Este trabajo es apoyado por una subvención de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (No.31472037). La mención de nombres comerciales o productos comerciales en este artículo es únicamente con el propósito de proporcionar información específica y no implica recomendación.

NOTA: Para limitar la degradación del ARN, preparar soluciones usando agua destilada en autoclave húmedo (a 121 ° C durante 60 min) y también materiales de autoclave en húmedo. 1. Preparación de sondas antisentido y sensorial de ARN ISH <ol><li> Amplificación y purificación de genes diana <ol><li> En primer lugar, se produce un fragmento de doble cadena de 387 pb de L. migratoria OR1 ( LmigOR1 , GenBank: JQ766965) del plásmido que contiene el ADNc de longitud completa de LmigOR1 con una ADN polimerasa Taq que añade adeninas a ambos extremos de los fragmentos. <ol><li> Utilizar un volumen de reacción final de 100 mu l que contenga 50 mu l de mezcla de reacción 2x, 4 mu l de cebadores sentido y antisentido ( Tabla 1 ), 1 mu l de molde de plásmido y 41 mu l de H 2 O libre de RNasa. Protocolo: 94ºC durante 5 min, seguido de 30 ciclos de 94ºC durante 30 s, 55ºC durante 30 s y 72ºC durante 1 min, Seguido de 72 ° C durante 10 min. </li><li> Repita estos pasos para producir el fragmento de doble hebra de 1,303 pb de LmigOR2 (GenBank: JQ766966) y fragmento de doble hebra de 1,251 pb de LmigORco (GenBank: JN989549). Los cebadores utilizados en estos experimentos se presentan en la Tabla 1 . </li><li> Ejecutar productos de PCR en geles de agarosa al 1,2% en 1x tampón Tris-acetato-EDTA y visualizar usando tinción con bromuro de etidio. </li></ol></li><li> Extraer estos productos de PCR utilizando un kit de extracción de gel. <ol><li> Después de la electroforesis, extirpar las bandas de ADN del gel y colocar las rodajas de gel en un tubo de 1,5 ml. A continuación, añadir 100 μl de tampón de unión (tampón PN) por 0,1 g de rebanada de gel. Vórtice e incube a 50 ° C hasta que la rebanada de gel se disuelva completamente. </li><li> Insertar una columna de adsorción de CA2 en el tubo de recogida y añadir 500 μl de tampón de equilibrio (tampón BL). Esto mejora la capacidad de absorción y la estabilidad de la membrana de sílice. CentriFuge a 12.400 xg durante 1 min. </li><li> Transferir la mezcla de gel disuelto al conjunto de columna de adsorción e incubar a temperatura ambiente durante 2 min. A continuación, centrifugar los tubos a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida. </li><li> Añadir 600 μL de solución de lavado (etanol añadido, Buffer PW) dos veces. Centrifugar a 12.400 xg durante 1 min. Deseche el flujo y vuelva a insertar la columna de adsorción en el tubo de recogida. </li><li> Vaciar el tubo de recogida y recentrifugar el conjunto de la columna a 12.400 xg durante 2 min para permitir la evaporación de cualquier etanol residual. </li><li> Transfiera cuidadosamente la columna de adsorción a un tubo de centrífuga limpio de 1,5 ml. Secar al aire el gránulo durante 5-10 minutos y redisolver el ADN en un volumen adecuado ( por ejemplo, 30 μl) de agua libre de nucleasa. </li><li> Incubar a TA durante 2 min. Centrifugar a 12.400 xg durante 2 min. Desechar la columna de adsorción y almacenar el ADN a 4 ° C o -20 ° C. </li></ol></li></ol></li><li> Construir los plásmidos recombinantes <ol><li> Individualmente ligar el fragmento de 387 pb de LmigOR1, 1303 bp fragmento de LmigOR2 y 1251 bp fragmento de LmigORco en un vector de T que contiene promotores para la T7 (aguas arriba) y ARN polimerasas SP6 (aguas abajo) adyacente al DNA insertado utilizando ADN ligasa de T4. Preparar la siguiente reacción de 10 μl: 5 μl de tampón de ligación 2x, 1 μl de vector T, 3 μL (~100 ng) del ADN del gen insertado y 1 μl de ADN ligasa T4 e incubar O / N a 4 ° C. </li><li> Añadir 5 μl de cada plásmido recombinante que contiene el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y 1.251 pb de LmigORco por separado en 50 μl de células competentes de Escherichia coli DH5α en tubos estériles de 1,5 mL. <ol><li> Mezclar suavemente y poner los tubos en hielo durante 30 min y luego incubarlos durante 90 s a 42DO. Vuelva a colocarlos en hielo durante 3 min. </li><li> Añadir 450 μl de medio líquido Luria-Bertani (LB) sin ampicilina a cada tubo e incubarlos en un agitador a 150 rpm durante 1 h a 37 ° C para restaurar el E. coli DH5α. </li><li> Tomar una alícuota de 100 μl de cada transformante y usarlos para inocular placas de sustrato sólido LB que contengan ampicilina 50 μg / ml, β-D-1-tiogalactopiranósido isopropílico (IPTG) de 24 μg / mL y 40 μg / mL de 5-bromo-4 - cloro - 3 - indolil - beta - D - galactopiranósido (X - gal). </li><li> Incubar estas placas en una incubadora constante a 37 ° C durante 18 h. Se tamizan los plásmidos recombinantes diana usando el método de cribado azul-blanco. Secuencia de los plásmidos recombinantes diana utilizando la secuenciación de Sanger e identificar las tres OR direcciones de los insertos de los genes. </li></ol></li></ol></li><li> Seleccionar endonucleasas de restricción para linealizar plásmidos recombinantes <ol><li> Utilizar endonucleasas de restricción tNo sólo digieren en el sitio de clonación múltiple del vector, sino que tampoco cortan el ADN del inserto. En este experimento, todos los 3 genes se insertan en el vector T en la dirección correspondiente a la del vector. </li><li> Utilizar endonucleasa de restricción Nco I para linealizar los plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco para producir las sondas antisentido. Utilice la endonucleasa de restricción Sp e I para producir las sondas de detección. NOTA: Si la dirección de la inserción corresponde a la del vector, entonces se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de T7 para linealizar el plásmido recombinante y se utiliza ARN polimerasa SP6 para preparar la sonda antisentido. Se selecciona un sitio de restricción único desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante, y se usa la ARN polimerasa de T7 para preparar la sonda de detección. De lo contrario, si la dirección del inserto no corresponde a tLa dirección del vector, entonces se selecciona un único sitio de restricción desde el extremo de SP6 para linealizar el plásmido recombinante y se usa RNA polimerasa de T7 para preparar la sonda antisentido. El único sitio de restricción desde el extremo de T7 se selecciona para linealizar el plásmido recombinante, y la ARN polimerasa SP6 se ​​usa para preparar la sonda de detección. </li></ol></li><li> Purificación de los plásmidos recombinantes linealizados <ol><li> Digerir 20 μg de cada uno de los tres plásmidos recombinantes que contienen el fragmento de 387 pb de LmigOR1 , fragmento de 1.303 pb de LmigOR2 y fragmento de 1.251 pb de LmigORco usando la endonucleasa de restricción Nco I en una reacción de 100 μL que contiene 10 μl de tampón 10x, 40 μl de 0,5 mu g / mu l de plásmido, 3 mu l de Nco I y 47 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguido de una incubación de 3 h a 37ºC. </li><li> De forma similar, digerir 20 μg de cada uno de estos tres plásmidos recombinantes uCantar la endonucleasa de restricción Spe I. </li><li> Purificar estos plásmidos digeridos usando un kit de extracción en gel como se describe en 1.1.2. Determine las concentraciones de estos plásmidos recombinantes linealizados extraídos mediante espectrofotometría y ajuste a 0,5 μg / μl. </li></ol></li><li> Preparar sondas antisentido y sensorial <ol><li> Utilice el sistema de transcripción de ARN T7 / SP6 para generar sondas antisentido y sensorial. La ARN polimerasa SP6 se ​​utiliza para transcribir ARN bicatenario para sondas antisentido marcadas con DIG y biotina para estos tres genes OR usando plásmidos recombinantes linealizados como plantillas in vitro . La ARN polimerasa T7 se utiliza para producir sondas de detección. Realizar la reacción en un volumen final de 20 μL, que contiene 2 μl de mezcla NTP 10x, 2 μl de tampón de transcripción 10X, 1 μl de inhibidor de RNasa, 2 μl de ARN polimerasa T7 o SP6, 4 μl de 0,5 μg / μL de plásmido linealizado y 9 mu l de H _ { 2} O libre de RNasa, seguidoPor una incubación de 3 h a 37ºC. </li><li> Incubar las sondas antisentido y sensorial marcadas con DIG y biotina durante 30 min con 1 mu l de DNasa a 37ºC. Añadir 2,5 μL de LiCl 5 M y 75 μL de etanol absoluto, luego incubar las reacciones durante 30 minutos a -70 ° C. </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 30 minutos a 4 ° C. Cuidadosamente decantar el sobrenadante. Añadir 150 μl de etanol al 70% para lavar el precipitante. Preparar el etanol al 70% (1 L) añadiendo etanol al 95% (736,8 ml) a agua destilada estéril (263,2 ml). </li><li> Centrifugar a 15.000 xg durante 30 min a 4 ° C de nuevo y secar al aire el pellet durante 5-10 min a RT. Añadir 25 μL de H 2 O libre de RNasa para disolver las sondas antisentido y sensorial de ARN. </li><li> Si la longitud del gen insertado es mayor que 1 kb, posteriormente se fragmentan las sondas antisentido y de sentido inverso a una longitud media de ~ 300 pb por incubación en soluciones tampón bicarbonato-carbonato. Realizar la reacción en un volumen final de 50 μl, containing 25 l de la sonda de ARN y 25 l de la solución tampón de bicarbonato-carbonato (mM NaHCO3 80 mM, Na 120 2 CO 3, pH 10,2) a 60 ° C. El tiempo de hidrólisis requerido viene dado por una fórmula 17 previamente publicada. </li><li> Añadir 5 μl de ácido acético al 10% para detener la reacción. En este experimento, se fragmentan las sondas LmigOR2 y LmigORco antisentido y sentido durante 24 y 23 min, respectivamente. T = (L _ { o } - L _ { f} ) / k _ {X} o _ {XL} f L o = longitudes de los fragmentos iniciales en kb L f = longitud de los fragmentos finales en kb K = la constante de velocidad para la hidrólisis, aproximadamente 0,11 kb -1 min -1 T = tiempo de hidrólisis en min </li><li> Por último, añadir 250 μL de tampón de hibridación y almacenar a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparación de las secciones del criostato <ol><li> Precool el freeziNg hasta -24 ° C. </li><li> Seleccione las nuevas langostas adultos que mueven y están activas y tienen antenas intactas. Cortar las antenas en pedazos de 2-3 milímetros usando maquinillas de afeitar estériles. </li><li> Ponga el compuesto OCT en un soporte de micrótomo congelador y coloque una o dos muestras en el compuesto horizontalmente. Luego, transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C para equilibrar hasta que el compuesto se congela. Saque el soporte y cubra las muestras con un poco de compuesto. Transfiera el soporte al micrótomo de congelación a -24 ° C de nuevo durante al menos 10 minutos ( Figura 1 ). NOTA: Evite las burbujas en el compuesto. </li><li> Fijar el soporte con las muestras en el microtómulo de congelación, luego seccionar las muestras congeladas en cortes de 12 μm de grosor a -24 ° C. </li><li> Descongelar las rebanadas una por una en los portaobjetos (25 x 75 mm, sin nucleasas) y secar al aire durante 10 min. </li></ol> 3. Secciones de fijación <ol><li> Después de preparar el criostato(100 x 40 x 80 mm) y fijar los tejidos por incubación de los portaobjetos en solución de paraformaldehído (PFA) al 4% durante 30 min a 4 ° C. </li><li> Lavar las diapositivas en solución salina tamponada con fosfato 1X (PBS) durante 1 min. </li><li> Para eliminar las proteínas alcalinas, transferir los portaobjetos a HCl 0,2 M durante 10 min. </li><li> Para eliminar la proteína superficial del ácido nucleico, transferir los portaobjetos a 1XPBS con 1% de Triton X-100 durante 2 min. </li><li> Lavar los portaobjetos dos veces durante 30 s en 1x PBS. </li><li> Finalmente, enjuague los portaobjetos en solución de formamida durante 10 min a 4 ° C. </li></ol> 4. Hibridación <ol><li> Preparar las sondas antisentido y de sentido <ol><li> Utilizar un tampón de hibridación para diluir las sondas antisentido o sensorial de ARN en los tubos libres de nuclease de 1,5 ml. En este experimento, para todas las sondas antisentido y sensorial ( LmigOR1, LmigOR2 y LmigOrco ), añadir 1 μl de sonda a 99 μL de hibridación por diapositiva. Generalmente, el uso de diluciones 1: 100 de sondas antisentido produce señales positivas significativas y fondos bajos usando este protocolo. </li><li> Para la detección cromogénica, diluir las sondas marcadas con DIG individualmente. </li><li> Para la detección de TSA, diluir DIG-etiquetados LmigOR1 con biotina marcado LmigOrco sondas o DIG-etiquetados LmigOR2 con biotina marcado LmigOR1 sondas en conjunto en el buffer de hibridación. </li><li> Calentar las diluciones durante 10 min a 65 ° C y ponerlas en hielo durante al menos 5 min. </li></ol></li><li> Hibridación <ol><li> Escurrir las diapositivas y añadir 100 μ l de antisentido diluido y sentido sondas (Paso 4.1) a las secciones de tejido. Luego, coloque cubreobjetos (24 mm x 50 mm, sin nucleasa) en las secciones de tejido. </li><li> Coloque los portaobjetos cubiertos horizontalmente en una caja húmeda (~ 300 x 180 x 50 mm 3 , Figura 2 ) e incube unaT 55ºC durante 22 h. Agregue solución de formamida o 1X PBS al fondo de la caja para mantener el ambiente húmedo, pero no sumerja las diapositivas en el líquido. </li></ol></li><li> Lavado y bloqueo. <ol><li> Después de la hibridación, retire los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas dos veces durante 30 minutos en 0.1x Citrato de Sodio Salino (SSC) a 60 ° C. NOTA: El lavado significa colocar los portaobjetos en un soporte de portaobjetos que luego se coloca en un recipiente de plástico y agitar suavemente sobre un balancín (~ 50 rpm; Figura 2 ). </li><li> Enjuague los portaobjetos en 1x solución salina tamponada con Tris (TBS) durante 30 s. </li><li> Añadir 1 ml de reactivo de bloqueo al 1% en TBS suplementado con Triton X-100 al 0,03% en cada diapositiva, e incubar durante 30 min. Luego, deseche la solución de bloqueo. </li></ol></li><li> Inmunohistoquímica. <ol><li> Para la detección cromogénica, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 unidades (U) / mL de antibota-anti-digoxigenina conjugada con antiboDy a 1,5 U / mL AP solución. Agregue 100 μl de solución de AP por cada diapositiva cubierta (24 mm x 50 mm). </li><li> Para la detección de TSA, utilice un reactivo de bloqueo en TBS para diluir 750 U / ml de anticuerpo conjugado con anti-digoxigenina AP y anticuerpo conjugado con antipatina de estreptavidina anti-biotina a la solución de AP / HRP. Añadir 100 μl de solución de AP / HRP por una lámina cubierta (24 mm x 50 mm). </li><li> Incubar los portaobjetos en una caja húmeda ( Figura 2 ) durante 60 minutos a 37 ° C. Utilice la solución de formamida o 1X PBS para mantener la caja húmeda pero no empapada. </li></ol></li></ol> 5. Tinción <ol><li> Quite los cubreobjetos cuidadosamente. Lavar las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. Enjuagar los portaobjetos en tampón DAP (detección cromogénica: pH 9,5, detección de TSA: pH 8,0) durante 5 min. </li><li> Tinción (detección cromogénica) <ol><li> Añadir 100 μl de NBT (375 μg / ml) / BCIP (188 μg / ml) solución de sustrato (diluida en DAP;PH 9,5) a cada diapositiva. Cuidadosamente colocar cubreobjetos (24 x 50 mm) en las diapositivas. </li><li> Incubar los portaobjetos en una caja húmeda con solución de sustrato durante 10 min - O / N a 37 ° C. NOTA: Compruebe el desarrollo mirando las diapositivas de vez en cuando bajo el microscopio. </li><li> Cuando el desarrollo esté listo, detenga la reacción transfiriendo los portaobjetos al agua. </li></ol></li><li> Tinción (detección de TSA) <ol><li> Utilice una jeringa para mover el sustrato HNPP (100 μg / ml) / rojo rápido (250 μg / ml) del filtro de jeringa (0,22 μm, Figura 2 ). </li><li> Agregue 100 μl de sustrato HNPP / Fast Red por cada diapositiva cubierta con un cubreobjetos (24 x 50 mm). Incubar las diapositivas durante 30 min con HNPP / Fast Red sustrato a RT. </li><li> Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave los portaobjetos tres veces durante 5 min en 1X TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. </li><li> Utilizar 100 μl de sustrato TSA / cubierto (24 x 50 mm 2 ) deslizamiento. Incubar los portaobjetos con sustrato TSA durante 10 minutos a TA. </li><li> Retire los cubreobjetos cuidadosamente y lave las diapositivas tres veces durante 5 min en 1x TBS suplementado con Tween-20 al 0,05%. </li></ol></li><li> Incrustar las diapositivas en PBS / glicerol (1: 3). NOTA: Después de terminar estos procedimientos, las diapositivas deben ser observadas tan pronto como sea posible porque la señal fluorescente se apagará rápidamente. </li></ol> 6. Observación <ol><li> Detección cromogénica <ol><li> Observe las secciones de tejido usando un microscopio óptico. Elija las lentes objetivo 10X, 20X y 40X para observar los resultados de la detección cromogénica. </li><li> Utilice el software DP-BSW para analizar los resultados y capturar las imágenes. </li></ol></li><li> Detección de TSA <ol><li> Observe las secciones de tejido usando un microscopio confocal. Los genes marcados con DIG deben observarse bajo luz de 543 nm, presentando un color rojo, y los genes marcados con biotina deben serObservado bajo luz 488 nm, presentando un color verde. Cuando emergen, presentan color amarillo. </li><li> Elija las lentes objetivo 20X y 40X para observar los resultados de la detección de TSA, respectivamente. </li><li> Utilice el software FV1000 para analizar los resultados y capturar las imágenes. </li></ol></li></ol>

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C., Wilkinson, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ.+hybridization+to+cellular+RNA+with+radiolabelled+RNA+probes.">In situ. hybridization to cellular RNA with radiolabelled RNA probes.</a> In situ hybridization. , 2 (1992).</li><li>Komminoth, P., Merk, F. B., Leav, I., Wolfe, H. J., Roth, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+35S-+and+digoxigenin-labeled+RNA+and+oligonucleotide+probes+for+in+situ+hybridization.+Expression+of+mRNA+of+the+seminal+vesicle+secretion+protein+II+and+androgen+receptor+genes+in+the+rat+prostate.">Comparison of 35S- and digoxigenin-labeled RNA and oligonucleotide probes for in situ hybridization. Expression of mRNA of the seminal vesicle secretion protein II and androgen receptor genes in the rat prostate.</a> Histochemistry. 98 (4), 217-228 (1992).</li><li>Leary, J. J., Brigati, D. J., Ward, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+and+sensitive+colorimetric+method+for+visualizing+biotin-labeled+DNA+probes+hybridized+to+DNA+or+RNA+immobilized+on+nitrocellulose:+Bio-blots.">Rapid and sensitive colorimetric method for visualizing biotin-labeled DNA probes hybridized to DNA or RNA immobilized on nitrocellulose: Bio-blots.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 80 (13), 4045-4049 (1983).</li><li>Hallem, E. A., Ho, M. G., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+molecular+basis+of+odor+coding+in+the+Drosophila+antenna.">The molecular basis of odor coding in the Drosophila antenna.</a> Cell. 117 (7), 965-979 (2004).</li><li>Jones, W. D., Nguyen, T. A., Kloss, B., Lee, K. J., Vosshall, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+conservation+of+an+insect+odorant+receptor+gene+across+250+million+years+of+evolution.">Functional conservation of an insect odorant receptor gene across 250 million years of evolution.</a> Curr Biol. 15 (4), R119-R121 (2005).</li></ol>

Los autores no tienen nada que revelar o cualquier otro conflicto de intereses.

Es difícil realizar ARN ISH para localizar los genes OR en las antenas de insectos porque los niveles de expresión de los genes OR, excepto ORco , son muy bajos y preservar cortes histológicos de antenas de insectos es muy difícil. Además, la detección de TSA es también muy difícil. Para abordar estos problemas, deben tomarse las siguientes medidas. Las antenas se seleccionan de las langostas adultas de nueva mutación que tienen cutículas antenales finas y suaves, que mantienen su morfología en la di...

Las antenas de insectos, que son los órganos chemosensoriales más importantes, están cubiertas con muchas estructuras similares a los cabellos - llamadas sensilla - que son inervadas por las Neuronas Receptoras Olfativas (ORNs). En la membrana de los ORNs de insectos, los receptores de olor (OR), un tipo de proteína que contiene siete dominios transmembrana, se expresan con un coreceptor (ORco) para formar un heterómero que funciona como un canal iónico odorante 1 , 2 , 3 . Diferentes RUP responden a diferentes combinaciones de compuestos químicos 4 , 5 , 6 . Las langostas ( Locusta migratoria ) se basan principalmente en señales olfativas para desencadenar comportamientos importantes 7 . Las ER de langostas son factores clave para la comprensión de los mecanismos olfatorios moleculares. Localización de un gen específico de la langosta OR en la neurona de un genMorfológicamente específico sensillum tipo por RNA In Situ Hybridization (RNA ISH) es el primer paso en la exploración de la función de las RUP. El ARN ISH utiliza una sonda de ARN complementario marcada para medir y localizar una secuencia de ARN específica en una sección de tejido, células o montajes enteros in situ , proporcionando información sobre los procesos fisiológicos y la patogénesis de la enfermedad. Las sondas de ARN marcadas con digoxigenina (marcadas con DIG) y marcadas con biotina se han usado ampliamente en la hibridación de ARN. El marcado de ARN con digoxigenina-11-UTP o biotina-16-UTP puede prepararse mediante transcripción in vitro con ARN polimerasas SP6 y T7. Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina tienen las siguientes ventajas: no radiactivas; seguro; estable; altamente sensible; Altamente específicos; Y fácil de producir utilizando PCR y transcripción in vitro . Las sondas de ARN marcadas con DIG y biotina pueden ser detectadas cromogénicamente y fluorescentemente. Las sondas de ARN marcadas con DIG pueden detectarse con Alkali anti-digoxigeninaNe Se pueden visualizar anticuerpos conjugados con fosfatasa (AP) que pueden visualizarse con los sustratos quimioluminiscentes altamente sensibles cloruro de tetrazolio / sal de toluidina de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (NBT / BCIP) usando un microscopio óptico o con 2 -hidroxi-3-naftoico (HNPP) acoplado con sal de cloruro de hemi-zinc de 4-cloro-2-metilbencenodiazonio (Fast Red) usando un microscopio confocal. Las sondas de ARN marcadas con biotina se pueden detectar con anticuerpos conjugados con anti-biotina streptavidina de rata de caballo peroxidasa (HRP) que se pueden visualizar con fluoresceína-tiramidas usando un microscopio confocal. De este modo, la hibridación in situ fluorescente de doble color puede realizarse para detectar dos genes diana en una rebanada usando sondas de ARN marcadas con DIG y biotina. El ARN ISH con sondas marcadas con DIG y / o biotina se ha utilizado con éxito para localizar genes relacionados con el olfato, tales como OR , receptor ionotrópico, proteína de unión al odoranteY la proteína de membrana de la neurona sensorial, en antenas de insectos de, pero sin limitarse a, Drosophila melanogaster , Anopheles gambiae , L. migratoria y la langosta del desierto Schistocera gregaria 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 . Sin embargo, existen dos desafíos sustanciales al realizar RNA ISH para OR de insectos: (1) OR genes (excepto ORco ) se expresan en niveles bajos y sólo en unas pocas células, dificultando la detección de señales y (2) preservando tejido de insecto para Histología, de modo que la morfología se conserva y el ruido de fondo es bajo, puede ser un reto. En este artículo un protocolo detallado y eficaz que describe el ARN ISH para la localización de genes OR en insectosAntenas, incluyendo tanto la detección cromogénica como la de Tyramide Signal Amplification (TSA).

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2&amp;times;TSINGKE&lt;sup&gt;TM&lt;/sup&gt; Master Mix</td><td>TSINGKE, China</td><td>TSE004</td><td></td></tr><tr><td>RNase-free H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>TIANGEN, China</td><td>RT121-02</td><td></td></tr><tr><td>REGULAR AGAROSE G-10</td><td>BIOWEST, SPAIN</td><td>91622</td><td></td></tr><tr><td>Binding buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Balance buffer</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>Wash solution</td><td>TIANgel Midi Purification Kit, TIANGEN, China</td><td>DP209-02</td><td></td></tr><tr><td>T Vector</td><td>Promega, USA</td><td>A362A</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Promega, USA</td><td>M180A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Escherichia coli&lt;/em&gt; DH5&amp;alpha;</td><td>TIANGEN, China</td><td>CB101</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma, USA</td><td>A-6140</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &amp;beta;-D-1-thiogalactopyranoside</td><td>Inalco, USA</td><td>1758-1400</td><td></td></tr><tr><td>5-bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>SBS Genetech, China</td><td>GX1-500</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Nco&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0193S</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Spe&lt;/em&gt; I</td><td>BioLabs, New England</td><td>R0133M</td><td></td></tr><tr><td>DIG RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>Biotin RNA Labeling Kit</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11685597910</td><td></td></tr><tr><td>DNase</td><td>DIG RNA Labeling Kit, Roche, Switzerland</td><td>11175025910</td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>10012718</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10009257</td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Sakura Finetek Europe, Zoeterwoude, Netherlands</td><td>4583</td><td></td></tr><tr><td>Slides</td><td>TINA JIN HAO YANG BIOLOGCAL MANUFACTURE CO., LTE, China</td><td>FISH0010</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sinopharm, China</td><td>80070591</td><td></td></tr><tr><td>Millex</td><td>Millipore, USA</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0777-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium chloride / 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate toluidine salt</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Sinopharm, China</td><td>10010618</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Solutions&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>0.04 mol/L Tris-Base</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>BEIJING CHEMICAL REGENTS COMPANY, China</td><td>10000292</td><td>0.12% acetic acid</td></tr><tr><td>1&amp;times;Tris-acetate-EDTA</td><td>Sigma, USA</td><td>03677</td><td>Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt (EDTA)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>Luria-Bertani (LB) liquid medium</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>10 g/L NaCl</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM335231</td><td>10 g/L Peptone from casein (Tryptone)</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>MERCK, Germany</td><td>VM361526</td><td>5 g/L Yeast extract</td></tr><tr><td>LB solid substrate plate</td><td>WISENT ING, Canada</td><td>800-010-CG</td><td>15 g/L Agar Bacteriological Grade</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>8.5% NaCl</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900041-500G</td><td>14 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Phosphate-Buffered Saline (PBS, pH 7.1)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900268-500G</td><td>80 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>1 M Tris-Base</td></tr><tr><td>10&amp;times;Tris-Buffered Saline (TBS, pH 7.5)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>1.5 M NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900483-1KG</td><td>100 mM Tris-Base</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>100 mM NaCl</td></tr><tr><td>Detection Buffer (DAP) &amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; chromogenic detection pH 9.5&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp; TSA detection pH 8.0</td><td>Sigma, USA</td><td>V900020-500G</td><td>50 mM MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;middot;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sinopharm, China</td><td>10019392</td><td>3 M NaCl</td></tr><tr><td>20&amp;times;saline-sodium citrate (pH 7.0)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900095-500G</td><td>0.3 M Na-Citrate</td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde solution (PFA, pH 9.5)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900894-100G</td><td>4% paraformaldehyde</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>0.1 M NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>V900182-500G</td><td>80 mM NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Sodium Carbonate Buffer (pH 10.2)</td><td>Sigma, USA</td><td>S7795-500G</td><td>120 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;CO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Formamide Solution (pH 10.2)</td><td></td><td></td><td>5&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1% Blot</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td>AMRESCO, USA</td><td>0694-500ML</td><td>0.03% Triton X-100</td></tr><tr><td>Blocking Buffer in TBS</td><td></td><td></td><td>1&amp;times;Tris buffered saline</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11175041910</td><td>1.5 U/mL anti-digoxigenin alkaline phosphatase conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>1% anti-biotin streptavidin horse radish peroxidase- conjugated antibody</td></tr><tr><td>Alkaline phosphatase/ horse radish peroxidase solution</td><td></td><td></td><td>Blocking Buffer in TBS</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>MPBIO, USA</td><td>FORMD002</td><td>50% Deionized Formamide</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td></td><td></td><td>2&amp;times;saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D8906-50G</td><td>10% dextran sulphate</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>invitrogen, USA</td><td>AM7119</td><td>20 &amp;micro;g/mL yeast t-RNA</td></tr><tr><td>Hybridization Buffer</td><td>Sigma, USA</td><td>D3159-10G</td><td>0.2 mg/mL herring sperm DNA</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate (10 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td>Roche, Switzerland</td><td>11758888001</td><td>1% 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt (25 mg/mL)</td></tr><tr><td>2-hydroxy-3-naphtoic acid-2&#039;-phenylanilide phosphate/ 4-chloro-2-methylbenzenediazonium hemi-zinc chloride salt substrate</td><td></td><td></td><td>Detection Buffer</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>2% fluorescein-tyramides</td></tr><tr><td>Tyramide signal amplification substrate</td><td>TSA kit, Perkin Elmer, USA</td><td>NEL701A001KT</td><td>Amplification Diluent</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freezing microtome</td><td>Leica, Nussloch, Germany</td><td>Jung CM300 cryostat</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo SCIENTIFIC, USA</td><td>NANODROP 2000</td><td></td></tr><tr><td>Optical microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus IX71microscope</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>Olympus, Tokyo, Japan</td><td>Olympus BX45 confocal microscope</td><td></td></tr></tbody></table>

localization of odorant receptor genes in locust antennae by rna in situ hybridization

Los insectos han desarrollado sofisticados sistemas de recepción olfativa para detectar señales químicas exógenas. Estas señales químicas son transducidas por neuronas receptoras olfativas (ORN) alojadas en estructuras similares a los cabellos, llamadas chemosensilla, de las antenas. En las membranas de los ORN, se cree que los receptores de olor (OR) están implicados en la codificación de los olores. Por lo tanto, ser capaz de identificar genes localizados a los ORNs es necesario para reconocer los genes OR, y proporciona una base fundamental para la posterior funcional in situ estudios. Los niveles de expresión de ARN específicos de ORs en las antenas de insectos son muy bajos, y preservar el tejido de insectos para la histología es un reto. Por lo tanto, es difícil localizar un OR a un tipo específico de sensilla utilizando ARN hibridación in situ. En este artículo, se introduce un detallado y altamente eficaz ARN in situ protocolo de hibridación en particular para los genes O poco expresados ​​de insectos. Además, un OR específico Gene waS identificados mediante la realización de dos experimentos de hibridación fluorescente in situ utilizando un gen del receptor coexpresor, Orco , como marcador.

Con la detección cromogénica, un pequeño subconjunto de las células de la antena en cada sección de la antena de adultos se denota por DIG-etiquetados LmigOR1 y LmigOR2 antisentido sondas ( Figura 3 ]. RNA ISH en secciones consecutivas para localizar LmigOR1 y LmigOR2 mostró que las células antenales que expresan los dos genes se localizaron en ORN clusters que expresan LmigORco , lo que indica que...

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Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

Este artículo describe un protocolo de hibridación in situ detallado y altamente eficaz, especialmente para los genes de receptores Odorantes expresados ​​de bajo nivel (OR), así como otros genes, en antenas de insectos usando sondas marcadas con biotina o marcadas con digoxigenina (DIG).

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA<em&gt; In Situ</em&gt; Hibridación

Insects have evolved sophisticated olfactory reception systems to sense exogenous chemical signals. These chemical signals are transduced by Olfactory ...

localization-odorant-receptor-genes-locust-antennae-rna-situ

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Localization of Odorant Receptor Genes in Locust Antennae by RNA In Situ Hybridization

8.0K vistas.  China Agricultural University.  Este artículo describe un protocolo de hibridación in situ detallado y altamente eficaz, especialmente para los genes de receptores Odorantes expresados ​​de bajo nivel (OR), así como otros genes, en antenas de insectos usando sondas marcadas con biotina o marcadas con digoxigenina (DIG). 

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Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed in sensory hairs called sensilla, which cover the surface of olfactory organs. The surface of each sensillum is covered with tiny pores, through which odorants pass and dissolve in a fluid called sensillum lymph, which bathes the sensory dendrites of the OSNs housed in a given sensillum. The OSN dendrites express odorant receptor (OR) proteins, which in insects function as odor-gated ion channels4, 5. The interaction of odorants with ORs either increases or decreases the basal firing rate of the OSN. This neuronal activity in the form of action potentials embodies the first representation of the quality, intensity, and temporal characteristics of the odorant6, 7.
Given the easy access to these sensory hairs, it is possible to perform extracellular recordings from single OSNs by introducing a recording electrode into the sensillum lymph, while the reference electrode is placed in the lymph of the eye or body of the insect. In Drosophila, sensilla house between one and four OSNs, but each OSN typically displays a characteristic spike amplitude. Spike sorting techniques make it possible to assign spiking responses to individual OSNs. This single sensillum recording (SSR) technique monitors the difference in potential between the sensillum lymph and the reference electrode as electrical spikes that are generated by the receptor activity on OSNs1, 2, 8. Changes in the number of spikes in response to the odorant represent the cellular basis of odor coding in insects. Here, we describe the preparation method currently used in our lab to perform SSR on Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae, and show representative traces induced by the odorants in a sensillum-specific manner.

Single Sensillum Recordings in the Insects Drosophila melanogaster and Anopheles gambiae

Electrophysiological responses of olfactory sensory neurons to odorants can be measured in insects using single sensillum recordings. In this video article we will demonstrate how to perform single sensillum recordings in the antennae of the vinegar fly (Drosophila melanogaster) and the maxillary palps of the malaria mosquito (Anopheles gambiae).

Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae</em

The sense of smell is essential for insects to find foods, mates, predators, and oviposition sites3. Insect olfactory sensory neurons (OSNs) are enclosed ...

Investigación

Neurociencias

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust (Schistocerca Americana) Olfactory Circuits

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar olfactory systems suggesting that the biological approach to chemical sensing has been optimized over evolutionary time1. In the insect olfactory system, odorants are transduced by olfactory receptor neurons (ORN) in the antenna, which convert chemical stimuli into trains of action potentials. Sensory input from the ORNs is then relayed to the antennal lobe (AL; a structure analogous to the vertebrate olfactory bulb). In the AL, neural representations for odors take the form of spatiotemporal firing patterns distributed across ensembles of principal neurons (PNs; also referred to as projection neurons)2,3. The AL output is subsequently processed by Kenyon cells (KCs) in the downstream mushroom body (MB), a structure associated with olfactory memory and learning4,5. Here, we present electrophysiological recording techniques to monitor odor-evoked neural responses in these olfactory circuits.
First, we present a single sensillum recording method to study odor-evoked responses at the level of populations of ORNs6,7. We discuss the use of saline filled sharpened glass pipettes as electrodes to extracellularly monitor ORN responses. Next, we present a method to extracellularly monitor PN responses using a commercial 16-channel electrode3. A similar approach using a custom-made 8-channel twisted wire tetrode is demonstrated for Kenyon cell recordings8. We provide details of our experimental setup and present representative recording traces for each of these techniques.

Multi-unit Recording Methods to Characterize Neural Activity in the Locust Schistocerca Americana Olfactory Circuits

We demonstrate variations of the extracellular multi-unit recording technique to characterize odor-evoked responses in the first three stages of the invertebrate olfactory pathway. These techniques can easily be adapted to examine ensemble activity in other neural systems as well.

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (<em&gt; Schistocerca americana</em&gt;) Circuitos olfativas

Detection and interpretation of olfactory cues are critical for the survival  of many organisms. Remarkably, species across phyla have strikingly similar ...

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and behavioral evolution. Drosophila olfactory tissues house the olfactory receptor neurons (ORNs) that detect volatile chemical cues in addition to hydro- and thermo-sensory neurons. In this protocol, we describe the dissection of developing peripheral olfactory tissue of the adult Drosophila species. We first describe how to stage and age Drosophila larvae, followed by the dissection of the antennal disc from early pupal stages, followed by the dissection of the antennae from mid-pupal stages and adults. We also show methods where preparations can be utilized in molecular techniques, such as the RNA extraction for qRT-PCR, RNAseq, or immunohistochemistry. These methods can also be applied to other Drosophila species after species-specific pupal development times are determined, and respective stages are calculated for appropriate aging.

Preparing Developing Peripheral Olfactory Tissue for Molecular and Immunohistochemical Analysis in Drosophila

Here, we present a protocol to stage and dissect developing olfactory tissue from Drosophila species. The dissected tissue can later be used for molecular analyses, such as quantitative RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction) or RNA sequencing (RNAseq), as well as in vivo analyses such as immunohistochemistry or in situ hybridization.

Preparación de desarrollar tejido olfatorio periférico para Molecular y el análisis de Immunohistochemical en Drosophila

The olfactory system of Drosophila is a widely used system in developmental neurobiology, systems neuroscience, as well as neurophysiology, behavior, and ...

Biología del Desarrollo

Using Insect Electroantennogram Sensors on Autonomous Robots for Olfactory Searches

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects foraging for food or searching for mates3: the olfactory search is constrained by the physics of turbulent transport4. The concentration landscape of wind borne odors is discontinuous and consists of sporadically located patches. A pre-requisite to olfactory search is that intermittent odor patches are detected. Because of its high speed and sensitivity5-6, the olfactory organ of insects provides a unique opportunity for detection. Insect antennae have been used in the past to detect not only sex pheromones7 but also chemicals that are relevant to humans, e.g., volatile compounds emanating from cancer cells8 or toxic and illicit substances9-11. We describe here a protocol for using insect antennae on autonomous robots and present a proof of concept for tracking odor plumes to their source. The global response of olfactory neurons is recorded in situ in the form of electroantennograms (EAGs). Our experimental design, based on a whole insect preparation, allows stable recordings within a working day. In comparison, EAGs on excised antennae have a lifetime of 2 hr. A custom hardware/software interface was developed between the EAG electrodes and a robot. The measurement system resolves individual odor patches up to 10 Hz, which exceeds the time scale of artificial chemical sensors12. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is further demonstrated in driving the robot toward a source of pheromone. By using identical olfactory stimuli and sensors as in real animals, our robotic platform provides a direct means for testing biological hypotheses about olfactory coding and search strategies13. It may also prove beneficial for detecting other odorants of interests by combining EAGs from different insect species in a bioelectronic nose configuration14 or using nanostructured gas sensors that mimic insect antennae15.

We describe a protocol for using insect antennae in the form of electroantennograms (EAGs) on autonomous robots. Our experimental design allows stable recordings within a day and resolves individual odor patches up to 10 Hz. The efficiency of EAG sensors for olfactory searches is demonstrated in driving a robot toward an odor source.

El uso de insectos electroantenograma Sensores de Robots Autónoma de Búsquedas olfativas

Robots designed to track chemical leaks in hazardous industrial facilities1 or explosive traces in landmine fields2 face the same problem as insects ...

Electroantennography-based Bio-hybrid Odor-detecting Drone using Silkmoth Antennae for Odor Source Localization

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their applicability in environmental and security monitoring and search-and-rescue operations. Small drones with commercial metal-oxide-semiconductor (MOX) gas sensors have been developed for odor source localization; however, their real-time-odor-detection performance has proven inadequate. However, biosensing technologies based on insect olfactory systems exhibit relatively high sensitivity, selectivity, and real-time response with respect to odorant molecules compared to commercial MOX gas sensors. In such devices, excised insect antennae function as portable odorant biosensor elements and have been found to deliver excellent sensing performance. This study presents experimental protocols for odorant-molecule detection in the air using a small autonomous bio-hybrid drone based on a mountable electroantennography (EAG) device incorporating silkmoth antennae.
We developed a mountable EAG device including sensing/processing parts with a Wi-Fi module. The device was equipped with a simple sensor enclosure to enhance the sensor directivity. Thus, odor source localization was conducted using the spiral-surge algorithm, which does not assume an upwind direction. The experimental bio-hybrid odor-detecting drone identified real-time odorant-concentration differences in a pseudo-open environment (outside a wind tunnel) and localized the source. The developed drone and associated system can serve as an efficient odorant molecule-detection tool and a suitable flight platform for developing odor source localization algorithms owing to its high programmability.

This study introduces experimental protocols for a bio-hybrid odor-detecting drone based on silkmoth antennae. The operation of an experimental electroantennogram device with silkmoth antennae is presented, in addition to the structure of a bio-hybrid drone designed for odor source localization using the spiral-surge algorithm.

Drone bio-híbrido de detección de olores basado en electroantennografía utilizando antenas Silkmoth para la localización de fuentes de olor

Small drones with chemical or biosensor devices that can detect airborne odorant molecules have attracted considerable attention owing to their ...

Ingeniería

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for maintenance, repair or neurodegeneration in postdevelopmental periods. High throughput analyses have recently revealed that axons have a more dynamic and complex transcriptome than previously expected. These analysis, however have been mostly done in cultured neurons where axons can be isolated from the somato-dendritic compartments. It is virtually impossible to achieve such isolation in whole tissues in vivo. Thus, in order to verify the recruitment of mRNAs and their functional relevance in a whole animal, transcriptome analyses should ideally be combined with techniques that allow the visualization of mRNAs in situ. Recently, novel ISH technologies that detect RNAs at a single-molecule level have been developed. This is especially important when analyzing the subcellular localization of mRNA, since localized RNAs are typically found at low levels. Here we describe two protocols for the detection of axonally-localized mRNAs using a novel ultrasensitive RNA ISH technology. We have combined RNAscope ISH with axonal counterstain using fluorescence immunohistochemistry or histological dyes to verify the recruitment of Atf4 mRNA to axons in vivo in the mature mouse and human brains.

Detection of Axonally Localized mRNAs in Brain Sections Using High-Resolution In Situ Hybridization

RNA in situ hybridization (ISH) enables the visualization of RNAs in cells and tissues. Here we show how combination of RNAscope ISH with immunohistochemistry or histological dyes can be successfully used to detect mRNAs localized to axons in sections of mouse and human brains.

La detección de ARNm axón localizado en las secciones cerebrales Uso de alta resolución<em&gt; In Situ</em&gt; La hibridación

mRNAs are frequently localized to vertebrate axons and their local translation is required for axon pathfinding or branching during development and for ...

Using Single Sensillum Recording to Detect Olfactory Neuron Responses of Bed Bugs to Semiochemicals

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house single or multiple neurons inside, are considered to make the major contribution in responding to the chemical stimuli. By directly recording action potential in the olfactory sensillum after exposure to stimuli, single sensillum recording (SSR) technique provides a powerful approach for investigating the neural responses of insects to chemical stimuli. For the bed bug, which is a notorious human parasite, multiple types of olfactory sensillum have been characterized. In this study, we demonstrated neural responses of bed bug olfactory sensilla to two chemical stimuli and the dose-dependent responses to one of them using the SSR method. This approach enables researchers to conduct early screening for individual chemical stimuli on the bed bug olfactory sensilla, which would provide valuable information for the development of new bed bug attractants or repellents and benefits the bed bug control efforts.

Bed bugs rely on olfactory receptor neurons housed in their antennal olfactory sensilla to detect semiochemicals in the environment. Utilizing single sensillum recording, we demonstrate a method to evaluate bed bug response to semiochemicals and explore the coding process involved.

Uso Individual sensillum grabación para detectar respuestas olfativo neurona de chinches de cama a Semioquímicos

The insect olfactory system plays an important role in detecting semiochemicals in the environment. In particular, the antennal sensilla which house ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Células vivas medición de olor del Receptor activación utilizando un ensayo de campo en tiempo real

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Single Sensillum Recordings for Locust Palp Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially for the detection of non-volatile chemical cues through sensilla chaetica (previously named terminal sensilla or crested sensilla). There is now increasing evidence that these palps also have an olfactory function. An odorant receptor (LmigOR2) and an odorant-binding protein (LmigOBP1) have been localized in the neurons and accessory cells, respectively, in the sensilla basiconica of the palps. Single sensillum recording (SSR) is used for recording the responses of odorant receptor neurons, which is an effective method for screening active ligands on specific odorant receptors. SSR is used in functional studies of odorant receptors in palp sensilla. The structure of the sensilla basiconica located on the dome of the palps differs somewhat from the structure of those on the antennae. Therefore, when performing an SSR elicited by odorants, some specific advice may be helpful for obtaining optimum results. In this paper, a detailed and highly effective protocol for an SSR from insect palp sensilla basiconica is introduced.

This paper describes a detailed and highly effective protocol for single sensillum recordings from the sensilla basiconica on the palps of insect mouthparts.

Grabaciones de Sensillum solo para langosta palpo Sensilla Basiconica

The palps of locust mouthparts are considered to be conventional gustatory organs that play an important role in a locust&#39;s food selection, especially ...

Investigation of Activated Mouse Olfactory Sensory Neurons via Combined Immunostaining and in situ Hybridization

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of available mating partners or threats. In mice, this task is executed primarily by the olfactory system and its underlying subsystems, including the main and accessory olfactory systems. Both have peripheral organs populated by sensory neurons expressing G-protein coupled receptors able to bind chemical cues that reach the nasal cavity. Even though the molecular characteristics of these receptors is well understood, little is known about their cognate specific ligands. The method described here combines in situ hybridization detection of olfactory or vomeronasal receptors with immunodetection of phosphorylated ribosomal protein S6 (pS6) - a marker of neuronal activation. This protocol was devised to identify neurons activated after a single event of exposure to purified or complex chemical stimuli detected by the olfactory organs. Importantly, this technique allows the investigation of neurons triggered in biologically relevant contexts. Ideally, this method should be used to probe the molecular biology of the olfactory system and to study olfactory behaviors.

<meta charset="utf8"></head><body>Investigación de neuronas sensoriales olfativas activadas en ratones mediante inmunotinción combinada e hibridación in situ

This protocol combines in situ hybridization with immunofluorescence to identify olfactory and vomeronasal receptor genes expressed in olfactory sensory neurons after activation by chemical stimuli in the mouse.

Investigación de neuronas sensoriales olfativas activadas en ratones mediante inmunotinción combinada e hibridación in situ

Animals rely on chemical communication to convey and perceive relevant environmental information, ranging from assessment of food quality to detection of ...

Localización de Genes Receptor Odorante en Antenas Locustinas por RNA

Resumen

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Grabaciones solo Sensillum en los insectos Drosophila melanogaster Y Anopheles gambiae

Varias unidades Métodos de grabación para caracterizar la actividad neuronal en el Locust (