アリソン ・ ミッシェルは、フレデリック ・ バンティングとチャールズ ・ ベスト カナダ大学院奨学金から、カナダ研究所の健康研究 (機構) の受信者です。ローラ ・ l ・ Swystun は、機構の交わりの受信者です。デビッド Lillicrap は、分子止血のカナダの研究の椅子の受信者です。本研究は、営業許可 (モップ 97849) 機構によって一部で賄われていた。

これらの研究は、研究倫理委員会の女王の大学、カナダによって承認されました。
1. 血管内皮細胞刺激
<ol><li>
コラーゲン コート 6 ウェル培養プレート。
	<ol>
<li>事前に、コート 1 ml コラーゲンの 37 ° C で 6 も組織培養プレート h 24 バッファー (50 μ G/ml ラット尾コラーゲン タイプ 1 0.02 M 氷酢酸と)。</li>
		<li>2 mL のハンクのバランスの取れた塩ソリューション (HBSS) で 2 回洗浄します。 注: プレート錫箔に包まれてでき 4 ° C で気密のポリ袋で保存</li>
	</ol>
</li>
	<li>内皮細胞成長培地含む 10% 牛胎児血清 (FBS) 2 mL でよくあたり 1 x 10 の6セルの密度での種子。37 ° C (5% CO2) で 24 時間のセルを孵化させなさい。 注: ここでは、血液由来内皮細胞 (BOECs) 通路 5 と 15 の間使用されました。BOECs はスタークらに参照されるメソッドを使用して野生型 VWF シーケンスを持つ健康なボランティアから分離しました。22ゼウス23によって前述 1 と同様の方法で。</li>
	<li>24 h 後、培地を取り除き、HBSS でセルを洗浄します。</li>
	<li>無血清培地 (FBS せず最小限不可欠な成長媒体) 含むホルボール 12-ミリスタート 13-アセタートの 1 mL を追加 (PMA; 100 nM)、37 ° c (5% CO2) 2 h のセルに HR (25 μ G/ml ですべて) や HK 未分画ヒストン (UH)。 ヒストンのこの集中は、徐らによる以前の in vitro毒性レポートに基づいていたメモ。24とエイブラムスら。25 50 μ g/mL を使用。</li>
	<li>2 時間後メディアを収集して分析まで-20 ° C で保存します。</li>
</ol>2 酵素結合抗体法 (ELISA) による VWF の定量化
<ol><li>バッファー (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩と 145 mM 塩化ナトリウム, pH 7.2) 含む 10 μ G/ml ポリクローナル抗 VWF 抗体 4 ° C で一晩をコーティングの 100 μ L でマイクロ プレートをコートします。</li>
	<li>洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回、洗浄 (10 mM 二塩基ナトリウム隣酸塩、塩化ナトリウム 500 mM、0.1% Tween 20、pH 7.2)。</li>
	<li>1:2 と 1:4 洗浄バッファー中のサンプルを希釈し、1:10 から始まる標準的なカーブの通常の参照のプラズマを使用して希釈。</li>
	<li>希釈試料 100 μ L をプレートし、基準が 4 ° C で一晩</li>
	<li>洗浄バッファーの 250 μ L で 3 回洗浄します。</li>
	<li>希釈抗 VWF、プレートに HRP 標識の検出の抗体 (1.1 μ g/μ L で洗浄バッファー) の 100 μ L を追加し、室温で 1 時間インキュベートします。</li>
	<li>プレートを洗浄し、製造元の指示に従って、o-フェニレンジアミン二塩酸塩 (OPD) 試薬で 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>だから 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4読み取り 492 でプレート nm。</li>
</ol>3. 固相ヒストン VWF の結合の試金
<ol><li>0.5% ナトリウム デオキシ コール酸 50 mM 炭酸バッファー (pH 9.6) 一晩 4 ° C で 10 μ g/ml で希釈したヒストンをマイクロ プレートをコートします。</li>
	<li>3 回を 250 μ L の PBS を 0.1% 添加した洗浄するトゥイーン 20、洗浄の間 10 分間インキュベートします。</li>
	<li>200 μ L の PBS 0.1% Tween 20 と 1% ウシ血清アルブミン (BSA) 室温で 1 時間で補完とプレートをブロックします。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>連続希釈血漿由来 VWF/ヒューマンファクター 25 mU/mL の生理食塩水のバッファー内に 200 mU/mL から複雑な VIII (塩化ナトリウム 10 mM 塩基リン酸ナトリウム,での 500 mM と 0.1% Tween 20、pH 7.2)。室温で 2 h のプレートに 100 μ L を追加します。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>VWF PBS-0.1% Tween 20 と縮尺ウサギ ポリクローナル抗 VWF 抗体室温で 1 時間 HRP 標識を含む溶液 100 μ L を使用して固定化ヒストンの結合を検出します。</li>
	<li>3.2 の手順を繰り返します。</li>
	<li>OPD 試薬の 100 μ L で 30 分のプレートを孵化させなさい、従って 1 M H2の 100 μ L で反応を停止4。492 の光学濃度を測定 nm。</li>
</ol>4. フロー チャンバーに内皮細胞の播種
<ol><li>ルアーロック 1 mL シリンジに 0.5 mL のコラーゲン ・ コーティング バッファー (ステップ 2.1 で説明) をロードします。</li>
	<li>流れチェンバー スライドの貯水池にルアーロック注射器末をねじる。</li>
	<li>全体のレーンをコーティングし、各タンクは満杯までプランジャーをゆっくりと押します。各レーンの繰り返し、インキュベート室 24 h の 37 ° C にします。</li>
	<li>200 μ L ピペットとコラーゲン ・ コーティング バッファーを吸い出しなさい。注射器 1 mL HBSS、別の読み込みし、ゆっくりと流れ区域の各レーンを洗浄するプランジャーを押します。流れ区域の反対の端に 200 μ L ピペットの洗浄を吸い出しなさい。2 回繰り返します。</li>
	<li>10% の培地に 3 x 10 6/mL の細胞内皮細胞 (BOEC) ソリューションの約 100 μ L をピペット流れ区域の車線に FBS。 注: 内皮細胞の播種密度はチャンバーの容量を超えています。これは、最大チャンネル報道;非付着性のセルは、その後洗浄ステップで削除されます。</li>
	<li>インキュベート室 24 時間変更の 37 ° C に媒体 (ステップ 4.4) のようにルアーロック注射器を使用してすべての 8-12 h。車線で目に見える気泡がないことを確認します。</li>
</ol>5. ひと全血から血小板を分離します。
<ol><li>生物学的安全キャビネット 30 G 針付け無添加 3 mL 血液コレクション バキュテナーにバッファー酸クエン酸塩デキスト ロース (クエン酸ナトリウム 85 ミリメートル、111 mM D-グルコースと 71 mM クエン酸、pH 4.5) の 300 μ L を追加します。</li>
	<li>次のベルナルドら26刊に類似したプロトコル (抗血小板作用と非ステロイド性抗炎症薬から 7 日間無料) 健常者から穿刺 (3 mL の 3 つの管) で全血を収集します。</li>
	<li>静脈穿刺に関連する初期組織の損傷は自発的な血小板の活性化を引き起こすことができます最初のチューブを破棄します。</li>
	<li>優しくする血液の抗凝固剤を混ぜて 3 回、vacutainers を反転します。</li>
	<li>遠心分離機の 24 ° C (常温) で 15 分の 150 x g で vacutainers。</li>
	<li>ゆっくりと生物学的安全キャビネットのピペット (清) 血小板豊富な血しょうを削除し、慎重に 15 mL の円錐管にそれを転送します。潜在的なクロス活性化を避けるために単一の円錐管に各バキュテナーの血小板豊富なボリュームを転送します。 注: 血小板分離は、生物学的安全性の細菌汚染と潜在的な人工血小板や血管内皮活性化を防ぐためにキャビネットで実行する必要があります。</li>
	<li>血小板をペレットに 24 ° C (常温) で 10 分の 900 x g で円錐管を遠心します。</li>
	<li>ピペットし、血小板貧しい上澄みを廃棄します。</li>
	<li>1 mL のクエン酸グルコース ナトリウム (CGS) バッファー (クエン酸ナトリウム 13 mM、30 mM D-グルコースおよび 120 mM 塩化ナトリウム、pH 7.0) で慎重にペレットを洗浄します。 注: CGS バッファーが追加され、ペレットは優しく再停止されると、血小板が wisp のようなフォーメーションで表示をされます。血小板の活性化によって汚染されたサンプルで血小板が簡単に再懸濁しますないと固まりが表示されます。</li>
	<li>完全に再停止一度遠心分離機の 24 の ° C (常温) で 10 分の 900 x g でサンプル。</li>
	<li>CGS 洗浄バッファーを削除し、タイロード バッファー (塩化ナトリウム 138 mM、5.5 mM 0.36 mM 塩基リン酸ナトリウム 2.9 mM の塩化カリウム、炭酸水素ナトリウム 12 mM D-グルコース pH 7.4) の 3 mL にペレットを再懸濁します。血小板の完全な再懸濁を確保し、集計が観察される場合、サンプルは廃棄します。</li>
	<li>最終濃度 1 μ M の洗浄血小板の各 3 mL の円錐管に 20 mM DiOC6 原液 (57.25 mg 5 mL のメタノールに溶解) から 1.5 μ L を追加します。 注: DIOC6 は緑蛍光ミトコンドリア染料ラベル血小板この実験で使用されています。</li>
	<li>3 1.5 mL 遠心チューブに洗浄血小板溶液の分注 1 mL。 注: この実験に必要な血小板容積が流れ区域、目的のせん断応力と実験 (ステップ 6.5) の長さのサイズに基づいて計算されます。このプロトコルは、流体の流れの十分な量があることを確認に状況の変化に応じて調整できます。</li>
	<li>分離の 2 h 内洗浄血小板を使用します。</li>
</ol>6. 流動装置アセンブリ
<ol><li>一端おすエルボ ルアーロック コネクタと他の女性のルアーロック ロック アダプター (1.6 mm の内部の直径) をチューブ滅菌シリコーン 70 cm 部分を添付します。</li>
	<li>20 mL の注射器をチューブに接続されている女性のルアーロック ロック アダプターを接続します。</li>
	<li>6.1 と 6.2 二度 3 つの同一のシリンジ チューブ接続を生成する手順を繰り返します。</li>
	<li>
シリンジ ポンプを使用すると、流体の流れを生成できます。シリンジ ポンプに次の設定を入力: 注射器とフロー レートの内部の直径。 メモ: 20 mL シリンジ 19.55 の mm の内部の直径があります。流量は、所望せん断率/せん断応力とフロー チャンバーの寸法に基づいて計算されます。1 dyn/cm2 (で観測された低静脈傾斜) を達成するために現在の研究で使用されるフロー チャンバー 9.37 μ L/分の流量が必要です。静脈血栓症へのヒストンのリンクの証拠のため 4.45 dyn/cm2の適度な静脈のせん断強度が選択されます。これはまた水に同じような粘度をバッファーには仮定に基づいています。流量 41.7 μ L/分方程式様々 なフロー槽寸法の流量はで見つけることができますを計算するために使用と等しいです。<ol>
<li>シリンジ ポンプのボタン オプションを使用して流体を撤回するためにポンプを設定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>シリンジ ポンプのチューブに接続されている 3 つの注射器を読み込み、シリンジとプランジャーの前後にかっこをしっかりと保護します。</li>
	<li>おすエルボ ルアーを滅菌シリコン チューブの 2 番目の 20 cm 部分の両端に接続します。</li>
	<li>1 つ肘ルアーを鈍化 18 ゲージ針に接続します。</li>
	<li>流れ区域の 3 つの車線のための 3 つの同じ摂取量システムの作成を 2 回、繰り返します。 注: シリコン チューブとルアーズ再利用前に蒸留水に続いて 10% 漂白剤で洗浄できます。フローの部屋を再利用することはお勧めしません。</li>
</ol>7. 顕微鏡設定
<ol><li>完全に自動化されたステージを搭載した回転ディスク顕微鏡を使用します。633 nm レーザー線、543, 491 458 405 レーザー発射と照明を実行します。20 × 対物ですべての画像をキャプチャします。解析ソフトウェア (http://www.well.ox.ac.uk/_asset/file/metamorph-basic-commands.pdf) のすべてのパラメーターを調整します。</li>
	<li>チャンネル設定を選択 (排出フィルター: 520/35)、491 で励起による獲得のための nm。完全に動的なデータ範囲を取得する 200 ms の露光時間で 150、電子乗算増加に電荷結合素子を掛けて電子を設定します。 注: 血小板が緑色蛍光色素、DiOC6、波長マキシマと付け (励起, 482 nm; 排出, 504 nm)。</li>
	<li>20 %491 nm レーザー パワーを調整します。</li>
	<li>すべての 3 つの車線の中心をマークし、z の範囲の 1 μ m、0.5 μ m 用ステップ サイズを選択します。選択時間ポイント (つまり時間) の数とイメージをキャプチャするイメージ (すなわち間隔) の間の時間ごとの 10 s。スライドあたり「60 時間ポイント」を選択します。3 つの車線からのイメージをキャプチャし、実験の指定フォルダーに保存する顕微鏡を設定します。 注: 流れ区域は 3 つの車線があるため顕微鏡必要があります、画像をキャプチャする 3 つの位置の間で切り替えます。</li>
</ol>8. VWF 血小板文字列生成
<ol><li>(手順 4) からの流れ区域から培養液を削除手順 4.4 のように同じ技術を使用して。</li>
	<li>いずれかのヒスタミン (25 μ M)、PMA の 100 μ L を追加 (100 nM)、UH、香港、または HR (25 μ G/ml ですべて) 室温と周囲 O2/CO2で 15 分の BOEC 膜を刺激するために (手順 1.4) のように無血清培地で希釈しました。 メモ: VWF リリースには必要ないは、VWF エキソサイトーシス27を高めることが 37 ° C でこの刺激を実行します。</li>
	<li>確実につ 3 つの流れ区域の別のレーンに残る実験コントロールとして未処理。</li>
	<li>1 mL の注射器を使用してメディアを削除し、内皮膜から分泌促進物質を洗浄する PBS の 100-200 μ L で置き換えます。</li>
	<li>血管クリップを使用して場所に商工会議所を保護するスライド スタンドに流れ区域をマウントします。</li>
	<li>流れ区域の貯水池へ (注射器に接続) 70 cm チューブの端に利用できる男性ルアーロック コネクタを取り付けます。2 その他流れ商工会議所レーンに繰り返します。</li>
	<li>PBS 洗浄を削除するシリンジ ポンプを起動します。反対の流れ商工会議所貯水池にピペット追加 PBS に車線がドライ実行しないように。</li>
	<li>すべての 3 つのレーンと等価フロー用フロー システムを観察し、シリンジ ポンプを一時停止します。</li>
	<li>実験の間ほぼ同じエリアで、各レーンの中頃で画像をキャプチャする領域を選択します。 注: 人の顕微鏡で動作は実験条件に盲目にすることができます。この手順により、顕微鏡が血小板の流れの前に集中する (手順 7 を参照)。</li>
	<li>女性ルアー カプラーを添付<a></a>5 mL シリンジにし無料男性ルアーロック コネクタ (ステップ 6.8) 洗浄血小板溶液 (ステップ 5.13) 1.5 mL 遠心チューブに鈍い針を沈める。システム内で気泡がないようにチューブを介して血小板ソリューションをゆっくりと描画します。</li>
	<li>5 mL シリンジを取り外し、流れ区域のオープンの貯水池に男性のルアーを取り付けます。3 つの車線に繰り返します。</li>
	<li>・ シリンジ ポンプを再起動し、暗闇の中で 10 分間ステップ 7 から顕微鏡とプロトコルの設定を使用して血小板フロー中にイメージをキャプチャします。</li>
	<li>10 分後流チャンバー貯水池で吸気管から、ルアーを外し、リザーバーは内皮細胞の膜上の流れを維持するために PBS。</li>
</ol>(9) VWF 血小板文字列定量化
注: PBS の連続的な流れは、画像解析の VWF 血小板文字列伸長を維持するために必要です。フローの停止が球状になる VWF と VWF 血小板文字列定量化を損ないます。イメージ キャプチャの間に PBS で各貯水池を先頭に不可欠です。このステップの間に細胞の縮小や剥離が発生した場合、HBSS は PBS を置き換えることができます。
<ol><li>第 1 レーンに始まり、スライドの中央周辺の 20 X 対物レンズを使用して重複なし 10 枚のスライドをキャプチャします。各レーンのこの手順を繰り返します。 注: 乱流せん断応力による貯水池周辺は避けてください。</li>
	<li>画像処理ソフトウェアを使用すると、「画像」、「調整、」と「明るさ/コントラストです」をクリックして明るさを調整します。定量化のために十分によく付着血小板を見なすことができるまで、スクロール バーをドラッグします。</li>
	<li>画像の 3 つ以上の一直線に並べられた血小板が観察されるときは、VWF 血小板文字列を記録します。イメージ内のすべての VWF 血小板文字列をカウントします。すべての 10 の画像の繰り返し、実験の平均します。 注: 定量化を行う人は実験条件に盲目にすることができます。これは、独立した研究8,28,29によって確認されて、VWF の共同染色する必要はありません。</li>
	<li>最低 3 回各分泌促進物質を評価する実験を繰り返します。</li>
</ol>

著者は競合する金銭的な利益を宣言しません。

サイトに VWF によって血小板募集の定量化の in vitroモデルとして仕えるまま VWF 切断プロテアーゼ ADAMTS13 の存在下で急速な分解のために論争は、文字列 VWF 血小板の生理学的な関連性を中血栓の存在下で形作るかもしれないローカライズ ヒストン レベル5の増加です。また、血栓性血小板減少性紫斑病 (TTP) として - または炎症性微小 - ADAMTS13 活性などに欠けている病?...

血栓症は、死亡率世界1の主要な原因で応答 todysregulated 血小板活性化とトロンビン生成両方 veinsand 動脈内で開発することができます。VWF の血漿中濃度は血液凝固の重要な調節因子、という低いレベル (< 50%) フォン Willebrand の病気 (VWD)2および高レベルとして知られている出血障害が発生 (> 150%) 静脈3のリスクの増加に関連付けられていると4動脈血栓症。
VWF はポリコームタンパク糖巨核球や血管内皮細胞により合成、血小板 α 顆粒と WPBs にそれぞれ格納されます。止血の挑戦時に VWF 活性化血管内皮細胞5または容器壁6露出したコラーゲンに血小板を循環をテザーに内皮細胞の WPBs から解放できます。内皮細胞と VWF のアンカーは、P-セレクチン ・ タンパク7とインテグリン αvβ38によって媒介される示されています。血小板 α 顆粒店の後続のリリースはさらに血小板血小板相互作用血小板栓形成、凝固カスケードとフィブリンの伝播に必要な足場を安定させるためにローカライズされた VWF 濃度を増やすことができます。蒸着。VWF の血小板結合活性より止血作用9,10を有する高分子量多量とポリコームタンパク体質によって調整されます。循環、VWF も血液凝固因子の第 VIII のためのキャリアとして機能します。
流体のせん断応力は、VWF の生理学の本質的なレギュレータです。剪断応力がない場合は、VWF は血小板糖蛋白 Ib 接着11の結合ドメインを隠して球状の形で存在します。せん断応力が存在する場合は、メタロプロテアーゼ、disintegrin、トロンボスポンジン モチーフ (ADAMTS13) メタロプロテアーゼの胸の谷間のサイトが公開されます。ADAMTS13 裂く裸と血小板装飾の VWF 文字列多量体のサイズを調節するその止血作用12を減らします。
VWF は急性期蛋白質、低酸素症13、感染症14、炎症性サイトカインなど、多数の刺激は、血管内皮細胞から VWF リリースを仲介する示されています。他に似たような炎症剤、細胞のヒストンも示されている全身 VWF リリース マウス15,16と血小板体外17,18,の活性化を誘導する19. このリジンの違いとして、ヒストンのサブタイプに依存することが示され、アルギニン含有量関数15に影響を与える可能性があります。流れ区域を確立する研究目標は、リジンが豊富な (HK) の影響を調査するモデルし、アルギニンが豊富な (HR) ヒストン サブタイプと内皮の VWF リリースとリアルタイムの血小板の分泌促進薬、潜在的な初期イベントでキャプチャ炎症による血栓症です。
この流れの商工会議所の方法論は、ビジュアルと、再現と定量化にある生体外でシステムで subendothelial コラーゲン、血管内皮細胞、VWF と血小板の生体内での相互作用を繰り返します。WPB 分泌、血小板の活性化と VWF 分解を含む VWF 血小板の相互作用を調節する経路のすべての側面のリアルタイム評価が可能です。VWF のせん断応力を制御条件の下での研究は、ADAMTS135VWF リリースと血小板結合関数20、WPB 生理21VWF 胸の谷間を損なう VWD の突然変異を評価に使用されています。この方法論を使用して、炎症性刺激の結果として VWF 血小板文字列形成の定量化: 細胞のヒストン。

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Calf-thymus unfractionated histones (UH)</td>
			<td>Worthington Biochemical</td>
			<td>HLY</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus lysine-rich histones (HK)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H5505</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Calf-thymus arginine-rich histones (HR)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H4830</td>
			<td>Reconstituted in serum-reduced media (5 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8139</td>
			<td>Reconstituted in DMSO (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Histamine</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>H7125-1G</td>
			<td>Reconstituted in water (50 mg/mL)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3,3&#39; Dihexyloxacarbocyanine Iodide (DiOC6)</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>D273</td>
			<td>Reconstituted in methanol (20 mM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Coating Antibody</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>A0082</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rabbit Anti-VWF Detection Antibody, HRP conjugated</td>
			<td>DAKO</td>
			<td>P0026</td>
			<td>For VWF ELISA and histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nunc MaxiSorp flat-bottom 96-well microplates</td>
			<td>eBioscience</td>
			<td>44-2404-21</td>
			<td>For histone-VWF binding assay</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Immulon 4 HBX Flat Bottom Microtiter 96-Well Plates</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3855</td>
			<td>For VWF ELISA</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Humate-P</td>
			<td>CSL Behring</td>
			<td>N/A</td>
			<td>Plasma-derived human von Willebrand factor/factor VIII complex</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Normal Reference Plasma</td>
			<td>Precision BioLogic</td>
			<td>CCNRP-05</td>
			<td>For VWF ELISA standard curve</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>O-Phenylenediamine dihydrochloride (OPD) reagent</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>P8287</td>
			<td>Equivalent product available through ThermoFisher Scientific (Catalogue Number: 34006)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>EGM-2 BulletKit</td>
			<td>Lonza</td>
			<td>CC-3162</td>
			<td>For culturing and initial seeding of BOEC</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#39;s Balanced Salt Solution (HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14025092</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Rat-tail Collagen Type 1</td>
			<td>Corning</td>
			<td>354236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gibco Opti-MEM I Reduced Serum Media</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>31985070</td>
			<td>For endothelial cell stimulations</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>METAMORPH Microscopy Automation and Image Analysis Software</td>
			<td>Molecular Devices</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Vacutainer Blood Collection Tubes, No Additive</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>366703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#181;-Slide III 0.1 (flow chambers)</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td></td>
			<td>This product has been discontinued. We suggest using &#181;-Slide VI 0.1 (#80661) or 0.4 (# 80601) and recalculating flow rate and platelet volume needed to maintain a shear stress of 4.45 dyn/cm2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Tubing 1.6 mm ID: 5 m, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10842</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Luer Lock Connector Female: natural Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10825</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Elbow Luer Connector Male: white Polypropylene, sterilized</td>
			<td>Ibidi</td>
			<td>10802</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blunted 18G Needle</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>305180</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>302830</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Pump</td>
			<td>New Era Pump Systems Inc. NE-1600 Multi-PhaserTM</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Quorum WaveFX- 4X1 spinning disk microscope</td>
			<td>Quorum Technologies</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Image Processing Software</td>
			<td>ImageJ</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

investigating von willebrand factor pathophysiology using a flow chamber model of von willebrand factor-platelet string formation

フォン ・ ヴィレブランド因子 (VWF) はポリコームタンパク糖タンパク質の凝固因子血小板粘着および血管内皮細胞障害のサイトで集計を仲介し、循環の第 VIII 因子を運ぶ。VWF は、血管内皮細胞で合成しプラズマに恒常解放ですかまたは止血チャレンジへの応答でのオンデマンド リリース Weibel Palade 体 (WPBs) と呼ばれる特殊な細胞小器官で格納されます。凝血促進および炎症性刺激は、WPB エキソサイトーシスと VWF リリースを急速に引き起こすことができます。VWF は、血管内皮細胞によるリリースの大半が循環するプラズマ;ただし、VWF の割合は、血管内皮細胞表面に固定されています。生理学的なせん断の条件の下で内皮アンカー VWF は、血栓形成の nidus を表す VWF 血小板文字列を形成血小板にバインドできます。流れ溜まりは、内皮細胞から VWF のリリースと再現し VWF を介する血栓形成の病態に関連する方法でキャプチャ後の血小板を視覚的に観察する使用できます。この方法を使用すると、内皮細胞培養流れ区域で、WPB の開口放出を誘発する分泌促進物質でその後刺激です。洗浄血小板は、活性化された血管内皮細胞に灌流します。血小板が活性化し、その後の流体の流れ方向に細長い VWF 文字列にバインドします。凝血促進、炎症性刺激として細胞のヒストンを使用して、ヒストン治療血管内皮細胞, 血管内皮細胞と比較して増加した VWF 血小板文字列形成を観察した.このプロトコルでは、止血と血栓形成モデルの VWF 血小板相互作用の活性化の定量的・視覚・ リアルタイム評価について説明します。

VWF リリース血管内皮細胞からのヒストンの影響を直接評価、2 h の無血清培地含む PMA (肯定的な制御)、UH、HR、および香港に合流 BOECs を公開しました。我々 は、HK 誘発処理血管内皮細胞 (図 1) の中の VWF 蛋白質 (VWF:Ag) の 2 倍増加したことを示した。興味深いことに、BOECs に UH と HR 刺激されたときが VWF:Ag 以下が検出されました未処理状態により...

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Investigating von Willebrand Factor Pathophysiology Using a Flow Chamber Model of von Willebrand Factor-platelet String Formation

本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

Von Willebrand factor (VWF) is a multimeric glycoprotein coagulation factor that mediates platelet adhesion and aggregation at sites of endothelial damage ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

11.1K ビュー.  Queen's University. 本稿で述べる内皮フォンヴィレブランドを評価するメソッド発売因子とその後の血小板を体外フロー チャンバー システムを使用して炎症性の刺激への応答における流体のせん断応力の下でキャプチャします。

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Functional Assessment of Intestinal Motility and Gut Wall Inflammation in Rodents: Analyses in a Standardized Model of Intestinal Manipulation

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the complex cellular and molecular of intestinal pathology. Although the tunica mucosa is often the organ of interest in many inflammatory diseases, recent works demonstrated that the muscularis externa (ME) is also a highly immunocompetent organ that harbours a dense network of resident immunocytes.1,2 These works were performed within the standardized model of intestinal manipulation (IM) that leads to inflammation of the bowel wall, mainly limited to the ME. Clinically this inflammation leads to prolonged intestinal dysmotility, known as postoperative ileus (POI) which is a frequent and unavoidable complication after abdominal surgery.3 The inflammation is characterized by liberation of proinflammatory mediators such as IL-64 or IL-1&beta; or inhibitory neurotransmitters like nitric oxide (NO).5 Subsequently, tremendous numbers of immunocytes extravasate into the ME, dominated by polymorphonuclear neutrophils (PMN) and monocytes and finally maintain POI.2 Lasting for days, this intestinal paralysis leads to an increased risk of aspiration, bacterial translocation and infectious complications up to sepsis and multi organ failure and causes a high economic burden.6
In this manuscript we demonstrate the standardized model of IM and in vivo assessment of gastrointestinal transit (GIT) and colonic transit. Furthermore we demonstrate a method for separation of the ME from the tunica mucosa followed by immunological analysis, which is crucial to distinguish between the inflammatory responses in these both highly immunoactive bowel wall compartments. All analyses are easily transferable to any other research models, affecting gastrointestinal function.

Postoperative ileus (POI) is a complication of abdominal surgery leading to increased morbidity and a prolonged hospital stay. Because prophylactic or therapeutic strategies are lacking intensified research is necessary. Therefore we established a standardized and feasible mouse model to investigate the pathophysiology of POI and to study potential therapeutic options.

げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

Inflammation of the gastrointestinal tract is a common reason for a variety of human diseases. Animal research models are critical in investigating the ...

医学

Orthotopic Small Bowel Transplantation in Rats

Small bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with short gut syndrome and failure of parenteral nutrition (irreversible intestinal failure). In specialized centers improved operative and managing strategies have led to excellent short- and intermediate term patient and graft survival while providing high quality of life 1,3. Unlike in the more common transplantation of other solid organs (i.e. heart, liver) many underlying mechanisms of graft function and immunologic alterations induced by intestinal transplantation are not entirely known6,7. Episodes of acute rejection, sepsis and chronic graft failure are the main obstacles still contributing to less favorable long term outcome and hindering a more widespread employment of the procedure despite a growing number of patients on home parenteral nutrition who would potentially benefit from such a transplant. The small intestine contains a large number of passenger leucocytes commonly referred to as part of the gut associated lymphoid system (GALT) this being part of the reason for the high immunogenity of the intestinal graft. The presence and close proximity of many commensals and pathogens in the gut explains the severity of sepsis episodes once graft mucosal integrity is compromised (for example by rejection). To advance the field of intestinal- and multiorgan transplantation more data generated from reliable and feasible animal models is needed. The model provided herein combines both reliability and feasibility once established in a standardized manner and can provide valuable insight in the underlying complex molecular, cellular and functional mechanisms that are triggered by intestinal transplantation. We have successfully used and refined the described procedure over more than 5 years in our laboratory 8-11. The JoVE video-based format is especially useful to demonstrate the complex procedure and avoid initial pitfalls for groups planning to establish an orthotopic rodent model investigating intestinal transplantation.

Small bowel transplantation has become an accepted treatment option for patients with irreversible intestinal failure. Our experimental model of orthotopic small bowel transplantation in rats serves as a reliable tool to address underlying immunologic and inflammatory processes that complicate intestinal transplantation.

ラット同所性小腸移植

Small  bowel transplantation has become an accepted clinical option for patients with  short gut syndrome and failure of parenteral nutrition ...

The Rabbit Blood-shunt Model for the Study of Acute and Late Sequelae of Subarachnoid Hemorrhage: Technical Aspects

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and controllable animal models that simulate both conditions are presently uncommon. Therefore, new models are needed in order to mimic human pathophysiological conditions resulting from SAH.
This report describes the technical nuances of a rabbit blood-shunt SAH model that enables control of intracerebral pressure (ICP). An extracorporeal shunt is placed between the arterial system and the subarachnoid space, which enables examiner-independent SAH in a closed cranium. Step-by-step procedural instructions and necessary equipment are described, as well as technical considerations to produce the model with minimal mortality and morbidity. Important details required for successful surgical creation of this robust, simple and consistent ICP-controlled SAH rabbit model are described.

The experimental intracranial pressure-controlled blood shunt subarachnoid hemorrhage (SAH) model in the rabbit combines the standard procedures &#8212; subclavian artery cannulation and transcutaneous cisterna magna puncture, which enables close mimicking of human pathophysiological conditions after SAH. We present step-by-step instructions and discuss key surgical points for successful experimental SAH creation.

くも膜下出血の急性および後期後遺症の研究のためのウサギの血液シャントモデル：技術的側面

Early brain injury and delayed cerebral vasospasm both contribute to unfavorable outcomes after subarachnoid hemorrhage (SAH). Reproducible and ...

Mouse Model of Alloimmune-induced Vascular Rejection and Transplant Arteriosclerosis

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune system of the recipient causes damage of the arterial wall and dysfunction of endothelial cells and smooth muscle cells. This triggers a pathological repair response that is characterized by intimal thickening and luminal occlusion. Understanding the mechanisms by which the immune system causes vasculature rejection and TA may inform the development of novel ways to manage graft failure. Here, we describe a mouse aortic interposition model that can be used to study the pathogenic mechanisms of vascular rejection and TA. The model involves grafting of an aortic segment from a donor animal into an allogeneic recipient. Rejection of the artery segment involves alloimmune reactions and results in arterial changes that resemble vascular rejection. The basic technical approach we describe can be used with different mouse strains and targeted interventions to answer specific questions related to vascular rejection and TA.

We describe a protocol for aortic interposition grafting in mice. The goal of the protocol is to provide a model with which to study pathological processes and therapeutic strategies relevant to alloimmune reactions in arteries and the resultant arterial changes that contribute to organ transplant failure.

同種免疫により誘導される血管拒絶反応および移植動脈硬化症のマウスモデル

Vascular rejection that leads to transplant arteriosclerosis (TA) is the leading representation of chronic heart transplant failure. In TA, the immune ...

Strategic Endothelial Cell Tube Formation Assay: Comparing Extracellular Matrix and Growth Factor Reduced Extracellular Matrix

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by hijacking the process of angiogenesis, in which new blood vessels are formed from existing blood vessels. The CXCR2 (chemokine (C-X-C motif) receptor 2) receptor is a transmembrane G-protein-linked molecule found in many cells that is closely associated with angiogenesis1. Specific blockade of the CXCR2 receptor inhibits angiogenesis, as measured by several assays such as the endothelial tube formation assay. The tube formation assay is useful for studying angiogenesis because it is an excellent method of studying the effects that any given compound or environmental condition may have on angiogenesis. It is a simple and quick in vitro assay that generates quantifiable data and requires relatively few components. Unlike in vivo assays, it does not require animals and can be carried out in less than two days. This protocol describes a variation of the extracellular matrix supporting endothelial tube formation assay, which tests the CXCR2 receptor.

This manuscript describes a tube formation assay to quantify the effects of a given compound or condition on angiogenesis by using endothelial cell tube formation in a controlled environment.

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

Malignant tumors require a blood supply in order to survive and spread. These tumors obtain their needed blood from the patient's blood stream by ...

Micro-dissection of Enamel Organ from Mandibular Incisor of Rats Exposed to Environmental Toxicants

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result from altered activity of cells responsible for enamel synthesis named ameloblasts, which present in enamel organ. During amelogenesis, ameloblasts follow a specific and precise sequence of events of proliferation, differentiation, and death. A rat continually growing incisors is a suitable experimental model to study ameloblast activity and differentiation stages in physiological and pathological conditions. Here, we describe a reliable and consistent method to micro-dissect enamel organ of rats exposed to environmental toxicants. The micro-dissected dental epithelia contain secretion- and maturation-stage ameloblasts that may be used for qualitative experiments, such as immunohistochemistry assays and in situ hybridization, as well as for quantitative analyses such as RT-qPCR, RNA-seq, and Western blotting.

Understanding enamel formation and possible alterations requires the study of ameloblast activity. Here, we describe a reliable and consistent method to micro-dissect enamel organs containing secretion- and maturation-stage ameloblasts that may be used for further quantitative and qualitative experimental procedures.

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

Enamel defects resulting from environmental conditions and ways of life are public health concerns because of their high prevalence. These defects result ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Vagus Nerve Stimulation As an Adjunctive Neurostimulation Tool in Treatment-resistant Depression

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression (TRD). VNS exhibits antidepressive and stabilizing effects. This method is particularly useful as a long-term treatment, in which up to two-thirds of patients respond. The vagus nerve stimulator is positioned on the left vagus nerve during a surgical procedure and is activated telemetrically by a wand connected to a handheld computerized device. The treating physician can perform various adjustments of the vagus nerve stimulator during in-office visits (e.g., by modifying stimulation intensity or stimulation frequency) to achieve maximum therapeutic effects with low side effects. Set-up of the device usually takes several months. Typical side effects include wound infection, temporary salivation, coughing, paralysis of the vocal cords, bradycardia, or even asystole. The patient can stop the VNS by placing a magnet over the generator. The current protocol describes delivery of the specific stimulation tool and methods for adjusting the tuning parameters to achieve the best remission rates in patients with TRD.

Vagus nerve stimulation (VNS) has been shown to be effective as an adjunct treatment for treatment-resistant depression (TRD). VNS leads to antidepressive and antisuicidal effects and quality of life improvements. This protocol offers a step-by-step guide to managing and adjusting a vagus nerve stimulator for efficient treatment of TRD.

治療抵抗性うつ病の補助神経ツールとして迷走神経刺激

Vagus nerve stimulation (VNS) is an approved neurostimulation therapy. The purpose of the method is to treat patients with therapy-resistant depression ...

Hemocompatibility Testing of Blood-Contacting Implants in a Flow Loop Model Mimicking Human Blood Flow

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the body&#39;s circulatory system demands a reliable and multiparametric approach that evaluates the possible hematologic complications caused by these devices (i.e., activation and destruction of blood components). Comprehensive in vitro hemocompatibility testing of blood-contacting implants is the first step towards successful in vivo implementation. Therefore, extensive analysis according to the International Organization for Standardization 10993-4 (ISO 10993-4) is mandatory prior to clinical application. The presented flow loop describes a sensitive model to analyze the hemostatic performance of stents (in this case, neurovascular) and reveal adverse effects. The use of fresh human whole blood and gentle blood sampling are essential to avoid the preactivation of blood. The blood is perfused through a heparinized tubing containing the test specimen by using a peristaltic pump at a rate of 150 mL/min at 37 &#176;C for 60 min. Before and after perfusion, hematologic markers (i.e., blood cell count, hemoglobin, hematocrit, and plasmatic markers) indicating the activation of leukocytes (polymorphonuclear [PMN]-elastase), platelets (&#946;-thromboglobulin [&#946;-TG]), the coagulation system (thombin-antithrombin III [TAT]), and the complement cascade (SC5b-9) are analyzed. In conclusion, we present an essential and reliable model for extensive hemocompatibility testing of stents and other blood-contacting devices prior to clinical application.

This protocol describes a comprehensive hemocompatibility evaluation of blood-contacting devices using laser-cut neurovascular implants. A flow loop model with fresh, heparinized human blood is applied to mimic blood flow. After perfusion, various hematologic markers are analyzed and compared to the values gained directly after blood collection for hemocompatibility evaluation of the tested devices.

ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

The growing use of medical devices (e.g., vascular grafts, stents, and cardiac catheters) for temporary or permanent purposes that remain in the ...

An In Vitro Hemodynamic Loop Model to Investigate the Hemocytocompatibility and Host Cell Activation of Vascular Medical Devices

In this study, the hemocompatibility of tubes with an inner diameter of 5 mm made of polyvinyl chloride (PVC) and coated with different bioactive conjugates was compared to uncoated PVC tubes, latex tubes, and a stent for intravascular application that was placed inside the PVC tubes. Evaluation of hemocompatibility was done using an in vitro hemodynamic loop model that is recommended by the ISO standard 10993-4. The tubes were cut into segments of identical length and closed to form loops avoiding any gap at the splice, then filled with human blood and rotated in a water bath at 37 &#176;C for 3 hours. Thereafter, the blood inside the tubes was collected for the analysis of whole blood cell count, hemolysis (free plasma hemoglobin), complement system (sC5b-9), coagulation system (fibrinopeptide A), and leukocyte activation (polymorphonuclear elastase, tumor necrosis factor and interleukin-6). Host cell activation was determined for platelet activation, leukocyte integrin status and monocyte platelet aggregates using flow cytometry. The effect of inaccurate loop closure was examined with x-ray microtomography and scanning electron microscopy, that showed thrombus formation at the splice. Latex tubes showed the strongest activation of both plasma and cellular components of the blood, indicating a poor hemocompatibility, followed by the stent group and uncoated PVC tubes. The coated PVC tubes did not show a significant decrease in platelet activation status, but showed an increased in complement and coagulation cascade compared to uncoated PVC tubes. The loop model itself did not lead to the activation of cells or soluble factors, and the hemolysis level was low. Therefore, the presented in vitro hemodynamic loop model avoids excessive activation of blood components by mechanical forces and serves as a method to investigate in vitro interactions between donor blood and vascular medical devices.

Presented here is a protocol for a standardized in vitro hemodynamic loop model. This model allows to test the hemocompatibility of perfusion tubes or vascular stents to be in accordance with ISO (International Organization for Standardization) standard 10993-4.

調査フォン Willebrand 因子病態・フォン・フローチャンバーモデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

要約

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げっ歯類における腸運動と腸壁の炎症の機能評価：腸管操作の標準化されたモデルで分析

ラット同所性小腸移植

くも膜下出血の急性および後期後遺症の研究のためのウサギの血液シャントモデル：技術的側面

同種免疫により誘導される血管拒絶反応および移植動脈硬化症のマウスモデル

戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

治療抵抗性うつ病の補助神経ツールとして迷走神経刺激

ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

血管医療機器の血球適合性と宿主細胞活性化を調べるインビトロ血球ループモデル

調査フォン Willebrand 因子病態・ フォン ・ フロー チャンバー モデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成

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ラット同所性小腸移植

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戦略的な内皮細胞管形成アッセイ：細胞外マトリックスおよび成長因子の比較は、細胞外マトリックスを削減しました

環境有害物質に暴露したラットの下顎からエナメル器官の微細解剖

ワイヤー図法を使用してマウスの腸間膜動脈の等尺性収縮力測定

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ヒトの血流を模倣したフローループモデルにおける血液接触インプラントのヘモ適合性試験

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調査フォン Willebrand 因子病態・フォン・フローチャンバーモデルを用いた Willebrand 因子-血小板文字列生成