Name: localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization
Uploaded: 2017-07-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 30 s
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この研究は、中国国立自然科学財団（No.31472037）からの助成金によって支えられている。この記事の商号または商用製品についての言及は、特定の情報を提供することのみを目的としており、推薦を意味するものではありません。

注：RNA分解を制限するために、湿式オートクレーブ蒸留水（121℃で60分間）および湿式オートクレーブ材料を使用して溶液を調製します。 RNA ISHアンチセンスプローブおよびセンスプローブの調製<ol><li> 標的遺伝子増幅および精製 <ol><li>断片の両端にアデニンを付加Taq DNAポリメラーゼとLmigOR1の完全長cDNAを含むプラスミドから：まず、L. migratoria OR1（JQ766965 LmigOR1、GenBankの）の387 bpの二本鎖断片を生成します。 <ol><li> 50μLの2x反応混合物、4μLのセンスおよびアンチセンスプライマー（ 表1 ）、1μLのプラスミドテンプレート、および41μLのRNaseフリーH 2 Oを含む100μLの最終反応容量を使用します。以下のPCRプロトコル：94℃で5分間、続いて94℃で30秒間、55℃で30秒間および72℃で1分間の30サイクル続いて72℃で10分間インキュベートした。 </li><li>これらのステップを繰り返して、 LmigOR2 （GenBank：JQ766966）の1,303bp二本鎖フラグメントおよびLmigorco （GenBank：JN989549）の1,251bp二本鎖フラグメントを作製する 。これらの実験で使用したプライマーを表1に示す 。 </li><li> 1.2％アガロースゲル上で1×Tris-アセテート-EDTA緩衝液中でPCR産物を泳動し、エチジウムブロマイド染色を用いて視覚化する。 </li></ol></li><li>これらのPCR産物をゲル抽出キットを用いて抽出する。 <ol><li>電気泳動後、ゲルからDNAバンドを切り出し、ゲルスライスを1.5mLチューブに入れる。次に、0.1 gのゲルスライスあたり100μLの結合バッファー（Buffer PN）を添加する。ボルテックスし、ゲルスライスが完全に溶解するまで50℃でインキュベートする。 </li><li>コレクションチューブにCA2吸着カラムを挿入し、500μLの平衡バッファー（Buffer BL）を添加する。これにより、シリカ膜の吸収能力およ​​び安定性が改善される。セントリ12,400×gで1分間フュージします。 </li><li>溶解したゲル混合物を吸着カラムアセンブリに移し、室温で2分間インキュベートする。次に、チューブを12,400 xgで1分間遠心します。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。 </li><li> 600μLの洗浄液（エタノール添加、Buffer PW）を2回加える。 12,400×gで1分間遠心分離する。フロースルーを捨て、吸着カラムをコレクションチューブに再び挿入します。 </li><li>回収チューブを空にし、カラムアセンブリを12,400 xgで2分間遠心分離して、残留エタノールを蒸発させます。 </li><li>慎重に、吸着カラムを清潔な1.5 mL遠心チューブに移す。ペレットを5〜10分間空気乾燥させ、ヌクレアーゼフリー水の適切な容量（ 例えば、 30μL）でDNAを再溶解する。 </li><li> RTで2分間インキュベートする。 12,400×gで2分間遠心分離する。吸着カラムを捨て、DNAを4℃または-20℃で保存します。 </li></ol></li></ol></li><li> 組換えプラスミドを構築する <ol><li>個別LmigOR1、LmigOR2の1303 bp断片及びT7（上流）及びT4 DNAリガーゼを用いて挿入されたDNAに隣接するSP6（下流）RNAポリメラーゼのためのプロモーターを含有するTベクターへLmigORcoの1,251 bp断片の387 bp断片を連結。以下の10μLの反応液を調製する：2×ライゲーションバッファー5μL、Tベクター1μL、挿入遺伝子DNA3μL（〜100ng）およびT4 DNAリガーゼ1μLを加え、4℃でO / Nインキュベートする。 </li><li> LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を、滅菌1.5mLチューブ中の50μLのコンピテントエシェリヒア・コリ DH5α細胞に別々に含む各組換えプラスミド5μLを加える。 <ol><li>静かに混合し、30分間氷中にチューブを入れ、42℃で90秒間インキュベートする。℃。それらを3分間氷の中に戻す。 </li><li>すべてのチューブにアンピシリンなしルリア-ベルターニ（LB）液体培地450μLを添加し、 大腸菌 DH5αを復元するために、37℃で1時間、150rpmで振とう機でそれらをインキュベートします。 </li><li> 50μg/ mLアンピシリン、24μg/ mLイソプロピルβ-D-1-チオガラクトピラノシド（IPTG）、および40μg/ mL 5-ブロモ-4を含むLB固体基質プレートに接種するために、各形質転換体の100μLアリコートを取り、 - クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド（X-gal）である。 </li><li>これらのプレートを一定のインキュベーター内で37℃で18時間インキュベートする。青 - 白スクリーニング法を用いて標的組換えプラスミドをスクリーニングする。サンガー配列決定を用いて標的組換えプラスミドを配列決定し、3つのOR遺伝子の挿入方向を同定する。 </li></ol></li></ol></li><li> 制限エンドヌクレアーゼを選択して組換えプラスミドを線状化する <ol><li>制限エンドヌクレアーゼの使用ベクターは、ベクターの複数のクローニング部位を消化するだけでなく、挿入DNAを切断しない。この実験では、3つの遺伝子すべてが、ベクターの方向に対応する方向でTベクターに挿入される。 </li><li>アンチセンスプローブを生成するためにLmigOR1の387 bp断片、LmigOR2の1303 bp断片とLmigORcoの1,251 bpの断片を含む組換えプラスミドを線形化するためのNco I制限エンドヌクレアーゼを使用します。 Spe I制限エンドヌクレアーゼを用いてセンスプローブを作製する。 注：挿入方向がベクターの挿入方向と一致する場合、T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。そうでない場合、挿入方向がtに対応しない場合SP6の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、T7 RNAポリメラーゼを用いてアンチセンスプローブを調製する。 T7の末端からのユニークな制限部位を選択して組換えプラスミドを線状化し、SP6 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを調製する。 </li></ol></li><li> 線状化された組換えプラスミドの精製 <ol><li> LmigOR1の387bp断片、 LmigOR2の1,303bp断片およびLmigorcoの1,251bp断片を含む10個の10μLの反応液にNcoI制限エンドヌクレアーゼを用いた3種の組換えプラスミド20μgを10μlの緩衝液、 40μlの0.5μg/μLのプラスミド、 3μLのNcoIおよび47μLのRNaseフリーH 2 Oを添加し、続いて37℃で3時間インキュベートした。 </li><li>同様に、20μgのこれらの3つの組換えプラスミドuSpe I制限エンドヌクレアーゼを歌う。 </li><li>これらの消化したプラスミドを1.1.2に記載のゲル抽出キットを用いて精製する。抽出した線状化組換えプラスミドの濃度を分光光度法で測定し、0.5μg/μLに調整する。 </li></ol></li><li> アンチセンスとセンスプローブの準備 <ol><li> T7 / SP6 RNA転写システムを使用して、アンチセンスプローブおよびセンスプローブを生成する。 SP6 RNAポリメラーゼを使用して、インビトロで鋳型としての線状化組換えプラスミドを用いて、これら3つのOR遺伝子のDIGおよびビオチン標識アンチセンスプローブの二本鎖RNAを転写する。 T7 RNAポリメラーゼを用いてセンスプローブを生成する。 10倍のNTPミックス2μL、10X転写バッファー2μL、RNaseインヒビター1μL、T7またはSP6 RNAポリメラーゼ2μL、0.5μg/μLの線状化プラスミド4μL、および2μLの線状化プラスミドを含む20μLの最終容量で反応を行い、 9μLのRNaseフリーH 2 O、続いて37℃で3時間インキュベーションすることにより実施した。 </li><li> DIGおよびビオチン標識したアンチセンスおよびセンスプローブを37℃で1μLのDNaseで30分間インキュベートする。 2.5μLの5 M LiClと75μLの無水エタノールを添加し、反応物を-70°Cで30分間インキュベートする。 </li><li> 4℃で30分間、15,000×gで遠心分離する。慎重に上清を傾瀉する。沈殿剤を洗浄するために150μLの70％エタノールを加える。滅菌蒸留水（263.2mL）に95％エタノール（736.8mL）を加えて70％エタノール（1L）を調製する。 </li><li>再び4℃で15,000 xgで30分間遠心分離し、ペレットを室温で5〜10分間風乾します。 25μLのRNaseフリーH 2 Oを添加して、RNAアンチセンスおよびセンスプローブを溶解させます。 </li><li>挿入された遺伝子の長さが1kbより長い場合は、続いて重炭酸塩 - 炭酸塩緩衝液中でのインキュベーションによって〜300bpの平均長さまでプローブRNAアンチセンスおよびセンスプローブを断片化する。 50μLの最終容量で反応を実施する.cRNAプローブのontaining 25μLおよび重炭酸塩-炭酸塩緩衝液25μL（80mMのNaHCO 3を、120mMののNa 2 CO 3、pHは10.2）60℃。必要とされる加水分解時間は、以前に公表された式17によって与えられる。 </li><li> 5μLの10％酢酸を加えて反応を停止する。この実験では、 LmigOR2およびLmigORcoのアンチセンスおよびセンスプローブをそれぞれ24および23分間断片化する。 T =（L 0 -LのF）/ KXL O XL F L oは KB中の初期断片長= L f = kbでの最終断片長さ k =加水分解速度定数、約0.11 kb -1 min -1 t = minにおける加水分解時間</li><li>最後に、250μLのハイブリダイゼーション緩衝液を添加し、-80℃で保存する。 </li></ol></li></ol> 2.クライオスタットセクションの準備<ol><li>プレクールフリーズミクロトーム、すなわち-24℃。 </li><li>活発で、元のままのアンテナを持っている新しい脱皮成虫のイナゴを選択してください。滅菌カミソリを使用してアンテナを2〜3mmの部分に切断します。 </li><li>凍結ミクロトームホルダーにOCT化合物を入れ、1〜2個のサンプルを化合物上に水平に置く。次にホルダーを-24℃で凍結ミクロトームに移し、化合物が凍結するまで平衡化させます。ホルダーを取り出し、少量の化合物でサンプルを覆います。ホルダーを凍結ミクロトームに-24℃で少なくとも10分間再度移す（ 図1 ）。 注：化合物に泡が入らないようにしてください。 </li><li>サンプルが入ったホルダーを凍結ミクロトームに固定し、凍結したサンプルを-24℃で厚さ12μmの切片に分ける。 </li><li>スライスをスライド（25 x 75 mm;ヌクレアーゼフリー）に1枚ずつ解凍し、10分間風乾します。 </li></ol> 3.固定部<ol><li>クライオスタットを準備した後スライドをプラスチック容器（約100 x 40 x 80 mm）に入れ、スライドを4％パラホルムアルデヒド溶液（PFA）中で4℃で30分間インキュベートすることによって組織を固定する。 </li><li>スライドを1Xリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で1分間洗浄する。 </li><li>アルカリ性タンパク質を除去するために、スライドを0.2M HClに10分間移す。 </li><li>核酸の表面タンパク質を除去するために、スライドを1％Triton X-100を含む1XPBSに2分間移す。 </li><li> 1×PBSで30秒間スライドを2回洗浄する。 </li><li>最後に、4℃で10分間ホルムアミド溶液でスライドをすすいでください。 </li></ol> 4.ハイブリダイゼーション<ol><li> アンチセンスプローブとセンスプローブの準備 <ol><li>ハイブリダイゼーションバッファーを使用して、1.5 mLのヌクレアーゼフリーチューブでRNAアンチセンスまたはセンスプローブを希釈します。この実験では、すべてのアンチセンスプローブおよびセンスプローブ（ LmigOR1、LmigOR2、およびLmigOrco ）について、 99μにプローブ1μLを添加するLハイブリダイゼーションバッファーを含む。一般に、アンチセンスプローブの1：100希釈物の使用は、このプロトコールを用いて有意な陽性シグナルおよび低いバックグラウンドを産生する。 </li><li>色素産生検出のために、DIG標識プローブを個別に希釈する。 </li><li> TSA検出のために、ハイブリダイゼーション緩衝液中で一緒にビオチン標識LmigOR1プローブとビオチン標識LmigOrcoプローブまたはDIG標識LmigOR2とDIG標識LmigOR1を希釈します。 </li><li>希釈液を65℃で10分間加熱し、少なくとも5分間氷上に置く。 </li></ol></li><li> ハイブリダイゼーション <ol><li>スライドを排出し、100μLの希釈アンチセンスおよびセンスプローブ（ステップ4.1）を組織切片に加える。次に、組織切片上にカバースリップ（24mm×50mm;ヌクレアーゼフリー）を置く。 </li><li>カバーされたスライドを湿ったボックス（〜300 x 180 x 50 mm 3 ; 図2 ）に水平に置き、t 55℃で22時間。箱の底にホルムアミド溶液または1X PBSを加えて湿らせた状態に保ちますが、スライドを液体に浸しないでください。 </li></ol></li><li> 洗濯およびブロッキング。 <ol><li>ハイブリダイゼーション後、カバーガラスを注意深く取り除きます。 60℃で0.1×生理食塩水（SSC）中で30分間スライドを2回洗浄する。 注：洗浄とは、スライドホルダーにスライドを入れ、プラスチック容器に入れ、ロッカーでゆっくりかき混ぜることです（約50 rpm、 図2 ）。 </li><li>スライドを30秒間、1×トリス緩衝食塩水（TBS）ですすいでください。 </li><li>各スライド上の0.03％Triton X-100を添加したTBS中の1％ブロッキング試薬1mLを加え、30分間インキュベートする。次に、ブロッキング溶液を捨てる。 </li></ol></li><li> 免疫組織化学。 <ol><li>色素産生検出のために、TBS中のブロッキング試薬を使用して、750単位（U）/ mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗生物質1.5U / mLのAP溶液に希釈する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP溶液を加える。 </li><li> TSA検出のために、750U / mLの抗ジゴキシゲニンAP結合抗体および抗ビオチンストレプトアビジンHRP結合抗体をAP / HRP溶液に希釈するために、TBS中のブロッキング試薬を使用する。カバーされたスライド（24mm×50mm）あたり100μLのAP / HRP溶液を加える。 </li><li>スライドを湿った箱（ 図2 ）にインキュベートし、37℃で60分間インキュベートする。ホルムアルデヒド溶液または1X PBSを使用して、箱をしっとりとした状態に保ちます。 </li></ol></li></ol> 5.染色<ol><li>カバーガラスを注意深く取り外します。 0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。スライドをDAP緩衝液（色素生成検出：pH9.5; TSA検出：pH8.0）で5分間すすぐ。 </li><li> 染色（発色検出） <ol><li> 100μLのNBT（375μg/ mL）/ BCIP（188μg/ mL）基質溶液（DAPで希釈;pH 9.5）を各スライドに添加した。カバーガラス（24 x 50 mm）を注意深くスライドに置きます。 </li><li>スライドを、基質溶液を含む湿った箱に10分間インキュベートする（37℃でO / N）。 注：スライドを顕微鏡で随時見ることで開発を確認してください。 </li><li>展開が完了したら、スライドを水に移すことによって反応を停止する。 </li></ol></li><li> 染色（TSA検出） <ol><li>シリンジフィルター（0.22μm; 図2 ）からHNPP（100μg/ mL）/ Fast Red（250μg/ mL）基質を移動するためにシリンジを使用してください。 </li><li>カバースリップ（24×50mm）で覆われたスライドあたり100μLのHNPP / Fast Red基質を加える。 RTでHNPP / Fast Red基質と30分間スライドをインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1X TBSで5分間スライドを3回洗浄する。 </li><li> 100μLのTSA基質/被覆（24×50mm 2 ）スライド。室温で10分間、TSA基質とスライドをインキュベートする。 </li><li>カバーガラスを慎重に取り出し、0.05％Tween-20を添加した1×TBSで5分間スライドを3回洗浄する。 </li></ol></li><li> PBS /グリセロール（1：3）にスライドを埋め込みます。 注：これらの手順を完了した後、蛍光シグナルが急速に消光するため、スライドをできるだけ早く観察する必要があります。 </li></ol> 6.観測<ol><li> クロモジェニック検出 <ol><li>組織切片を光学顕微鏡で観察する。 10X、20X、40Xの対物レンズを選択して、発色検出の結果を観察します。 </li><li> DP-BSWソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。 </li></ol></li><li> TSA検出 <ol><li>共焦点顕微鏡を用いて組織切片を観察する。 DIG標識遺伝子は543nmの光下で観察され、赤色を呈し、ビオチン標識遺伝子は488nm光下で観察され、緑色を呈する。彼らが出現すると、彼らは黄色を呈する。 </li><li> 20Xと40Xの対物レンズを選択して、それぞれTSA検出の結果を観察します。 </li><li> FV1000ソフトウェアを使用して結果を解析し、画像をキャプチャします。 </li></ol></li></ol>

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Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

著者は開示すべき事項やその他の利益相反はありません。

ORCO以外のOR遺伝子の発現レベルが非常に低く、昆虫アンテナの組織学的スライスを保存することが非常に困難であるため、昆虫のアンテナでOR遺伝子を局在化するRNA ISHを行うことは困難である。さらに、TSAの検出も非常に難しいです。これらの問題に対処するには、以下の措置を講じる必要があります。アンテナは、スライド上に形態を維持する薄く柔らかい触角鞘を有する新しく成...

最も重要な化学感覚器官である昆虫のアンテナは、嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって神経支配されている多くの髪のような構造（感覚器と呼ばれる）で覆われています。昆虫ORN類の膜上に、嗅覚受容体（ORS）、7つの膜貫通領域を含むタンパク質の種類は、臭気物質依存性イオンチャネル1、2、3として機能するヘテロマーを形成する共受容体（ORCO）で表されます。異なる論理和は、化学化合物4、5、6の異なる組み合わせに応答します。 Locusts（ Locusta migratoria ）は、主に嗅覚の手掛かりに基づいて重要な行動を誘発します7 。 Locust ORは、分子嗅メカニズムを理解するための重要な要素です。特定のイナゴまたは遺伝子をaのニューロンに局在化させるRNAによる形態特異的な感覚型RNA in situハイブリダイゼーション（RNA ISH）は、ORs機能の探索の第一歩である。 RNA ISHは、標識された相補的RNAプローブを使用して、組織、細胞または全身の部位の特定のRNA配列をインサイチュで測定し、局在化させ、生理学的プロセスおよび疾患の病因への洞察を提供する。ジゴキシゲニン標識（DIG標識）およびビオチン標識RNAプローブは、RNAハイブリダイゼーションにおいて広く使用されている。ジゴキシゲニン-11-UTPまたはビオチン-16-UTPによるRNA標識は、SP6およびT7 RNAポリメラーゼを用いたin vitro転写によって調製することができる。 DIGおよびビオチン標識RNAプローブは以下の利点を有する：非放射性;安全;安定した;高感度;非常に特異的。 PCRおよびインビトロ転写を使用して産生が容易である。 DIGおよびビオチン標識されたRNAプローブは、色原体および蛍光で検出することができます。 DIG標識されたRNAプローブは、抗ジゴキシゲニンアルカリ高感度化学発光基質ニトロブルーテトラゾリウムクロライド/ 5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル - ホスフェートトルイジン塩（NBT / BCIP）、または光学顕微鏡を使用して2つの視覚化できるホスファターゼ（AP）共存顕微鏡を用いて4-クロロ-2-メチルベンゼンジアゾニウムヘミ - 塩化亜鉛塩（ファストレッド）とカップリングした4-ヒドロキシ-3-ナフトエ酸-2&#39;-フェニルアニリドリン酸塩（HNPP）ビオチン標識RNAプローブは、共焦点顕微鏡を使用してフルオレセイン - チラミドで視覚化することができる抗ビオチンストレプトアビジンホースラディッシュペルオキシダーゼ（HRP） - コンジュゲート抗体で検出することができる。したがって、二色蛍光in situハイブリダイゼーションを実施して、DIGおよびビオチン標識RNAプローブを用いて、1つのスライス中の2つの標的遺伝子を検出することができる。 DIGおよび/またはビオチン標識プローブを用いたRNA ISHは、嗅覚関連遺伝子、例えばOR 、イオノトロピック受容体、匂い物質結合タンパク質感覚ニューロン膜タンパク質、 キイロショウジョウバエ 、 ハマダラカ 、L.のmigratoriaと砂漠バッタSchistoceraグレガリア 8、9、10、11、12、13、14、15、16、これらに限定され昆虫のアンテナではなく、です。 （1）OR遺伝子（ ORcoを除く）が低レベルで、少数の細胞でのみ発現され、シグナル検出を非常に困難にし、（2）昆虫組織を保存するためのRNA ISHを行う際に、2つの大きな課題がある。形態学が保存され、背景雑音が低いような組織学は、困難であり得る。この論文では、昆虫におけるOR遺伝子の局在化のためのRNA ISHを説明する詳細で効果的なプロトコル発色およびTyramide Signal Amplification（TSA）検出の両方を含むアンテナが提示されます。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times;TSINGKE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPAIN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Wash solution</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0.12% acetic acid</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>03677</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>WISENT ING, Canada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar Bacteriological Grade</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M Na-Citrate</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyde</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1% Blot</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td></td><td></td><td>1&amp;times;Tris buffered saline</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>2&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% dextran sulphate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 &amp;micro;g/mL yeast t-RNA</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL herring sperm DNA</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td></td><td></td><td>Detection Buffer</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% fluorescein-tyramides</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>Jung CM300 cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus IX71microscope</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus BX45 confocal microscope</td><td></td></tr></tbody></table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

昆虫は、外因性の化学信号を感知するための洗練された嗅覚受容系を進化させてきた。これらの化学シグナルは、アンテナのケモソーム（chemosensilla）と呼ばれる髪のような構造に収容された嗅覚受容器ニューロン（ORN）によって形質導入される。 ORNの膜上で、嗅覚受容器（OR）は匂いのコード化に関与していると考えられている。したがって、OR遺伝子に局在する遺伝子を同定できることは、OR遺伝子を認識するために必要であり、さらなる機能的in situ研究の基礎を提供する。昆虫のアンテナにおける特定のORのRNA発現レベルは非常に低く、組織学的に昆虫組織を保存することは困難である。したがって、RNA in situハイブリダイゼーションを使用して特定タイプの感覚器にORを局在化することは困難である。この論文では、特に昆虫の低発現OR遺伝子のための詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコールが導入されている。さらに、特定のOR 遺伝子WAOrcoをマーカーとして共発現する受容体遺伝子を用いた二重蛍光蛍光in situハイブリダイゼーション実験を行うことによって同定された。

色素産生の検出では、すべての成人の触角部分における触角細胞の小さなサブセットを、DIG標識LmigOR1およびLmigOR2アンチセンスプローブで示した（ 図3 ）。 LmigOR1とLmigOR2を局在化するために連続切片上のRNA ISHは、二つの遺伝子を発現する触角細胞が推定LmigOR1とLmigOR2が実際ORN類（ 図4aの</str...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在<em&gt;現場で</em&gt;ハイブリダイゼーション

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K ビュー.  China Agricultural University. この論文では、ジゴキシゲニン（DIG）標識またはビオチン標識プローブを用いた昆虫アンテナにおいて、特に低レベル発現匂い受容体（OR）遺伝子ならびに他の遺伝子の詳細かつ非常に有効なRNA in situハイブリダイゼーションプロトコルについて記載している。 

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

神経科学

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

発生生物学

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

嗅覚検索用自律型ロボットに昆虫Electroantennogramセンサを用いた

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Electroantennography-based Bio-hybrid Odor-detecting Drone using Silkmoth Antennae for Odor Source Localization

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their applicability in environmental and security monitoring and search-and-rescue operations. Small drones with commercial metal-oxide-semiconductor (MOX) gas sensors have been developed for odor source localization; however, their real-time-odor-detection performance has proven inadequate. However, biosensing technologies based on insect olfactory systems exhibit relatively high sensitivity, selectivity, and real-time response with respect to odorant molecules compared to commercial MOX gas sensors. In such devices, excised insect antennae function as portable odorant biosensor elements and have been found to deliver excellent sensing performance. This study presents experimental protocols for odorant-molecule detection in the air using a small autonomous bio-hybrid drone based on a mountable electroantennography (EAG) device incorporating silkmoth antennae.
We developed a mountable EAG device including sensing/processing parts with a Wi-Fi module. The device was equipped with a simple sensor enclosure to enhance the sensor directivity. Thus, odor source localization was conducted using the spiral-surge algorithm, which does not assume an upwind direction. The experimental bio-hybrid odor-detecting drone identified real-time odorant-concentration differences in a pseudo-open environment (outside a wind tunnel) and localized the source. The developed drone and associated system can serve as an efficient odorant molecule-detection tool and a suitable flight platform for developing odor source localization algorithms owing to its high programmability.

This study introduces experimental protocols for a bio-hybrid odor-detecting drone based on silkmoth antennae. The operation of an experimental electroantennogram device with silkmoth antennae is presented, in addition to the structure of a bio-hybrid drone designed for odor source localization using the spiral-surge algorithm.

電気解析ベースのバイオハイブリッド臭気検出ドローンは、臭気源の局在化のためのシルクモスアンテナを用いた

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their ...

工学

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出<em&gt;その場での</em&gt;ハイブリダイゼーション

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

イナゴ Palp 触角 Basiconica の単一ゴキブリ録音

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在

要約

さらに動画を探す

この動画の章

昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

嗅覚検索用自律型ロボットに昆虫Electroantennogramセンサを用いた

電気解析ベースのバイオハイブリッド臭気検出ドローンは、臭気源の局在化のためのシルクモスアンテナを用いた

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイムキャンプ

イナゴ Palp 触角 Basiconica の単一ゴキブリ録音

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Locust AntennaeにおけるRNAによる嗅覚受容体遺伝子の局在

要約

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昆虫における単一感覚子録音キイロショウジョウバエとハマダラカ

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（

周辺嗅覚組織の開発を準備する分子とショウジョウバエの免疫組織化学的解析

嗅覚検索用自律型ロボットに昆虫Electroantennogramセンサを用いた

電気解析ベースのバイオハイブリッド臭気検出ドローンは、臭気源の局在化のためのシルクモスアンテナを用いた

高解像度を使用した脳切片における軸索のローカライズされたmRNAの検出

情報化学物質にトコジラミの嗅覚ニューロンの応答を検出するために単一感覚子録音を使用しました

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

イナゴ Palp 触角 Basiconica の単一ゴキブリ録音

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイムキャンプ