作者はこの仕事に資金を供給するため次のことを感謝したいと思います：スタートアップ寛大な資金をワシントン大学、システム神経科学助成金、米海軍研究助成金（グラント＃：N000141210089）のOfficeのマクダネルセンターの医工学の学科からBRへ

1。臭気の準備と配達<ol><li>所望の濃度レベルを達成するためにボリュームが鉱物油で臭気ソリューションを希釈します。 60mlのガラス瓶に鉱物油と臭剤20mlの混合物を保管してください。入口と出口のラインを提供するために、ゴム栓（計19）、上から下から1と他に2つの注射針を挿入します。このゴム栓とガラス瓶を密封し、入口ライン（ 図1A）にカスタム設計された活性炭フィルターを取り付けてください。 </li><li>カーボンフィルターは2 6ミリリットルのシリンジを使用して行われます。半分に注射器をカットし、プランジャーの端を捨てる。熱収縮チューブを使用して、それらを一緒に接続する前に、綿と活性炭との残りの部分をそれぞれ記入してください。 </li><li>アンテナの向こう側に一定のエアフローを供給プラスチックチューブ（ナルゲンFEPチューブ、ID 5.8ミリメートル）である（ 図1Bに臭気ボトル（ポリエチレンチューブ、0.86ミリメートルのIDを使用して）の出口ラインを接続</stチョロン&gt;）。 </li><li>イナゴアンテナの数cm以内に配置プラスチックチューブを使用してバッタに向かって、直接炭素 - ろ過、除湿空気（流量、0.75 L / minのキャリアガス）。 </li><li>匂い刺激のために、ボトル内の臭気溶液上の静的ヘッドスペースの一定量（0.1リットル/ min）を変位させる。これはピコポンプ（WPIは、PV-820）を使用してボトルに除湿された空気の等しい量を注入することによって達成される。臭気ボトルから蒸気が通気管に出口ライン（ 図1B）を経由します。 </li><li> 〜10センチメートルイナゴのアンテナの後ろに真空漏斗を配置することによって、配信臭気蒸気を除去。 </li></ol> 2。シングル感覚子記録用ローカスアンテナの準備<ol><li>完全に成長した翼でどちらの性別の若い大人のイナゴを選択したが、交配前のステージに混雑したコロニーから。イナゴを抑制するには、まずその足を切断。組織接着剤（Vetbond、3M）と切断部位を密封する。セキュアトン（ 図2A）、その胸部の周りに覆われた電気テープの小片を使用して、カスタム設計されたチャンバーに彼はイナゴ。 </li><li>解剖顕微鏡下では、アンテナの配置のためのワックスのプラットフォーム（ 図2A）に浅い溝を作る。溝にアンテナを配置し、アンテナの両端（ 図2B; electrowaxerがワックスを溶融するために使用されている）でバティックのワックスを使用して、それを安定させる。 </li><li>胸部（約1cm離れて頭から）に接地電極（塩素化銀線）を挿入します。両方のシールに切開部位をバティックワックスを使用して、場所にアース線を保持した（ 図2A）。 </li></ol> 3。嗅覚受容ニューロン（ORNs）から臭気誘発反応を監視する単一の感覚子の記録<ol><li>防振台（TMC）（ 図3A）の実体顕微鏡（ライカM205C）で安定化ローカストアンテナを設置する。記録感覚子のベースがはっきりしていることを確認してくださいLY見える（ 図3B）。 </li><li>ホウケイ酸ガラスキャピラリーチューブ（外径1.2ミリメートル、0.69ミリメートルのID）を用いて、ガラス電極（イナゴ生理食塩水9、先端径1〜3μmででいっぱいMΩインピーダンス3-10）作製するマイクロピペットプラー（サターP-1000）を使用します。 </li><li>電動マイクロマニピュレーター（サッターMP-285）に取り付けられているマイクロピペットホルダーにガラス電極を配置します。優しく感覚子（ 図3B）のベースに電極を挿入します。各感覚子はバッタ10で3から50 ORNsを含めることができることに注意してください。 </li><li> ACアンプ（グラスP-55）を使用した信号（10,000倍）を増幅する。 0.3の間の信号フィルタ- 10.0 kHzを、データ収集システムを使用して、15 kHzサンプリングレート（ 図3D）（は、LabVIEW、PCI-MIO-16E-4 DAQカード、ナショナルインスツルメンツ）で取得する。 </li></ol> 4。触角葉とキノコ体のレコーディングのためにイナゴの解剖手順<ol><li> restrainiに従ってくださいngの手順は、セクション2.1で説明された。 図4AおよびBに示すようにカスタム設計されたチャンバー内でバッタを置きます。 </li><li>中に生理食塩水を灌流すると解剖手順の後に、イナゴ​​の頭の周りにワックスカップを構築することができます。ワックスカップはちょうど口の部分の上に起動して、 図4Cに示すように、2つのアンテナ間の領域を網羅し複眼を超えて拡張する必要があります。 </li><li>アンテナはワックスカップを通過することを許可するには、プラスチック（ポリエチレン）チューブ（長さ5mm、IDの0.86ミリメートル）を使用して、両側に小さなトンネルを作成します。プラスチック製のチューブがワックスカップを通してスライドできることを確認します。後者はしっかりプラスチックチューブを包み込むが、ワックスカップ（ 図4C）に取り付けられているゴム製のガスケットを使用することによって達成される。 </li><li>エポキシ樹脂を用いて、プラスチックチューブの下端にアンテナのベースを取り付けます。このステップでは、アンテナがあっても周囲の後に所定の位置に保持されることを保証キューティクルは削除されます。 </li><li>この時点から食塩水9で埋めワックスカップを保つ。アンテナ2本（前後軸と平行な四角形の長辺）の間の中央の長方形領域を最初に取り外します。その後、アンテナの基部（ 図4D）で複眼とキューティクルを乱すことなく、近隣地域でキューティクルを除去します。 </li><li>細かい鉗子を使用して、静かに空気嚢や脳の周囲の脂肪体を削除します。このステップの終了時に、バッタの脳ははっきりと（ 図4D）見られるべきである。嗅覚情報（淡黄色色素沈着を持つ）を処理する脳の領域は、2つのアンテナの間に位置していることに注意してください。 </li><li>イナゴでは腸は脳と体の下の長さに沿って実行されます。潜在的に準備を不安定にするから、腸の動きを防ぐために、静かに前腸を引き出し、それが正常にハサミを使ってカットします。腹部に小さな切開を加えるだけ直腸上記と粗鉗子で後腸を引っ張って腸を削除します。生理食塩水漏れを防止するために、縫合糸による切開部位のすぐ前方の腹部を結ぶ。 </li><li> 図4Dに示すように、電気生理学の間に脳を高め、11それを安定させるためにワックスの薄い層でコーティングされた細いワイヤーで作られた小型のプラットフォームを使用します。 </li><li>昆虫の脳は前の実験に除去する必要が薄い絶縁シースで覆われている。 desheathに脳は、優しく細かい鉗子9を用いて脳の表面上に酵素を少量（0.3から0.4 mgのプロテアーゼ、シグマアルドリッチ）に広がった。酵素アプリケーションの5〜10秒後、生理食塩水で十分に脳をすすいでください。超微細鉗子を使用すると、非常に優しくつまんでシースをプルアップし、その後、それが記録位置（ALとMB、 図4E、Fに示す）を介して開く引き裂く。 </li></ol> 5。触角葉からマルチユニットレコーディングとキノコ体<ol><li>防振台上に置かブームスタンドから吊るさ実体顕微鏡下でイナゴの準備（ 図5A）を置きます。 </li><li>実験を通じて一定の生理食塩水灌流速度（約0.04リットル/時間）を維持する。接地電極として生理食塩水を充填したワックスカップに浸塩素化銀線を使用しています。 </li><li> PNの録音については、16チャネルシリコンプローブ（NeuroNexusテクノロジーズアイテム＃A2x2-TET-3ミリメートル-150-150-121-A16、 図5B）を使用します 。各実験の前に、200〜300kΩの範囲でインピーダンスを達成するために金で電極を電気めっき。電気については、 図7に示す回路を使用しています。 </li><li>近く触角葉の表面に電極を置き、そっと手動マニピュレーター（WPI、M3301R）（ 図5D）を使用して組織に挿入します。 </li><li> 〜10μmステップで電極を進める。各ステップで2〜3分待ってから、獲得を検討D信号の品質。理想的なレコーディング現場では、細胞外の信号が複数の記録チャネルによってピックアップされ、高い信号対雑音比（SNR&gt; 3-5回ノイズSDS）を持ちます。 </li><li> KCの録画用に、カスタムメイドの撚線テトロード（; 6節に示さステップ·バイ·ステップの製作手順図5C）を使用します 。ステップ5.3で説明したように、これらの電極に電気メッキ。 KC細胞体はMB 8の表層に限定されるメガバイト（ 図5E）の表面に極真空管を配置します。 </li><li>模式的に図5Aに示すように、両方のPNとKCの録音が同時に同じイナゴの準備から行うことができます。 </li><li>電極の安定化を可能にするために録音の場所を見つけた後少なくとも15分間待ちます。 </li><li> 0.3から6 kHzの間のフィルタ15のKHzで、すべての細胞外シグナルを取得し、16チャンネルACアンプ（生物学電子商店;カリフォルニア工科大学、パサデナ、カリフォルニア州）を用いて（1万倍）を増幅（図6A、B）。 </li></ol> 6。 KCの録音のためにツイストワイヤ電極を確認するための手順<ol><li> KCの録音のためのマルチユニットの電極を設計するには、絶縁されたニッケルクロム線（RO800、0.0005 &quot;フィラメント）8を使用しています 。 </li><li> 8電極が望まれているならば、段ボールの4倍の10〜15センチメートル長い部分にワイヤーを巻きつけます。段ボールの端部は、ワイヤを切断からエッジを防ぐためにプラスチックチューブで覆うことができる。ラッピングしながら、少したるみがあることを確認しますが、ワイヤーがピンと張っていないことを確認してください。それが簡単に壊れるように慎重にワイヤを扱う。 </li><li>バンチ段ボールの上部に一緒に配線し、それらを一緒に保持するためにテープの一部（タイムテープは、T-534-RP）を使用しています。もう一方の端のストランドをカット。よくテープの別の部分を使用して、カット終了時にワイヤストランドとグループのワイヤを外します。 </li><li>タイタープレートシェーカー（サーモサイエンティフィック、モデル4625Q）を使用して、（3用〜72回転/分一緒に鎖を巻いて1撚線を形成する分）。録音されたストランドの底はタイタープレートローターにクリッピングすることができ、上部はブームスタンドにクリップすることができます。巻き取り時、ワイヤがピンと張ったことではない、まだ少し余裕が必要です。 </li><li>一緒に個々のストランドを堅持し、単線を形成するためにヒートガン（ウェラー6966C）と一緒に断熱材を溶かす。ワイヤの長さに亘って3月4日遅いパスは（3-4秒毎に）一緒にストランドを加熱して溶融するのに十分でなければならない。その後、下からワイヤーを解放し、それがリラックスすることができます。テープを除去するために両端付近線をトリムします。 </li><li> 5〜6センチメートル長い、ガラスキャピラリーチューブ（外径1.0ミリメートル、0.58ミリメートルのID）を介してワイヤの一方の端を差し込みます。細かいピンセットを使用して1つの端に撚線を離れていじめると、非常に簡単に炎を使用してエンドを放火によってコーティングを除去してください。この手順は慎重に行わなければなりません。長すぎるために炎にワイヤーを公開することはストランドが溶融し、もつれてしまいます。 </li><li>優しく燃え上がる端に8鎖を分離8ピンICソケットに別々にNDはんだが各鎖。コー​​ト代わりにストランドとガラスキャピラリーを保持するためにエポキシとICソケットの上部を。また、場所（ 図5C）にワイヤーを保持するために毛細血管のもう一方の端にエポキシの小滴を配置します。 </li><li>最後に、キャピラリー先端から約0.5cmカーバイドハサミで45度の角度で線の先端をカットします。 </li></ol>

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特別な利害関係は宣言されません。

ほとんどの感覚刺激は、ニューロンのアンサンブルに分散されたコンビナトリアル反応を引き起こす。したがって、マルチニューロン活動の同時モニタリングが刺激固有の情報が脳内の神経回路で表されており、どのように処理されるかを理解する必要があります。ここでは、昆虫の嗅覚経路に沿って第3処理センターにおける臭気誘発反応を特徴づけるために、細胞外マルチユニット記録技...

<table border="1"><tbody><tr><td> 名前 </td><td> 会社 </td><td> カタログ番号 </td><td> 注釈 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 電気機器 </td></tr><tr><td> ACアンプ</td><td> GRASS </td><td>モデルP55 </td><td>単一の感覚子のレコーディングのために</td></tr><tr><td>オーディオモニター（モデル3300） </td><td> AMシステム</td><td> 94万</td><td></td></tr><tr><td>カスタムメイド16チャンネルプリアンプとアンプ</td><td>カル。テック。バイオエレクトロニクスショップ</td><td></td><td> ALとメガバイトレコーディングに</td></tr><tr><td>データ収集部</td><td>ナショナルインスツルメンツ</td><td> BNC-2090 </td><td></td></tr><tr><td>光ファイバーの光</td><td> WPI </td><td> SI-72から8 </td><td> &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td>光源115 V </td><td> WPI </td><td> NOVA </td><td></td></tr><tr><td>手動マニピュレーター</td><td> WPI </td><td> M3301R </td><td>イナゴ脳録音用</td></tr><tr><td>ブームスタンドにStereomicroscope1 </td><td>ライカ</td><td> M80 </td><td>イナゴ脳録音用</td></tr><tr><td> Stereomicroscope2 </td><td>ライカ</td><td> M205C </td><td>単一の感覚子のレコーディングのために</td></tr><tr><td>振動アイソレーションテーブル</td><td> TMC </td><td> 63から500シリーズ</td><td></td></tr><tr><td>電動マイクロマニピュレーター</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> MP285 / T </td><td></td></tr><tr><td>オシロスコープ</td><td>テクトロニクス</td><td> TD2014B </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 電極/建設ツール &lt;/ TD&gt; </tr><tr><td> 16チャネル電極</td><td> NeuroNexus </td><td> A2x2-TET-3mmの150から121 </td><td>触角葉のレコーディングのために</td></tr><tr><td>フィラメントは、ID 0.69ミリメートルとホウケイ酸毛細管</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> BF120-69から10 </td><td>ガラス電極を作るための</td></tr><tr><td>マイクロピペットプラー</td><td>サターインスツルメンツ</td><td> P-1000 </td><td></td></tr><tr><td>関数発生器</td><td>マルチメータの倉庫</td><td> SG1639A </td><td>金メッキ電極用</td></tr><tr><td>金めっき液（シアン化物非） </td><td> SIFCOインダストリーズ</td><td>ノースカロライナ州のSPS 5355 </td><td></td></tr><tr><td>インピーダンステスター</td><td> BAKエレクトロニクス株式会社</td><td> IMP-2 </td><td>金メッキ電極用</td></tr><tr><td>ロータリースイッチ</td><td>品番</td><td> C7D0123N </td><td>金-plに関するating電極</td></tr><tr><td>パルスアイソレータ</td><td> WPI </td><td> A365 </td><td>金メッキ電極用</td></tr><tr><td> Qシリーズ電極ホルダー</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から1091 </td><td></td></tr><tr><td>銀線0.010 &quot;直径</td><td> AMシステム</td><td> 782500 </td><td>接地電極</td></tr><tr><td> 8ピンDIP ICソケット</td><td> Digikeyを</td><td> ED90032-ND </td><td></td></tr><tr><td>フィラメントは、ID 0.58ミリメートルとホウケイ酸毛細管</td><td>ワーナー·インスツルメンツ</td><td> 64から0787 </td><td>撚線テトロード建設</td></tr><tr><td>ヒートガン</td><td>ウェラー</td><td> 6966C </td><td></td></tr><tr><td> Rediohm-800ワイヤー</td><td>カンタルプレシジョンテクノロジー</td><td> PF002005 </td><td></td></tr><tr><td>タイタープレートシェーカー</td><td>サーモ科学的</td><td> 4625Q </td><td>ねじれワイヤー</td></tr><tr><td>炭化物はさみ、4.5 &quot; </td><td>バイオメディカル研究InStr関数</td><td> 25から1000 </td><td>ツイストテトロードワイヤを切断するための</td></tr><tr><td>ファインポイントピンセット</td><td> HECO </td><td> 91-EF5-SA </td><td>別にいじめテトロードワイヤ用</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 臭気デリバリー </td></tr><tr><td> 6ミリリットルのシリンジ</td><td>ケンドール</td><td> 1180600777 </td><td>カスタム設計された活性炭フィルター用</td></tr><tr><td>ブラウン臭気ボトル</td><td>フィッシャー</td><td> 08-912-165 </td><td></td></tr><tr><td>木炭</td><td> <a href="http://BuyActivatedCharcoal.com" target="_blank">BuyActivatedCharcoal.com</a> </td><td> GAC-48C </td><td></td></tr><tr><td>乾燥剤</td><td> DRIERITE </td><td> 23005 </td><td></td></tr><tr><td> DRIERITEガス乾燥ジャー</td><td>フィッシャー·サイエンティフィック</td><td> 09から204 </td><td></td></tr><tr><td>熱収縮チューブ</td><td>スリーエム</td><td> EPS-200 </td><td>臭気フィルタ準備</td></tr><tr><td>皮下注射針アルミハブ、計19 </td><td>ケンドール</td><td> 8881-200136 </td><td>臭気ボトルの入口と出口のラインを提供するための</td></tr><tr><td>鉱油</td><td>マリンクロットケミカルズ</td><td> 6357から04 </td><td>臭気の希釈用</td></tr><tr><td>ナルゲンプラスチックチューブ、890 FEP </td><td>サーモサイエンティフィック</td><td> 8050-0310 </td><td>キャリアガス供給の</td></tr><tr><td>空気圧picopump </td><td> WPI </td><td> SYS-pv820 </td><td>臭気配信のため</td></tr><tr><td>ポリエチレンチューブIDの0.86ミリメートル</td><td> Intramedic </td><td> 427421 </td><td>臭気瓶コンセントconnecti用アドオンや生理食塩水灌流チューブ</td></tr><tr><td>ストッパー</td><td>ラボピュア</td><td> 97041 </td><td>臭気瓶を密封するための</td></tr><tr><td>時間テープ</td><td> PDC </td><td> T-534-RP </td><td></td></tr><tr><td>チューブルアー</td><td>コー​​ル - パーマー</td><td> 30600から66 </td><td></td></tr><tr><td>真空管</td><td>マクマスター - カー</td><td> 5488K66 </td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 準備/解剖 </td></tr><tr><td> 100×15ミリメートルペトリ皿</td><td> VWRインターナショナル</td><td> 89000-304 </td><td></td></tr><tr><td> 18 AWGの銅より線</td><td> LAPP KABEL </td><td> 4510013 </td><td>電線絶縁はゴムのガスケットとして使用されている</td></tr><tr><td> 22 AWGの回路用電線</td><td> AlphaWire </td><td> 1551 </td><td>脳プラットフォーム</td></tr><tr><td>バティックワックス</td><td>ジャカール</td><td> 7946000 </td><td></td></tr><tr><td>歯の周囲のワックス</td><td>ヘンリー·シャインデンタル</td><td> 6652151 </td><td></td></tr><tr><td> Electrowaxer </td><td> Almore国際</td><td> 66000 </td><td></td></tr><tr><td>エポキシ、5分</td><td> Permatex </td><td> 84101 </td><td></td></tr><tr><td>皮下注射針アルミハブ</td><td>ケンドール</td><td> 8881-200136 </td><td></td></tr><tr><td> ストレプトgriseus由来のプロテアーゼ</td><td>シグマアルドリッチ</td><td> P5147 </td><td>イナゴの脳をdesheathing用</td></tr><tr><td>縫合糸非滅菌</td><td>フィッシャー</td><td> NC9087024 </td><td>腸内細菌を除去した後に腹部を結ぶための</td></tr><tr><td> Vetbond </td><td>スリーエム</td><td> 1469SB </td><td>午前密封するためのputationサイト</td></tr><tr><td>デュモン第1鉗子（粗） </td><td> WPI </td><td> 500335 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン第5チタンピンセット（細かい） </td><td> WPI </td><td> 14096 </td><td></td></tr><tr><td>デュモン＃5SF鉗子（超微細） </td><td> WPI </td><td> 500085 </td><td> desheathingイナゴ脳</td></tr><tr><td> 10センチメートルはハサミを解剖</td><td> WPI </td><td> 14393 </td><td>足と羽を除去するための</td></tr><tr><td> Vannasはさみ（ファイン） </td><td> WPI </td><td> 500086 </td><td>キューティクルを除去するために、前腸を切断</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 生理食塩水豊富さ </td></tr><tr><td>レートフローレギュレータを使用して設定延長</td><td>ムーアメディカル</td><td> 69136 </td><td>生理食塩水の流れを調整するための</td></tr><tr><td>静脈内投与は、使用して設定Yの注射部位</td><td>ムーアメディカル</td><td> 73190 </td><td>生理食塩水の流れを調整するための</td></tr></tbody></table>

multi-unit recording methods to characterize neural activity in the locust (schistocerca americana) olfactory circuits

嗅覚の検出と解釈は、多くの生物の生存のために重要である。驚くべきことに、門の両端の種は驚くほど似て嗅覚システムは、化学センシングへの生物学的ア ​​プローチは進化の時間1の上に最適化されていることを示唆している。昆虫の嗅覚系では、匂い物質は活動電位の列車に化学的刺激に変換するアンテナの嗅覚受容ニューロン（ORN）によって導入されています。 ORNsからの感覚入力は、その後、触角葉（;脊椎動物の嗅球に類似した構造AL）に中継されます。 2,3、ALで、悪臭のための神経表現は、校長のニューロン集団（また、投射ニューロンと呼ばPNS）に分散時空間発火パターンの形をとる。 ALの出力は、その後、下流のキノコ体（メガバイト）、嗅覚記憶および4,5学習に関連付けられている構造でケニヨン細胞（KCS）によって処理されます。彼女のeは、我々はこれらの嗅覚回路で臭気誘発神経反応を監視するために電気生理学的記録手法を提案する。 まず、ORNs 6,7の集団のレベルで臭気誘発反応を研究するために、単一の感覚子の記録方法を提示します。我々は細胞外ORNの応答を監視するための電極として生理食塩水埋め研ぎガラスピペットの使用について説明します。次に、我々は細胞外に商業16チャネル電極3を使用したPN応答を監視する方法を提案する。カスタムメイドの8チャンネル撚線四極管を使用して同様のアプローチがケニヨン細胞録音8で実証されています。我々は、これらの技術のそれぞれのための私達の実験のセットアップの詳細と現在の代表的な記録トレースを提供します。

二つの異なるアルコールへの単一のORNの臭気誘発反応は 、 図3（d）に示すようにしています。記録位置に応じて（感覚子の種類、電極の配置）​​マルチユニットレコーディングを実現することができる。 ALの録音から生細胞外波形を図6（a）に示されています。活動電位または別のPNに由来する様々な振幅のスパイクは、この電圧...

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Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（<em&gt; Schistocercaアメリカーナ</em&gt;）嗅覚回路

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

multi-unit-recording-methods-to-characterize-neural-activity-locust

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

26.9K ビュー.  Washington University in St. Louis. 我々は、無脊椎動物の嗅覚経路の最初の3つの段階で臭気誘発反応を特徴づける細胞外マルチユニット記録技術のバリエーションを示しています。これらの技術は簡単にだけでなく、他の神経系において、アンサンブル活動を調べるために適合させることができます。

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Optical Recording of Suprathreshold Neural Activity with Single-cell and Single-spike Resolution

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also propagation of suprathreshold spiking activity involves populations of neurons. Empirical studies addressing cortical function directly thus require recordings from populations of neurons with high resolution. Here we describe an optical method and a deconvolution algorithm to record neural activity from up to 100 neurons with single-cell and single-spike resolution. This method relies on detection of the transient increases in intracellular somatic calcium concentration associated with suprathreshold electrical spikes (action potentials) in cortical neurons. High temporal resolution of the optical recordings is achieved by a fast random-access scanning technique using acousto-optical deflectors (AODs)1. Two-photon excitation of the calcium-sensitive dye results in high spatial resolution in opaque brain tissue2. Reconstruction of spikes from the fluorescence calcium recordings is achieved by a maximum-likelihood method. Simultaneous electrophysiological and optical recordings indicate that our method reliably detects spikes (&gt;97% spike detection efficiency), has a low rate of false positive spike detection (&lt; 0.003 spikes/sec), and a high temporal precision (about 3 msec) 3. This optical method of spike detection can be used to record neural activity in vitro and in anesthetized animals in vivo3,4.

Understanding the function of the vertebrate central nervous system requires recordings from many neurons because cortical function arises on the level of populations of neurons. Here we describe an optical method to record suprathreshold neural activity with single-cell and single-spike resolution, dithered random-access scanning. This method records somatic fluorescence calcium signals from up to 100 neurons with high temporal resolution. A maximum-likelihood algorithm deconvolves the underlying suprathreshold neural activity from the somatic fluorescence calcium signals. This method reliably detects spikes with high detection efficiency and a low rate of false positives and can be used to study neural populations in vitro and in vivo.

単一セルと単スパイク分解能で閾値上神経活動の光記録

Signaling of information in the vertebrate central nervous system is often carried by populations of neurons rather than individual neurons. Also ...

神経科学

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings (GCMR) in the Insect Antennal Lobe

All organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is especially important in insects, which use their olfactory systems to respond to, and discriminate amongst, complex odor stimuli. These odors elicit behaviors that mediate processes such as reproduction and habitat selection1-3. Additionally, chemical sensing by insects mediates behaviors that are highly significant for agriculture and human health, including pollination4-6, herbivory of food crops7, and transmission of disease8,9. Identification of olfactory signals and their role in insect behavior is thus important for understanding both ecological processes and human food resources and well-being.
	To date, the identification of volatiles that drive insect behavior has been difficult and often tedious. Current techniques include gas chromatography-coupled electroantennogram recording (GC-EAG), and gas chromatography-coupled single sensillum recordings (GC-SSR)10-12. These techniques proved to be vital in the identification of bioactive compounds. We have developed a method that uses gas chromatography coupled to multi-channel electrophysiological recordings (termed 'GCMR') from neurons in the antennal lobe (AL; the insect's primary olfactory center)13,14. This state-of-the-art technique allows us to probe how odor information is represented in the insect brain. Moreover, because neural responses to odors at this level of olfactory processing are highly sensitive owing to the degree of convergence of the antenna's receptor neurons into AL neurons, AL recordings will allow the detection of active constituents of natural odors efficiently and with high sensitivity. Here we describe GCMR and give an example of its use.
	Several general steps are involved in the detection of bioactive volatiles and insect response. Volatiles first need to be collected from sources of interest (in this example we use flowers from the genus Mimulus (Phyrmaceae)) and characterized as needed using standard GC-MS techniques14-16. Insects are prepared for study using minimal dissection, after which a recording electrode is inserted into the antennal lobe and multi-channel neural recording begins. Post-processing of the neural data then reveals which particular odorants cause significant neural responses by the insect nervous system.
	Although the example we present here is specific to pollination studies, GCMR can be expanded to a wide range of study organisms and volatile sources. For instance, this method can be used in the identification of odorants attracting or repelling vector insects and crop pests. Moreover, GCMR can also be used to identify attractants for beneficial insects, such as pollinators. The technique may be expanded to non-insect subjects as well.

Identification of Olfactory Volatiles using Gas Chromatography-Multi-unit Recordings GCMR in the Insect Antennal Lobe

Olfactory cues mediate many different behaviors in insects, and are often complex mixtures comprised of tens to hundreds of volatile compounds. Using gas chromatography with multi-channel recording in the insect antennal lobe, we describe a method for the identification of bioactive compounds.

昆虫の触角葉でガスクロマトグラフィー - マルチユニットレコーディング（GCMR）を使用して、嗅覚揮発性物質の同定

All  organisms inhabit a world full of sensory stimuli that determine their  behavioral and physiological response to their environment. Olfaction is ...

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety of brain disorders1,2. To better understand the mechanisms by which brain circuits react to an animal's experience requires the ability to monitor the experience-dependent molecular changes in a given set of neurons, over a prolonged period of time, in the live animal. While experience and associated neural activity is known to trigger gene expression changes in neurons1,2, most of the methods to detect such changes do not allow repeated observation of the same neurons over multiple days or do not have sufficient resolution to observe individual neurons3,4. Here, we describe a method that combines in vivo two-photon microscopy with a genetically encoded fluorescent reporter to track experience-dependent gene expression changes in individual cortical neurons over the course of day-to-day experience. 
One of the well-established experience-dependent genes is Activity-regulated cytoskeletal associated protein (Arc)5,6. The transcription of Arc is rapidly and highly induced by intensified neuronal activity3, and its protein product regulates the endocytosis of glutamate receptors and long-term synaptic plasticity7. The expression of Arc has been widely used as a molecular marker to map neuronal circuits involved in specific behaviors3. In most of those studies, Arc expression was detected by in situ hybridization or immunohistochemistry in fixed brain sections. Although those methods revealed that the expression of Arc was localized to a subset of excitatory neurons after behavioral experience, how the cellular patterns of Arc expression might change with multiple episodes of repeated or distinctive experiences over days was not investigated. 
In vivo two-photon microscopy offers a powerful way to examine experience-dependent cellular changes in the living brain8,9. To enable the examination of Arc expression in live neurons by two-photon microscopy, we previously generated a knock-in mouse line in which a GFP reporter is placed under the control of the endogenous Arc promoter10. This protocol describes the surgical preparations and imaging procedures for tracking experience-dependent Arc-GFP expression patterns in neuronal ensembles in the live animal. In this method, chronic cranial windows were first implanted in Arc-GFP mice over the cortical regions of interest. Those animals were then repeatedly imaged by two-photon microscopy after desired behavioral paradigms over the course of several days. This method may be generally applicable to animals carrying other fluorescent reporters of experience-dependent molecular changes4.

In Vivo Two-photon Imaging Of Experience-dependent Molecular Changes In Cortical Neurons

Experience-dependent molecular changes in neurons are essential for the brain's ability to adapt in response to behavioral challenges. An in vivo two-photon imaging method is described here that allows the tracking of such molecular changes in individual cortical neurons through genetically encoded reporters.

皮質ニューロンにおける経験依存性分子の変化の in vivo二光子イメージングにおける

The brain's ability to change in response to experience is essential for healthy brain function, and abnormalities in this process contribute to a variety ...

Recording and Analysis of Circadian Rhythms in Running-wheel Activity in Rodents

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, including rats, hamsters, and mice, are active during the night and relatively inactive during the day. Many other behavioral and physiological measures also exhibit daily rhythms, but in rodents, running-wheel activity serves as a particularly reliable and convenient measure of the output of the master circadian clock, the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the hypothalamus. In general, through a process called entrainment, the daily pattern of running-wheel activity will naturally align with the environmental light-dark cycle (LD cycle; e.g. 12 hr-light:12 hr-dark). However circadian rhythms are endogenously generated patterns in behavior that exhibit a ~24 hr period, and persist in constant darkness. Thus, in the absence of an LD cycle, the recording and analysis of running-wheel activity can be used to determine the subjective time-of-day. Because these rhythms are directed by the circadian clock the subjective time-of-day is referred to as the circadian time (CT). In contrast, when an LD cycle is present, the time-of-day that is determined by the environmental LD cycle is called the zeitgeber time (ZT).
Although circadian rhythms in running-wheel activity are typically linked to the SCN clock6-8, circadian oscillators in many other regions of the brain and body9-14 could also be involved in the regulation of daily activity rhythms. For instance, daily rhythms in food-anticipatory activity do not require the SCN15,16 and instead, are correlated with changes in the activity of extra-SCN oscillators17-20. Thus, running-wheel activity recordings can provide important behavioral information not only about the output of the master SCN clock, but also on the activity of extra-SCN oscillators. Below we describe the equipment and methods used to record, analyze and display circadian locomotor activity rhythms in laboratory rodents.

Circadian rhythms in voluntary wheel-running activity in mammals are tightly coupled to the molecular oscillations of a master clock in the brain. As such, these daily rhythms in behavior can be used to study the influence of genetic, pharmacological, and environmental factors on the functioning of this circadian clock.

げっ歯類におけるランニングホイール活動の概日リズムの記録および分析

When rodents have free access to a running wheel in their home cage, voluntary use of this wheel will depend on the time of day1-5. Nocturnal rodents, ...

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the underlying neuronal components in the circuits1-6. Application of optogenetics7,8 in the larval neural circuit allows us to manipulate neuronal activity in spatially and temporally patterned ways9-13. Typically, specimens are broadly illuminated with a mercury lamp or LED, so specificity of the target neurons is controlled by binary gene expression systems such as the Gal4-UAS system14,15. In this work, to improve the spatial resolution to "sub-genetic resolution", we locally illuminated a subset of neurons in the ventral nerve cord using lasers implemented in a conventional confocal microscope. While monitoring the motion of the body wall of the semi-intact larvae, we interactively activated or inhibited neural activity with channelrhodopsin16,17 or halorhodopsin18-20, respectively. By spatially and temporally restricted illumination of the neural tissue, we can manipulate the activity of specific neurons in the circuit at a specific phase of behavior. This method is useful for studying the relationship between the activities of a local neural assembly in the ventral nerve cord and the spatiotemporal pattern of motor output.

Optogenetic Perturbation of Neural Activity with Laser Illumination in Semi-intact Drosophila Larvae in Motion

Here we describe a protocol for optogenetic manipulation of motoneuronal activity while monitoring changes in motor output (muscle contraction) in semi-intact Drosophila larvae using lasers within a conventional confocal microscope. This technique enables researchers to achieve local perturbation of neural activity in a few neuromeres to elucidate the dynamics of motor circuits.

半無傷でレーザー照射による神経活動のOptogeneticの摂動<em&gt;ショウジョウバエ</emイン·モーション&gt;幼虫

Drosophila larval locomotion is a splendid model system in developmental and physiological neuroscience, by virtue of the genetic accessibility of the ...

Neural Activity Propagation in an Unfolded Hippocampal Preparation with a Penetrating Micro-electrode Array

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in the hippocampus. The transverse hippocampal slice preparation is the most common tissue preparation to study hippocampus electrophysiology. A longitudinal hippocampal slice was also developed in order to investigate longitudinal connections in the hippocampus. The intact mouse hippocampus can also be maintained in vitro because its thickness allows adequate oxygen diffusion. However, these three preparations do not provide direct access to neural propagation since some of the tissue is either missing or folded. The unfolded intact hippocampus provides both transverse and longitudinal connections in a flat configuration for direct access to the tissue to analyze the full extent of signal propagation in the hippocampus in vitro. In order to effectively monitor the neural activity from the cell layer, a custom made penetrating micro-electrode array (PMEA) was fabricated and applied to the unfolded hippocampus. The PMEA with 64 electrodes of 200 &#181;m in height could record neural activity deep inside the mouse hippocampus. The unique combination of an unfolded hippocampal preparation and the PMEA provides a new in-vitro tool to study the speed and direction of propagation of neural activity in the two-dimensional CA1-CA3 regions of the hippocampus with a high signal to noise ratio.

We have developed an in vitro unfolded hippocampus which preserves CA1-CA3 array of neurons. Combined with the penetrating micro-electrode array, neural activity can be monitored in both the longitudinal and transverse orientations. This method provides advantages over hippocampal slice preparations as the propagation in the entire hippocampus can be recorded simultaneously.

地中マイクロ電極アレイと非折り畳み海馬準備神経活動の伝播

This protocol describes a method for preparing a new in vitro flat hippocampus preparation combined with a micro-machined array to map neural activity in ...

Extracellular Recording of Neuronal Activity Combined with Microiontophoretic Application of Neuroactive Substances in Awake Mice

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and awake animals. Therefore, methods allowing the manipulation of synaptic systems in awake animals are required in order to determine the contribution of synaptic inputs to neuronal processing unaffected by anesthetics. Here, we present methodology for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. By combining these procedures, we performed microiontophoretic injections of gabazine to selectively block GABAA receptors in neurons of the inferior colliculus of head-restrained mice. Gabazine successfully modified neural response properties such as the frequency response area and stimulus-specific adaptation. Thus, we demonstrate that our methods are suitable for recording single-unit activity and for dissecting the role of specific neurotransmitter receptors in auditory processing.
The main limitation of the described procedure is the relatively short recording time (~3 hr), which is determined by the level of habituation of the animal to the recording sessions. On the other hand, multiple recording sessions can be performed in the same animal. The advantage of this technique over other experimental procedures used to manipulate the level of neurotransmission or neuromodulation (such as systemic injections or the use of optogenetic models), is that the drug effect is confined to the local synaptic inputs to the target neuron. In addition, the custom-manufacture of electrodes allows adjustment of specific parameters according to the neural structure and type of neuron of interest (such as the tip resistance for improving the signal-to-noise ratio of the recordings).

We present methods for the construction of electrodes to simultaneously record extracellular neural activity and release multiple neuroactive substances at the vicinity of the recording sites in awake mice. This technique allows the detailed analysis of putative local synaptic inputs to the neuron of interest.

覚醒マウスにおける神経活性物質のMicroiontophoreticアプリケーションと組み合わせることで神経活動の細胞外記録

Differences in the activity of neurotransmitters and neuromodulators, and consequently different neural responses, can be found between anesthetized and ...

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. However, there is piling evidence that olfaction is not solely limited to chemical sensitivity, but also includes temperature sensitivity. Premetamorphic Xenopus laevis are translucent animals, with protruding nasal cavities deprived of the cribriform plate separating the nose and the olfactory bulb. These characteristics make them well suited for studying olfaction, and particularly thermosensitivity. The present article describes the complete procedure for measuring temperature responses in the olfactory bulb of X. laevis larvae. Firstly, the electroporation of olfactory receptor neurons (ORNs) is performed with spectrally distinct dyes loaded into the nasal cavities in order to stain their axon terminals in the bulbar neuropil. The differential staining between left and right receptor neurons serves to identify the &#947;-glomerulus as the only structure innervated by contralateral presynaptic afferents. Secondly, the electroporation is combined with focal bolus loading in the olfactory bulb in order to stain mitral cells and their dendrites. The 3D brain volume is then scanned under line-illumination microscopy for the acquisition of fast calcium imaging data while small temperature drops are induced at the olfactory epithelium. Lastly, the post-acquisition analysis allows the morphological reconstruction of the thermosensitive network comprising the &#947;-glomerulus and its innervating mitral cells, based on specific temperature-induced Ca2+ traces. Using chemical odorants as stimuli in addition to temperature jumps enables the comparison between thermosensitive and chemosensitive networks in the olfactory bulb.

Recording Temperature-induced Neuronal Activity through Monitoring Calcium Changes in the Olfactory Bulb of Xenopus laevis

Here we describe a protocol for measuring and analyzing temperature responses in the olfactory bulb of Xenopus laevis. Olfactory receptor neurons and mitral cells are differentially stained, after which calcium changes are recorded, reflecting a sensitivity of some neural networks in the bulb to temperature drops induced at the nose.

の嗅球にカルシウム変化をモニタリングを通じて温度によって誘発される神経活動を記録<em&gt;アフリカツメガエル</em

The olfactory system, specialized in the detection, integration and processing of chemical molecules is likely the most thoroughly studied sensory system. ...

Time-dependent Increase in the Network Response to the Stimulation of Neuronal Cell Cultures on Micro-electrode Arrays

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network dynamics in neuronal cultures. In contrast with more traditional methods, such as patch-clamping, which can only record activity from a single cell, MEAs can record simultaneously from multiple sites in a network, without requiring the arduous task of placing each electrode individually. Moreover, numerous control and stimulation configurations can be easily applied within the same experimental setup, allowing for a broad range of dynamics to be explored. One of the key dynamics of interest in these in vitro studies has been the extent to which cultured networks display properties indicative of learning. Mouse neuronal cells cultured on MEAs display an increase in response following training induced by electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neuronal cells on MEAs; successfully record from over 95% of the plated dishes; establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation; and sort, plot, and interpret the results from such experiments. The use of a proprietary system for stimulating and recording neuronal cultures is demonstrated. Software packages are also used to sort neuronal units. A custom-designed graphical user interface is used to visualize post-stimulus time histograms, inter-burst intervals, and burst duration, as well as to compare the cellular response to stimulation before and after a training protocol. Finally, representative results and future directions of this research effort are discussed.

Mouse neuronal cells cultured on multi-electrode arrays display an increase in response following electrical stimulation. This protocol demonstrates how to culture neurons, how to record activity, and how to establish a protocol to train the networks to respond to patterns of stimulation.

マイクロ電極アレイにおけるニューロン細胞培養の刺激に対するネットワーク応答の時間依存的増加

Micro-electrode arrays (MEAs) can be used to investigate drug toxicity, design paradigms for next-generation personalized medicine, and study network ...

Quadruple Immunostaining of the Olfactory Bulb for Visualization of Olfactory Sensory Axon Molecular Identity Codes

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory Sensory Neuron (OSN) is a bipolar cell with a single dendrite and a single unbranched axon. An OSN expresses only one Olfactory Receptor (OR) gene, OSNs expressing a given type of OR converge their axons to a few sets of invariant glomeruli in the Olfactory Bulb (OB). A remarkable feature of OSN projection is that the expressed ORs play instructive roles in axonal projection. ORs regulate the expression of multiple axon-sorting molecules and generate the combinatorial molecular code of axon-sorting molecules at the OSN axon termini. Thus, to understand the molecular mechanisms of OR-specific axon guidance mechanisms, it is vital to characterize their expression profiles at the OSN axon termini within the same glomerulus. The aim of this article was to introduce methods for collecting as many glomeruli as possible on a single OB section and for performing immunostaining using multiple antibodies. This would allow the comparison and analysis of the expression patterns of axon-sorting molecules without staining variation between OB sections.

Olfactory sensory neurons express a wide variety of axon-sorting molecules to establish proper neural circuitry. This protocol describes an immunohistochemical staining method to visualize combinatorial expressions of axon-sorting molecules at the axon termini of olfactory sensory neurons.

嗅覚神経軸索分子識別コードの視覚化のための嗅球の四重免疫染色

The mouse olfactory system is often used to study mechanisms of neural circuit formation&#12288;because of its simple anatomical structure. An Olfactory ...

ローカスの神経活動を特徴づけるためにマルチユニット記録方法（

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