画像に固有の問題を解くことによって、このような研究を大幅に簡略化は。また、2 光子 Ca2 +イメージングと従来の電気生理学的手法の組み合わせによるローカル Ca2 +変動録音と並行して神経細胞の樹状突起でのシナプスを調査することが可能です。相馬。ここでは、gaba 作動性抑制性介在神経細胞の樹状突起にローカル Ca2 +トランジェント (猫) のダイナミクスを研究するこのメソッドを使用する方法について述べる。メソッドは、樹状 Ca2 +急性脳スライスに異なる神経型シグナルの勉強にも適用できます。

ここで提示されたプロトコルを使用して、体の電流注入によると海馬の CA1 野オリエンス/alveus 介在ニューロンの樹状突起に電気刺激による誘発猫を得られます。複数のポイントで近位樹状突起全体エネルギーを培ってニューロンは、特定のパッチの形状と位置に基づく後で相馬 (図 1 a) から距離が与えられます。相馬の増加 (減少の AP 振幅また?...

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Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

two-photon-calcium-imaging-in-neuronal-dendrites-in-brain-slices

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

10.6K ビュー.  Université Laval. 全細胞のホールセルパッチク ランプ記録と急性脳スライスにおける神経樹状突起における Ca2 +過渡現象を記録する 2 光子イメージングを組み合わせた手法を提案します。

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Imaging Calcium Responses in GFP-tagged Neurons of Hypothalamic Mouse Brain Slices

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the precise molecular steps as well as the activity of specific neurons in multi-functional nuclei of brain areas such as the hypothalamus remain. This problem includes identification of the molecular components involved in the regulation of various neurohormone signal transduction cascades. Elevations of intracellular Ca2+ play an important role in regulating the sensitivity of neurons, both at the level of signal transduction and at synaptic sites.
New tools have emerged to help identify neurons in the myriad of brain neurons by expressing green fluorescent protein (GFP) under the control of a particular promoter. To monitor both spatially and temporally stimulus-induced Ca2+ responses in GFP-tagged neurons, a non-green fluorescent Ca2+ indicator dye needs to be used. In addition, confocal microscopy is a favorite method of imaging individual neurons in tissue slices due to its ability to visualize neurons in distinct planes of depth within the tissue and to limit out-of-focus fluorescence. The ratiometric Ca2+ indicator fura-2 has been used in combination with GFP-tagged neurons1. However, the dye is excited by ultraviolet (UV) light. The cost of the laser and the limited optical penetration depth of UV light hindered its use in many laboratories. Moreover, GFP fluorescence may interfere with the fura-2 signals2. Therefore, we decided to use a red fluorescent Ca2+ indicator dye. The huge Stokes shift of fura-red permits multicolor analysis of the red fluorescence in combination with GFP using a single excitation wavelength. We had previously good results using fura-red in combination with GFP-tagged olfactory neurons3. The protocols for olfactory tissue slices seemed to work equally well in hypothalamic neurons4. Fura-red based Ca2+ imaging was also successfully combined with GFP-tagged pancreatic &beta;-cells and GFP-tagged receptors expressed in HEK cells5,6. A little quirk of fura-red is that its fluorescence intensity at 650 nm decreases once the indicator binds calcium7. Therefore, the fluorescence of resting neurons with low Ca2+ concentration has relatively high intensity. It should be noted, that other red Ca2+-indicator dyes exist or are currently being developed, that might give better or improved results in different neurons and brain areas.

In this protocol, we update recent progress in imaging Ca2+ signals of GFP-tagged neurons in brain tissue slices using a red fluorescent Ca2+ indicator dye.

視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

Despite an enormous increase in our knowledge about the mechanisms underlying the encoding of information in the brain, a central question concerning the ...

神経科学

Dual Electrophysiological Recordings of Synaptically-evoked Astroglial and Neuronal Responses in Acute Hippocampal Slices

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs through activation of their ion channels and neurotransmitter receptors, and process information in part through activity-dependent release of gliotransmitters. Furthermore, astrocytes constitute the main uptake system for glutamate, contribute to potassium spatial buffering, as well as to GABA clearance. These cells therefore constantly monitor synaptic activity, and are thereby sensitive indicators for alterations in synaptically-released glutamate, GABA and extracellular potassium levels. Additionally, alterations in astroglial uptake activity or buffering capacity can have severe effects on neuronal functions, and might be overlooked when characterizing physiopathological situations or knockout mice. Dual recording of neuronal and astroglial activities is therefore an important method to study alterations in synaptic strength associated to concomitant changes in astroglial uptake and buffering capacities. Here we describe how to prepare hippocampal slices, how to identify stratum radiatum astrocytes, and how to record simultaneously neuronal and astroglial electrophysiological responses. Furthermore, we describe how to isolate pharmacologically the synaptically-evoked astroglial currents.

The preparation of acute brain slices from isolated hippocampi, as well as the simultaneous electrophysiological recordings of astrocytes and neurons in stratum radiatum during stimulation of schaffer collaterals is described. The pharmacological isolation of astroglial potassium and glutamate transporter currents is demonstrated.

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

Astrocytes form together with neurons tripartite synapses, where they integrate and modulate neuronal activity. Indeed, astrocytes sense neuronal inputs ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

Two-photon Imaging of Cellular Dynamics in the Mouse Spinal Cord

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for live-cell imaging in the murine spinal cord. This technique is uniquely suited to analyze neural precursor cell (NPC) dynamics following transplantation into spinal cords undergoing neuroinflammatory demyelinating disorders. NPCs migrate to sites of axonal damage, proliferate, differentiate into oligodendrocytes, and participate in direct remyelination. NPCs are thereby a promising therapeutic treatment to ameliorate chronic demyelinating diseases. Because transplanted NPCs migrate to the damaged areas on the ventral side of the spinal cord, traditional intravital 2P imaging is impossible, and only information on static interactions was previously available using histochemical staining approaches. Although this method was generated to image transplanted NPCs in the ventral spinal cord, it can be applied to numerous studies of transplanted and endogenous cells throughout the entire spinal cord. In this article, we demonstrate the preparation and imaging of a spinal cord with enhanced yellow fluorescent protein-expressing axons and enhanced green fluorescent protein-expressing transplanted NPCs.

A new ex vivo preparation for imaging the mouse spinal cord. This protocol allows for two-photon imaging of live cellular interactions throughout the spinal cord.

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

Two-photon (2P) microscopy is utilized to reveal cellular dynamics and interactions deep within living, intact tissues. Here, we present a method for ...

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new method of Ca2+-imaging using the bioluminescent reporter GFP-aequorin (GA) has been developed. This new technique relies on the fusion of the GFP and aequorin genes, producing a molecule capable of binding calcium and&#160;&#8212; with the addition of its cofactor coelenterazine &#8212; emitting bright light that can be monitored through a photon collector. Transgenic lines carrying the GFP-aequorin gene have been generated for both mice and Drosophila. In Drosophila, the GFP-aequorin gene has been placed under the control of the GAL4/UAS binary expression system allowing for targeted expression and imaging within the brain. This method has subsequently been shown to be capable of detecting both inward Ca2+-transients and Ca2+-released from inner stores. Most importantly it allows for a greater duration in continuous recording, imaging at greater depths within the brain, and recording at high temporal resolutions (up to 8.3 msec). Here we present the basic method for using bioluminescent imaging to record and analyze Ca2+-activity within the mushroom bodies, a structure central to learning and memory in the fly brain.

In Vivo Functional Brain Imaging Approach Based on Bioluminescent Calcium Indicator GFP-aequorin

Here we present a novel Ca2+-imaging approach using a bioluminescent reporter. This approach uses a fused construct GFP-aequorin which binds to Ca2+ and emits light, eliminating the need for light excitation. Significantly this method permits long continuous imaging, access to deep brain structures and high temporal resolution.

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

Functional in vivo imaging has become a powerful approach to study the function and physiology of brain cells and structures of interest. Recently a new ...

Ablation of a Neuronal Population Using a Two-photon Laser and Its Assessment Using Calcium Imaging and Behavioral Recording in Zebrafish Larvae

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ablation of neurons is an effective method for this purpose when neurons are selectively labeled with fluorescent probes. In the present study, protocols for laser ablating a subpopulation of neurons using a two-photon microscope and testing of its functional and behavioral consequences are described. In this study, prey capture behavior in zebrafish larvae is used as a study model. The pretecto-hypothalamic circuit is known to underlie this visually-driven prey catching behavior. Zebrafish pretectum were laser-ablated, and neuronal activity in the inferior lobe of the hypothalamus (ILH; the target of the pretectal projection) was examined. Prey capture behavior after pretectal ablation was also tested.

Here, we present a protocol to ablate a genetically labeled subpopulation of neurons by a two-photon laser from Zebrafish larvae.

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

To identify the role of a subpopulation of neurons in behavior, it is essential to test the consequences of blocking its activity in living animals. Laser ...

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging methods exist for examining the brain tissue of live newborn mammals. Herein we summarize a protocol for imaging individual cortical neurons in living neonatal mice. This protocol includes the following two methodologies: (1) the Supernova system for sparse and bright labeling of cortical neurons in the developing brain, and (2) a surgical procedure for the fragile neonatal skull. This protocol allows the observation of temporal changes of individual cortical neurites during neonatal stages with a high signal-to-noise ratio. Labeled cell-specific gene silencing and knockout can also be achieved by combining the Supernova with RNA interference and CRISPR/Cas9 gene editing systems. This protocol can, thus, be used for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and changes in neuronal dynamics in disease models.

In Vivo Two-photon Imaging of Cortical Neurons in Neonatal Mice

We present an in vivo two-photon imaging protocol for imaging the cerebral cortex of neonatal mice. This method is suitable for analyzing the developmental dynamics of cortical neurons, the molecular mechanisms that control the neuronal dynamics, and the changes in neuronal dynamics in disease models.

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

Two-photon imaging is a powerful tool for the in vivo analysis of neuronal circuits in the mammalian brain. However, a limited number of in vivo imaging ...

Two-photon Imaging of Microglial Processes' Attraction Toward ATP or Serotonin in Acute Brain Slices

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of homeostasis, undergo rapid morphological changes. For example, a laser lesion induces in a few minutes an oriented growth of microglial processes, also called &#34;directional motility&#34;, toward the site of injury. A similar effect can be obtained by delivering locally ATP or serotonin (5-hydroxytryptamine [5-HT]). In this article, we describe a protocol to induce a directional growth of microglial processes toward a local application of ATP or 5-HT in acute brain slices of young and adult mice and to image this attraction over time by multiphoton microscopy. A simple method of quantification with free and open-source image analysis software is proposed. A challenge that still characterizes acute brain slices is the limited time, decreasing with age, during which the cells remain in a physiological state. This protocol, thus, highlights some technical improvements (medium, air-liquid interface chamber, imaging chamber with a double perfusion) aimed at optimizing the viability of microglial cells over several hours, especially in slices from adult mice.

Microglia, the resident immune cells of the brain, respond quickly with morphological changes to modifications of their environment. This protocol describes how to use two-photon microscopy to study the attraction of microglial processes toward serotonin or ATP in acute brain slices of mice.

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

Microglial cells are resident innate immune cells of the brain that constantly scan their environment with their long processes and, upon disruption of ...

Transpupillary Two-Photon In Vivo Imaging of the Mouse Retina

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent and cause visual impairment and blindness. Understanding how such diseases progress is critical to formulating new treatments. In vivo&#160;microscopy in animal models of disease is a powerful tool for understanding neurodegeneration and has led to important progress towards treatments of conditions ranging from Alzheimer&#39;s disease to stroke. Given that the retina is the only central nervous system structure inherently accessible by optical approaches, it naturally lends itself towards in vivo imaging. However, the native optics of the lens and cornea present some challenges for effective imaging access.
This protocol outlines methods for in vivo two-photon imaging of cellular cohorts and structures in the mouse retina at cellular resolution, applicable for both acute- and chronic-duration imaging experiments. It presents examples of retinal ganglion cell (RGC), amacrine cell, microglial, and vascular imaging using a suite of labeling techniques including adeno-associated virus (AAV) vectors, transgenic mice, and inorganic dyes. Importantly, these techniques extend to all cell types of the retina, and suggested methods for accessing other cellular populations of interest are described. Also detailed are example strategies for manual image postprocessing for display and quantification. These techniques are directly applicable to studies of retinal function in health and disease.

In vivo imaging is a powerful tool for the study of biology in health and disease. This protocol describes transpupillary imaging of the mouse retina with a standard two-photon microscope. It also demonstrates different in vivoimaging methods to fluorescently label multiple cellular cohorts of the retina.

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

The retina transforms light signals from the environment into electrical signals that are propagated to the brain. Diseases of the retina are prevalent ...

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

要約

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視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウムイメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウム イメージング

要約

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視床下部マウス脳スライスのGFPタグニューロンにおけるイメージングカルシウム応答

急性海馬スライスにおけるシナプス誘発アストログリアとニューロン活動の二重の電気生理学的記録

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

Cの生体内神経カルシウムイメージングでエレガンス

マウス脊髄における細胞ダイナミクスの二光子イメージング

生物発光カルシウムインジケーター、GFPエクオリンに基づいて生体内脳機能イメージングのアプローチで

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウム イメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション

生体内で新生仔マウスの大脳皮質ニューロンの 2 光子イメージング

ATP または急性脳スライスにおけるセロトニンに対するミクログリアのプロセスの魅力の二光子励起イメージング

経瞳孔二光子マウス網膜のin vivoイメージング

脳スライスにおける神経樹状突起における 2 光子カルシウムイメージング

二光子励起レーザーとゼブラフィッシュ幼虫におけるカルシウムイメージング法と行動記録を用いた評価を用いたニューロン集団のアブレーション