アリソン ・ ミッシェルは、フレデリック ・ バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金から、カナダ研究所の健康研究 (機構) の受信者です。ローラ ・ l ・ Swystun は、機構の交わりの受信者です。デビッド Lillicrap は、分子止血のカナダの研究の椅子の受信者です。本研究は、営業許可 (モップ 97849) 機構によって一部で賄われていた。

これらの研究は、研究倫理委員会の女王の大学、カナダによって承認されました。
1. 血管内皮細胞刺激
<ol><li>
コラーゲン コート 6 ウェル培養プレート。
	<ol>
<li>事前に、コート 1 ml コラーゲンの 37 ° C で 6 も組織培養プレート h 24 バッファー (50 μ G/ml ラット尾コラーゲン タイプ 1 0.02 M 氷酢酸と)。</li>
		<li>2 mL のハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) で 2 回洗浄します。 注: プレート錫箔に包まれてでき 4 ° C で気密のポリ袋で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>内皮細胞成長培地含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 2 mL でよくあたり 1 x 10 の6セルの密度での種子。37 ° C (5% CO2) で 24 時間のセルを孵化させなさい。 注: ここでは、血液由来内皮細胞 (BOECs) 通路 5 と 15 の間使用されました。BOECs はスタークらに参照されるメソッドを使用して野生型 VWF シーケンスを持つ健康なボランティアから分離しました。22ゼウス23によって前述 1 と同様の方法で。</li>
	<li>24 h 後、培地を取り除き、HBSS でセルを洗浄します。</li>
	<li>無血清培地 (FBS せず最小限不可欠な成長媒体) 含むホルボール 12-ミリスタート 13-アセタートの 1 mL を追加 (PMA; 100 nM)、37 ° c (5% CO2) 2 h のセルに HR (25 μ G/ml ですべて) や HK 未分画ヒストン (UH)。 ヒストンのこの集中は、徐らによる以前の in vitro毒性レポートに基づいていたメモ。24とエイブラムスら。25 50 μ g/mL を使用。</li>
	<li>2 時間後メディアを収集して分析まで-20 ° C で保存します。</li>
</ol>2 酵素結合抗体法 (ELISA) による VWF の定量化
<ol><li>バッファー (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩と 145 mM 塩化ナトリウム, pH 7.2) 含む 10 μ G/ml ポリクローナル抗 VWF 抗体 4 ° C で一晩をコーティングの 100 μ L でマイクロ プレートをコートします。</li>
	<li>洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回、洗浄 (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩、塩化ナトリウム 500 mM、0.1% Tween 20、pH 7.2)。</li>
	<li>1:2 と 1:4 洗浄バッファー中のサンプルを希釈し、1:10 から始まる標準的なカーブの通常の参照のプラズマを使用して希釈。</li>
	<li>希釈試料 100 μ L をプレートし、基準が 4 ° C で一晩</li>
	<li>洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回洗浄します。</li>
	<li>希釈抗 VWF、プレートに HRP 標識の検出の抗体 (1.1 μ g/μ L で洗浄バッファー) の 100 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プレートを洗浄し、製造元の指示に従って、o-フェニレンジアミン二塩酸塩 (OPD) 試薬で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>だから 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4読み取り 492 でプレート nm。</li>
</ol>3. 固相ヒストン VWF の結合の試金
<ol><li>0.5% ナトリウム デオキシ コール酸 50 mM 炭酸バッファー (pH 9.6) 一晩 4 ° C で 10 μ g/ml で希釈したヒストンをマイクロ プレートをコートします。</li>
	<li>3 回を 250 μ L の PBS を 0.1% 添加した洗浄するトゥイーン 20、洗浄の間 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μ L の PBS 0.1% Tween 20 と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間で補完とプレートをブロックします。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>連続希釈血漿由来 VWF/ヒューマンファクター 25 mU/mL の生理食塩水のバッファー内に 200 mU/mL から複雑な VIII (塩化ナトリウム 10 mM 塩基リン酸ナトリウム,での 500 mM と 0.1% Tween 20、pH 7.2)。室温で 2 h のプレートに 100 μ L を追加します。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>VWF PBS-0.1% Tween 20 と縮尺ウサギ ポリクローナル抗 VWF 抗体室温で 1 時間 HRP 標識を含む溶液 100 μ L を使用して固定化ヒストンの結合を検出します。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>OPD 試薬の 100 μ L で 30 分のプレートを孵化させなさい、従って 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4。492 の光学濃度を測定 nm。</li>
</ol>4. フロー チャンバーに内皮細胞の播種
<ol><li>ルアーロック 1 mL シリンジに 0.5 mL のコラーゲン ・ コーティング バッファー (ステップ 2.1 で説明) をロードします。</li>
	<li>流れチェンバー スライドの貯水池にルアーロック注射器末をねじる。</li>
	<li>全体のレーンをコーティングし、各タンクは満杯までプランジャーをゆっくりと押します。各レーンの繰り返し、インキュベート室 24 h の 37 ° C にします。</li>
	<li>200 μ L ピペットとコラーゲン ・ コーティング バッファーを吸い出しなさい。注射器 1 mL HBSS、別の読み込みし、ゆっくりと流れ区域の各レーンを洗浄するプランジャーを押します。流れ区域の反対の端に 200 μ L ピペットの洗浄を吸い出しなさい。2 回繰り返します。</li>
	<li>10% の培地に 3 x 10 6/mL の細胞内皮細胞 (BOEC) ソリューションの約 100 μ L をピペット流れ区域の車線に FBS。 注: 内皮細胞の播種密度はチャンバーの容量を超えています。これは、最大チャンネル報道;非付着性のセルは、その後洗浄ステップで削除されます。</li>
	<li>インキュベート室 24 時間変更の 37 ° C に媒体 (ステップ 4.4) のようにルアーロック注射器を使用してすべての 8-12 h。車線で目に見える気泡がないことを確認します。</li>
</ol>5. ひと全血から血小板を分離します。
<ol><li>生物学的安全キャビネット 30 G 針付け無添加 3 mL 血液コレクション バキュテナーにバッファー酸クエン酸塩デキスト ロース (クエン酸ナトリウム 85 ミリメートル、111 mM D-グルコースと 71 mM クエン酸、pH 4.5) の 300 μ L を追加します。</li>
	<li>次のベルナルドら26刊に類似したプロトコル (抗血小板作用と非ステロイド性抗炎症薬から 7 日間無料) 健常者から穿刺 (3 mL の 3 つの管) で全血を収集します。</li>
	<li>静脈穿刺に関連する初期組織の損傷は自発的な血小板の活性化を引き起こすことができます最初のチューブを破棄します。</li>
	<li>優しくする血液の抗凝固剤を混ぜて 3 回、vacutainers を反転します。</li>
	<li>遠心分離機の 24 ° C (常温) で 15 分の 150 x g で vacutainers。</li>
	<li>ゆっくりと生物学的安全キャビネットのピペット (清) 血小板豊富な血しょうを削除し、慎重に 15 mL の円錐管にそれを転送します。潜在的なクロス活性化を避けるために単一の円錐管に各バキュテナーの血小板豊富なボリュームを転送します。 注: 血小板分離は、生物学的安全性の細菌汚染と潜在的な人工血小板や血管内皮活性化を防ぐためにキャビネットで実行する必要があります。</li>
	<li>血小板をペレットに 24 ° C (常温) で 10 分の 900 x g で円錐管を遠心します。</li>
	<li>ピペットし、血小板貧しい上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 mL のクエン酸グルコース ナトリウム (CGS) バッファー (クエン酸ナトリウム 13 mM、30 mM D-グルコースおよび 120 mM 塩化ナトリウム、pH 7.0) で慎重にペレットを洗浄します。 注: CGS バッファーが追加され、ペレットは優しく再停止されると、血小板が wisp のようなフォーメーションで表示をされます。血小板の活性化によって汚染されたサンプルで血小板が簡単に再懸濁しますないと固まりが表示されます。</li>
	<li>完全に再停止一度遠心分離機の 24 の ° C (常温) で 10 分の 900 x g でサンプル。</li>
	<li>CGS 洗浄バッファーを削除し、タイロード バッファー (塩化ナトリウム 138 mM、5.5 mM 0.36 mM 塩基リン酸ナトリウム 2.9 mM の塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム 12 mM D-グルコース pH 7.4) の 3 mL にペレットを再懸濁します。血小板の完全な再懸濁を確保し、集計が観察される場合、サンプルは廃棄します。</li>
	<li>最終濃度 1 μ M の洗浄血小板の各 3 mL の円錐管に 20 mM DiOC6 原液 (57.25 mg 5 mL のメタノールに溶解) から 1.5 μ L を追加します。 注: DIOC6 は緑蛍光ミトコンドリア染料ラベル血小板この実験で使用されています。</li>
	<li>3 1.5 mL 遠心チューブに洗浄血小板溶液の分注 1 mL。 注: この実験に必要な血小板容積が流れ区域、目的のせん断応力と実験 (ステップ 6.5) の長さのサイズに基づいて計算されます。このプロトコルは、流体の流れの十分な量があることを確認に状況の変化に応じて調整できます。</li>
	<li>分離の 2 h 内洗浄血小板を使用します。</li>
</ol>6. 流動装置アセンブリ
<ol><li>一端おすエルボ ルアーロック コネクタと他の女性のルアーロック ロック アダプター (1.6 mm の内部の直径) をチューブ滅菌シリコーン 70 cm 部分を添付します。</li>
	<li>20 mL の注射器をチューブに接続されている女性のルアーロック ロック アダプターを接続します。</li>
	<li>6.1 と 6.2 二度 3 つの同一のシリンジ チューブ接続を生成する手順を繰り返します。</li>
	<li>
シリンジ ポンプを使用すると、流体の流れを生成できます。シリンジ ポンプに次の設定を入力: 注射器とフロー レートの内部の直径。 メモ: 20 mL シリンジ 19.55 の mm の内部の直径があります。流量は、所望せん断率/せん断応力とフロー チャンバーの寸法に基づいて計算されます。1 dyn/cm2 (で観測された低静脈傾斜) を達成するために現在の研究で使用されるフロー チャンバー 9.37 μ L/分の流量が必要です。静脈血栓症へのヒストンのリンクの証拠のため 4.45 dyn/cm2の適度な静脈のせん断強度が選択されます。これはまた水に同じような粘度をバッファーには仮定に基づいています。流量 41.7 μ L/分方程式様々 なフロー槽寸法の流量はで見つけることができますを計算するために使用と等しいです。<ol>
<li>シリンジ ポンプのボタン オプションを使用して流体を撤回するためにポンプを設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリンジ ポンプのチューブに接続されている 3 つの注射器を読み込み、シリンジとプランジャーの前後にかっこをしっかりと保護します。</li>
	<li>おすエルボ ルアーを滅菌シリコン チューブの 2 番目の 20 cm 部分の両端に接続します。</li>
	<li>1 つ肘ルアーを鈍化 18 ゲージ針に接続します。</li>
	<li>流れ区域の 3 つの車線のための 3 つの同じ摂取量システムの作成を 2 回、繰り返します。 注: シリコン チューブとルアーズ再利用前に蒸留水に続いて 10% 漂白剤で洗浄できます。フローの部屋を再利用することはお勧めしません。</li>
</ol>7. 顕微鏡設定
<ol><li>完全に自動化されたステージを搭載した回転ディスク顕微鏡を使用します。633 nm レーザー線、543, 491 458 405 レーザー発射と照明を実行します。20 × 対物ですべての画像をキャプチャします。解析ソフトウェア (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) のすべてのパラメーターを調整します。</li>
	<li>チャンネル設定を選択 (排出フィルター: 520/35)、491 で励起による獲得のための nm。完全に動的なデータ範囲を取得する 200 ms の露光時間で 150、電子乗算増加に電荷結合素子を掛けて電子を設定します。 注: 血小板が緑色蛍光色素、DiOC6、波長マキシマと付け (励起, 482 nm; 排出, 504 nm)。</li>
	<li>20 %491 nm レーザー パワーを調整します。</li>
	<li>すべての 3 つの車線の中心をマークし、z の範囲の 1 μ m、0.5 μ m 用ステップ サイズを選択します。選択時間ポイント (つまり時間) の数とイメージをキャプチャするイメージ (すなわち間隔) の間の時間ごとの 10 s。スライドあたり「60 時間ポイント」を選択します。3 つの車線からのイメージをキャプチャし、実験の指定フォルダーに保存する顕微鏡を設定します。 注: 流れ区域は 3 つの車線があるため顕微鏡必要があります、画像をキャプチャする 3 つの位置の間で切り替えます。</li>
</ol>8. VWF 血小板文字列生成
<ol><li>(手順 4) からの流れ区域から培養液を削除手順 4.4 のように同じ技術を使用して。</li>
	<li>いずれかのヒスタミン (25 μ M)、PMA の 100 μ L を追加 (100 nM)、UH、香港、または HR (25 μ G/ml ですべて) 室温と周囲 O2/CO2で 15 分の BOEC 膜を刺激するために (手順 1.4) のように無血清培地で希釈しました。 メモ: VWF リリースには必要ないは、VWF エキソサイトーシス27を高めることが 37 ° C でこの刺激を実行します。</li>
	<li>確実につ 3 つの流れ区域の別のレーンに残る実験コントロールとして未処理。</li>
	<li>1 mL の注射器を使用してメディアを削除し、内皮膜から分泌促進物質を洗浄する PBS の 100-200 μ L で置き換えます。</li>
	<li>血管クリップを使用して場所に商工会議所を保護するスライド スタンドに流れ区域をマウントします。</li>
	<li>流れ区域の貯水池へ (注射器に接続) 70 cm チューブの端に利用できる男性ルアーロック コネクタを取り付けます。2 その他流れ商工会議所レーンに繰り返します。</li>
	<li>PBS 洗浄を削除するシリンジ ポンプを起動します。反対の流れ商工会議所貯水池にピペット追加 PBS に車線がドライ実行しないように。</li>
	<li>すべての 3 つのレーンと等価フロー用フロー システムを観察し、シリンジ ポンプを一時停止します。</li>
	<li>実験の間ほぼ同じエリアで、各レーンの中頃で画像をキャプチャする領域を選択します。 注: 人の顕微鏡で動作は実験条件に盲目にすることができます。この手順により、顕微鏡が血小板の流れの前に集中する (手順 7 を参照)。</li>
	<li>女性ルアー カプラーを添付<a></a>5 mL シリンジにし無料男性ルアーロック コネクタ (ステップ 6.8) 洗浄血小板溶液 (ステップ 5.13) 1.5 mL 遠心チューブに鈍い針を沈める。システム内で気泡がないようにチューブを介して血小板ソリューションをゆっくりと描画します。</li>
	<li>5 mL シリンジを取り外し、流れ区域のオープンの貯水池に男性のルアーを取り付けます。3 つの車線に繰り返します。</li>
	<li>・ シリンジ ポンプを再起動し、暗闇の中で 10 分間ステップ 7 から顕微鏡とプロトコルの設定を使用して血小板フロー中にイメージをキャプチャします。</li>
	<li>10 分後流チャンバー貯水池で吸気管から、ルアーを外し、リザーバーは内皮細胞の膜上の流れを維持するために PBS。</li>
</ol>(9) VWF 血小板文字列定量化
注: PBS の連続的な流れは、画像解析の VWF 血小板文字列伸長を維持するために必要です。フローの停止が球状になる VWF と VWF 血小板文字列定量化を損ないます。イメージ キャプチャの間に PBS で各貯水池を先頭に不可欠です。このステップの間に細胞の縮小や剥離が発生した場合、HBSS は PBS を置き換えることができます。
<ol><li>第 1 レーンに始まり、スライドの中央周辺の 20 X 対物レンズを使用して重複なし 10 枚のスライドをキャプチャします。各レーンのこの手順を繰り返します。 注: 乱流せん断応力による貯水池周辺は避けてください。</li>
	<li>画像処理ソフトウェアを使用すると、「画像」、「調整、」と「明るさ/コントラストです」をクリックして明るさを調整します。定量化のために十分によく付着血小板を見なすことができるまで、スクロール バーをドラッグします。</li>
	<li>画像の 3 つ以上の一直線に並べられた血小板が観察されるときは、VWF 血小板文字列を記録します。イメージ内のすべての VWF 血小板文字列をカウントします。すべての 10 の画像の繰り返し、実験の平均します。 注: 定量化を行う人は実験条件に盲目にすることができます。これは、独立した研究8,28,29によって確認されて、VWF の共同染色する必要はありません。</li>
	<li>最低 3 回各分泌促進物質を評価する実験を繰り返します。</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

サイトに VWF によって血小板募集の定量化の in vitroモデルとして仕えるまま VWF 切断プロテアーゼ ADAMTS13 の存在下で急速な分解のために論争は、文字列 VWF 血小板の生理学的な関連性を中血栓の存在下で形作るかもしれないローカライズ ヒストン レベル5の増加です。また、血栓性血小板減少性紫斑病 (TTP) として - または炎症性微小 - ADAMTS13 活性などに欠けている病?...

血栓症は、死亡率世界1の主要な原因で応答 todysregulated 血小板活性化とトロンビン生成両方 veinsand 動脈内で開発することができます。VWF の血漿中濃度は血液凝固の重要な調節因子、という低いレベル (< 50%) フォン Willebrand の病気 (VWD)2および高レベルとして知られている出血障害が発生 (> 150%) 静脈3のリスクの増加に関連付けられていると4動脈血栓症。
VWF はポリコームタンパク糖巨核球や血管内皮細胞により合成、血小板 α 顆粒と WPBs にそれぞれ格納されます。止血の挑戦時に VWF 活性化血管内皮細胞5または容器壁6露出したコラーゲンに血小板を循環をテザーに内皮細胞の WPBs から解放できます。内皮細胞と VWF のアンカーは、P-セレクチン ・ タンパク7とインテグリン αvβ38によって媒介される示されています。血小板 α 顆粒店の後続のリリースはさらに血小板血小板相互作用血小板栓形成、凝固カスケードとフィブリンの伝播に必要な足場を安定させるためにローカライズされた VWF 濃度を増やすことができます。蒸着。VWF の血小板結合活性より止血作用9,10を有する高分子量多量とポリコームタンパク体質によって調整されます。循環、VWF も血液凝固因子の第 VIII のためのキャリアとして機能します。
流体のせん断応力は、VWF の生理学の本質的なレギュレータです。剪断応力がない場合は、VWF は血小板糖蛋白 Ib 接着11の結合ドメインを隠して球状の形で存在します。せん断応力が存在する場合は、メタロプロテアーゼ、disintegrin、トロンボスポンジン モチーフ (ADAMTS13) メタロプロテアーゼの胸の谷間のサイトが公開されます。ADAMTS13 裂く裸と血小板装飾の VWF 文字列多量体のサイズを調節するその止血作用12を減らします。
VWF は急性期蛋白質、低酸素症13、感染症14、炎症性サイトカインなど、多数の刺激は、血管内皮細胞から VWF リリースを仲介する示されています。他に似たような炎症剤、細胞のヒストンも示されている全身 VWF リリース マウス15,16と血小板体外17,18,の活性化を誘導する19. このリジンの違いとして、ヒストンのサブタイプに依存することが示され、アルギニン含有量関数15に影響を与える可能性があります。流れ区域を確立する研究目標は、リジンが豊富な (HK) の影響を調査するモデルし、アルギニンが豊富な (HR) ヒストン サブタイプと内皮の VWF リリースとリアルタイムの血小板の分泌促進薬、潜在的な初期イベントでキャプチャ炎症による血栓症です。
この流れの商工会議所の方法論は、ビジュアルと、再現と定量化にある生体外でシステムで subendothelial コラーゲン、血管内皮細胞、VWF と血小板の生体内での相互作用を繰り返します。WPB 分泌、血小板の活性化と VWF 分解を含む VWF 血小板の相互作用を調節する経路のすべての側面のリアルタイム評価が可能です。VWF のせん断応力を制御条件の下での研究は、ADAMTS135VWF リリースと血小板結合関数20、WPB 生理21VWF 胸の谷間を損なう VWD の突然変異を評価に使用されています。この方法論を使用して、炎症性刺激の結果として VWF 血小板文字列形成の定量化: 細胞のヒストン。

<table><tbody><tr><td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td><td>Worthington Biochemical</td><td>HLY</td><td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H5505</td><td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H4830</td><td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8139</td><td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td></tr><tr><td>Histamine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H7125-1G</td><td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td></tr><tr><td>3,3&#039; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td><td>Invitrogen</td><td>D273</td><td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td><td>DAKO</td><td>A0082</td><td>For VWF ELISA</td></tr><tr><td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td><td>DAKO</td><td>P0026</td><td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td></tr><tr><td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td><td>eBioscience</td><td>44-2404-21</td><td>For histone-VWF binding assay</td></tr><tr><td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td><td>Thermo Scientific</td><td>3855</td><td>For VWF ELISA</td></tr><tr><td>Humate-P</td><td>CSL Behring</td><td>N/A</td><td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td></tr><tr><td>Normal Reference Plasma</td><td>Precision BioLogic</td><td>CCNRP-05</td><td>For VWF ELISA standard curve</td></tr><tr><td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8287</td><td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td></tr><tr><td>EGM-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td>For culturing and initial seeding of BOEC</td></tr><tr><td>Hank&#039;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14025092</td><td></td></tr><tr><td>Rat-tail Collagen Type 1</td><td>Corning</td><td>354236</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>31985070</td><td>For endothelial cell stimulations</td></tr><tr><td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td><td>Molecular Devices</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td><td>BD Biosciences</td><td>366703</td><td></td></tr><tr><td>&amp;micro;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td><td>Ibidi</td><td></td><td>This product has been discontinued. We suggest using &amp;micro;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td></tr><tr><td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td><td>Ibidi</td><td>10842</td><td></td></tr><tr><td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td><td>Ibidi</td><td>10825</td><td></td></tr><tr><td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td><td>Ibidi</td><td>10802</td><td></td></tr><tr><td>Blunted 18G Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305180</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringes</td><td>BD Biosciences</td><td>302830</td><td></td></tr><tr><td>Syringe Pump</td><td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td><td>Quorum Technologies</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Processing Software</td><td>ImageJ</td><td>N/A</td><td></td></tr></tbody></table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF) はポリコームタンパク糖タンパク質の凝固因子血小板粘着および血管内皮細胞障害のサイトで集計を仲介し、循環の第 VIII 因子を運ぶ。VWF は、血管内皮細胞で合成しプラズマに恒常解放ですかまたは止血チャレンジへの応答でのオンデマンド リリース Weibel Palade 体 (WPBs) と呼ばれる特殊な細胞小器官で格納されます。凝血促進および炎症性刺激は、WPB エキソサイトーシスと VWF リリースを急速に引き起こすことができます。VWF は、血管内皮細胞によるリリースの大半が循環するプラズマ;ただし、VWF の割合は、血管内皮細胞表面に固定されています。生理学的なせん断の条件の下で内皮アンカー VWF は、血栓形成の nidus を表す VWF 血小板文字列を形成血小板にバインドできます。流れ溜まりは、内皮細胞から VWF のリリースと再現し VWF を介する血栓形成の病態に関連する方法でキャプチャ後の血小板を視覚的に観察する使用できます。この方法を使用すると、内皮細胞培養流れ区域で、WPB の開口放出を誘発する分泌促進物質でその後刺激です。洗浄血小板は、活性化された血管内皮細胞に灌流します。血小板が活性化し、その後の流体の流れ方向に細長い VWF 文字列にバインドします。凝血促進、炎症性刺激として細胞のヒストンを使用して、ヒストン治療血管内皮細胞, 血管内皮細胞と比較して増加した VWF 血小板文字列形成を観察した.このプロトコルでは、止血と血栓形成モデルの VWF 血小板相互作用の活性化の定量的・視覚・ リアルタイム評価について説明します。

VWF リリース血管内皮細胞からのヒストンの影響を直接評価、2 h の無血清培地含む PMA (肯定的な制御)、UH、HR、および香港に合流 BOECs を公開しました。我々 は、HK 誘発処理血管内皮細胞 (図 1) の中の VWF 蛋白質 (VWF:Ag) の 2 倍増加したことを示した。興味深いことに、BOECs に UH と HR 刺激されたときが VWF:Ag 以下が検出されました未処理状態により...

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Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

investigating-von-willebrand-factor-pathophysiology-using-flow

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K ビュー.  Queen's University. 本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。

ビデオ: Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

Platelet Adhesion and Aggregation Under Flow using Microfluidic Flow Cells

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions. Extracellular proteins, collagen I or von Willebrand factor are deposited within the microfluidic channel using active perfusion with a pneumatic pump. The matrix proteins are then washed with buffer and blocked to prepare the microfluidic channel for platelet interactions. Whole blood labeled with fluorescent dye is perfused through the channel at various flow rates in order to achieve platelet activation and aggregation. Inhibitors of platelet aggregation can be added prior to the flow cell experiment to generate IC50 dose response data.

The platelet adhesion cascade takes place in the presence of shear flow, a factor not accounted for in conventional (static) well-plate assays. This article reports on a platelet-aggregation assay utilizing a microfluidic well-plate format to emulate physiological shear flow conditions.

マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

Platelet aggregation occurs in response to vascular injury where the extracellular matrix below the endothelium has been exposed. The platelet adhesion ...

生物学

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of (indirect) in vitro experiments, but none of these is as comprehensive as microfluidic flow chambers. In this protocol, the reconstitution of thrombocytopenic fresh blood with stored blood bank platelets is used to simulate platelet transfusion. Next, the reconstituted sample is perfused in microfluidic flow chambers which mimic hemostasis on exposed subendothelial matrix proteins. Effects of blood donation, transport, component separation, storage and pathogen inactivation can be measured in paired experimental designs. This allows reliable comparison of the impact every manipulation in blood component preparation has on hemostasis. Our results demonstrate the impact of temperature cycling, shear rates, platelet concentration and storage duration on platelet function. In conclusion, this protocol analyzes the function of blood bank platelets and this ultimately aids in optimization of the processing chain including phlebotomy, transport, component preparation, storage and transfusion.

Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro

Platelet transfusion and hemostasis was modeled using blood reconstitution and microfluidic flow chambers to investigate the function of blood banking platelets. The data demonstrate the consequences of platelet storage lesion on hemostasis, in vitro.

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました<em&gt;インビトロ</em

Blood platelets prepared for transfusion gradually lose hemostatic function during storage. Platelet function can be investigated using a variety of ...

生物工学

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the shear stress of flowing blood.
To identify the bacterial and host factors that contribute to vascular adhesion of microorganisms, appropriate models that study these interactions under physiological shear conditions are needed. Here, we describe an in vitro flow chamber model that allows to investigate bacterial adhesion to different components of the extracellular matrix or to endothelial cells, and an intravital microscopy model that was developed to directly visualize the initial adhesion of bacteria to the splanchnic circulation in vivo. These methods can be used to identify the bacterial and host factors required for the adhesion of bacteria under flow. We illustrate the relevance of shear stress and the role of von Willebrand factor for the adhesion of Staphylococcus aureus using both the in vitro and in vivo model.

In Vitro and In Vivo Model to Study Bacterial Adhesion to the Vessel Wall Under Flow Conditions

To study the interaction of bacteria with the blood vessels under shear stress, a flow chamber and an in vivo mesenteric intravital microscopy model are described that allow to dissect the bacterial and host factors contributing to vascular adhesion.

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

In order to cause endovascular infections and infective endocarditis, bacteria need to be able to adhere to the vessel wall while being exposed to the ...

免疫・感染学

A Microfluidic Flow Chamber Model for Platelet Transfusion and Hemostasis Measures Platelet Deposition and Fibrin Formation in Real-time

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is restricted to platelet deposition only. The intricate relationship between Ca2+-dependent coagulation and platelet function requires careful and controlled recalcification of blood prior to analysis. Our setup uses a Y-shaped mixing channel, which supplies concentrated Ca2+/Mg2+ buffer to flowing blood just prior to perfusion, enabling rapid recalcification without sample stasis. A ten-fold difference in flow velocity between both reservoirs minimizes dilution. The recalcified blood is then perfused in a collagen-coated analysis chamber, and differential labeling permits real-time imaging of both platelet and fibrin deposition using fluorescence video microscopy. The system uses only commercially available tools, increasing the chances of standardization. Reconstitution of thrombocytopenic blood with platelets from banked concentrates furthermore models platelet transfusion, proving its use in this research domain. Exemplary data demonstrated that coagulation onset and fibrin deposition were linearly dependent on the platelet concentration, confirming the relationship between primary and secondary hemostasis in our model. In a timeframe of 16 perfusion min, contact activation did not take place, despite recalcification to normal Ca2+ and Mg2+ levels. When coagulation factor XIIa was inhibited by corn trypsin inhibitor, this time frame was even longer, indicating a considerable dynamic range in which the changes in the procoagulant nature of the platelets can be assessed. Co-immobilization of tissue factor with collagen significantly reduced the time to onset of coagulation, but not its rate. The option to study the tissue factor and/or the contact pathway increases the versatility and utility of the assay.

This paper describes an experimental model of hemostasis that simultaneously measures platelet function and coagulation. Platelet and fibrin fluorescence is measured in real-time, and platelet adhesion rate, coagulation rate, and onset of coagulation are determined. The model is used to determine platelet procoagulant properties under flow in concentrates for transfusion.

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

Microfluidic models of hemostasis assess platelet function under conditions of hydrodynamic shear, but in the presence of anticoagulants, this analysis is ...

Laminar Flow-based Assays to Investigate Leukocyte Recruitment on Cultured Vascular Cells and Adherent Platelets

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted in the concept of the leukocyte adhesion cascade. However, the exact molecular mechanisms involved in leukocyte recruitment have not yet been fully identified. Since leukocyte recruitment remains an important subject in the field of infection, inflammation, and (auto-) immune research, we present a straightforward laminar flow-based assay to study underlying mechanisms of the adhesion, de-adhesion, and transmigration of leukocytes under venous and arterial flow regimes. The in vitro assay can be used to study the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners in different models of vascular inflammation. This protocol describes a laminar flow-based assay using a parallel-flow chamber and an inverted phase contrast microscope connected to a camera to study the interactions of leukocytes and endothelial cells or platelets, which can be visualized and recorded then analyzed offline. Endothelial cells, platelets, or leukocytes can be pretreated with inhibitors or antibodies to determine the role of specific molecules during this process. Shear conditions, i.e. arterial or venous shear stress, can be easily adapted by the viscosity and flow rate of the perfused fluids and the height of the channel.

Leukocytes avidly interact with vascular cells and platelets after vessel wall injury or during inflammation. Here, we describe a straightforward laminar flow-based assay to characterize the molecular mechanisms that underlie the interactions between leukocytes and their cellular partners.

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

The recruitment of leukocytes upon injury or inflammation to sites of injury or tissue damage has been investigated during recent decades and has resulted ...

Pneumococcus Infection of Primary Human Endothelial Cells in Constant Flow

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von Willebrand Factor (VWF). This glycoprotein changes its molecular conformation in response to shear stress, thereby exposing binding sites for a broad spectrum of host-ligand interactions. In general, culturing of primary endothelial cells under a defined shear flow is known to promote the specific cellular differentiation and the formation of a stable and tightly linked endothelial layer resembling the physiology of the inner lining of a blood vessel. Thus, the functional analysis of interactions between bacterial pathogens and the host vasculature involving mechanosensitive proteins requires the establishment of pump systems that can simulate the physiological flow forces known to affect the surface of vascular cells.
The microfluidic device used in this study enables a continuous and pulseless recirculation of fluids with a defined flow rate. The computer-controlled air-pressure pump system applies a defined shear stress on endothelial cell surfaces by generating a continuous, unidirectional, and controlled medium flow. Morphological changes of the cells and bacterial attachment can be microscopically monitored and quantified in the flow by using special channel slides that are designed for microscopic visualization. In contrast to static cell culture infection, which in general requires a sample fixation prior to immune labeling and microscopic analyses, the microfluidic slides enable both the fluorescence-based detection of proteins, bacteria, and cellular components after sample fixation; serial immunofluorescence staining; and direct fluorescence-based detection in real time. In combination with fluorescent bacteria and specific fluorescence-labeled antibodies, this infection procedure provides an efficient multiple component visualization system for a huge spectrum of scientific applications related to vascular processes.

This study describes the microscopic monitoring of pneumococcus adherence to von Willebrand factor strings produced on the surface of differentiated human primary endothelial cells under shear stress in defined flow conditions. This protocol can be extended to detailed visualization of specific cell structures and quantification of bacteria by applying differential immunostaining procedures.

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

Interaction of Streptococcus pneumoniae with the surface of endothelial cells is mediated in blood flow via mechanosensitive proteins such as the Von ...

In Vitro Microfluidic Disease Model to Study Whole Blood-Endothelial Interactions and Blood Clot Dynamics in Real-Time

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The endothelium is the primary source of many of the major hemostatic molecules that control platelet aggregation, coagulation, and fibrinolysis. Although the mechanism of thrombosis has been investigated for decades, in vitro studies mainly focus on situations of vascular damage where the subendothelial matrix gets exposed, or on interactions between cells with single blood components. Our method allows studying interactions between whole blood and an intact, confluent vascular cell network.
By utilizing primary human endothelial cells, this protocol provides the unique opportunity to study the influence of endothelial cells on thrombus dynamics and gives&#160;valuable insights into the pathophysiology of thrombotic disease. The use of custom-made microfluidic flow channels allows application of disease-specific vascular geometries and model specific morphological vascular changes. The development of a thrombus is recorded in real-time and quantitatively characterized by platelet adhesion and fibrin deposition. The effect of endothelial function in altered thrombus dynamics is determined by postanalysis through immunofluorescence staining of specific molecules.
The representative results describe the experimental setup, data collection, and data analysis. Depending on the research question, parameters for every section can be adjusted including cell type, shear rates, channel geometry, drug therapy, and postanalysis procedures. The protocol is validated by quantifying thrombus formation on the pulmonary artery endothelium of patients with chronic thromboembolic disease.

We present an in vitro vascular disease model to investigate whole blood interactions with patient-derived endothelium. This system allows the study of thrombogenic properties of primary endothelial cells under various circumstances. The method is especially suited to evaluate in situ thrombogenicity and anticoagulation therapy during different phases of coagulation.

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

The formation of blood clots involves complex interactions between endothelial cells, their underlying matrix, various blood cells, and proteins. The ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

A Uniform Shear Assay for Human Platelet and Cell Surface Receptors via Cone-plate Viscometry

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like pressure or mechanical perturbations. Mechanoreceptors detect their stimuli and transmit signals via a great diversity of mechanisms. Some of the most common roles for mechanoreceptors are in neuronal responses, like touch and pain, or hair cells which function in balance and hearing. Mechanosensation is also important for cell types which are regularly exposed to shear stress such as endothelial cells, which line blood vessels, or blood cells which experience shear in normal circulation. Viscometers are devices that detect the viscosity of fluids. Rotational viscometers may also be used to apply a known shear force to fluids. The ability of these instruments to introduce uniform shear to fluids has been exploited to study many biological fluids including blood and plasma. Viscometry may also be used to apply shear to the cells in a solution, and to test the effects of shear on specific ligand-receptor pairs. Here, we utilize cone-plate viscometry to test the effects of endogenous levels of shear stress on platelets treated with antibodies against the platelet mechanosensory receptor complex GPIb-IX.

We describe an in-solution method to apply uniform shear to platelet surface receptors using cone-plate viscometry. This method may also be used more broadly to apply shear to other cell types and cell-fragments and need not target a specific ligand-receptor pair.

コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ

Many biological cells/tissues sense the mechanical properties of their local environments via mechanoreceptors, proteins that can respond to forces like ...

<meta charset="utf8"></head><body>外傷および輸血における血小板機能を評価するためのプラットフォーム

Microfluidics in Assessing Platelet Function

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying aspects of thrombosis and hemostasis. At high-shear environments simulating arterial flow, a microfluidic assay facilitates the study of platelet function, as platelet-rich thrombi form in a localized stenotic region of a flow channel. Utilizing devices that allow for small sample volume can additionally aid in evaluating platelet function under flow from volume-limited patient samples or animal models. Studying trauma patient samples or samples following platelet product transfusion may aid in directing therapeutic strategies for patient populations in which platelet function is critical. Effects of platelet inhibition via pharmacological agents can also be studied in this model. The objective of this protocol is to establish a microfluidic platform that incorporates physiologic flow, biological surfaces, and relevant hemostatic mechanisms to assess platelet function with implications for the study of trauma induced coagulopathy and transfusion medicine.

<meta charset="utf8"></head><body>血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

Platelet function under flow can be assessed and simulated hemostatic resuscitation can be modeled using a microfluidic device, which has applications in trauma and transfusion medicine.

血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

Microfluidics incorporate physiologically relevant substrates and flows that mimic the vasculature and are, therefore, a valuable tool for studying ...

調査フォン Willebrand 因子病態・フォン・フローチャンバーモデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

要約

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マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ

血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

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マイクロ流体フローセルを使用して流れの下で血小板粘着と凝集

マイクロ流体チャンバーモデル止血や血小板輸血に再構成された血液を使用しました

in vitroおよびin vivoモデルでは血管壁の下でフローの状況に細菌付着を研究するために、

血小板輸血や止血のためのマイクロ流体フローチャンバーモデルは、リアルタイムでの血小板沈着およびフィブリン形成を測定します

培養血管細胞と付着性血小板白血球動員を調査する層流に基づく試金

一定の流れの原発性ヒト内皮細胞の肺炎球菌感染

全血-内皮相互作用と血栓動態をリアルタイムで研究するインビトロ微小流体疾患モデル

流れの下での血小板の脱顆粒および分泌の生きた細胞イメージング

コーンプレート Viscometry を介したヒト血小板および細胞表面レセプターに対する均一なせん断アッセイ

血小板機能の評価におけるマイクロ流体工学

調査フォン Willebrand 因子病態・フォン・フローチャンバーモデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成