この研究は、部分的には、Van Andel Research Instituteによって支援され、国立衛生研究所（CA181343）からSBR

著者は何も開示することはない。

生物医学研究用途における抗体の信頼性が最優先事項46、47です。これは、ヒストンPTMの存在量および分布を特徴付けるために開発された技術の大部分のための重要なツールとしての抗体の位置を考慮すると、クロマチン生化学において特に当てはまります。ここに示されたプロトコルは、ヒストンPTM抗体特異性を分析するためのペプチドマイクロ?...

ゲノムDNAは、ヒストンタンパク質を含む真核細胞の核内にエレガントにパッケージングされ、クロマチンを形成する。クロマチンの反復サブユニットはヌクレオソームであり、これはヒストンタンパク質の八量体コア（H2A、H2B、H3、およびH4 1）のまわりに包まれた147塩基対のDNAからなる。クロマチンは、ゆるやかに詰まったユークロマチンおよび密に詰まったヘテロクロマチンドメインに広く組織されている。クロマチン圧縮の程度は、複製、転写、および修復のような基本的なDNA鋳型プロセスを実行するために、タンパク質機械が根底にあるDNAにアクセスできる程度を調節する。 クロマチンの文脈におけるゲノムアクセシビリティの重要な調節因子は、ヒストンタンパク質2、3の構造化されていない尾とコアドメイン上のPTMです。ヒストンPTMは、クロマチン4の構造に直接的に作用し、間接的に作用する染色体リモデリング、酵素的および足場活性を有するリーダータンパク質および関連する巨大分子複合体の動員5 。過去20年にわたるヒストンPTM機能の研究は、これらのマークが細胞運命、生物発達、および疾患の開始/進行の調節において重要な役割を果たすことを圧倒的に示唆している。質量分析に基づくプロテオーム技術の進歩により、80以上の異なるヒストン残基に20以上のユニークなヒストンPTMが発見されました6 。注目すべきことに、これらの修飾は、しばしば組み合わせで発生し、「ヒストンコード」仮説と一致して、多くの研究は、リーダタンパク質がヒストンのPTM 7、8、9の特定の組み合わせの認識を介してクロマチンの別個の領域を標的とすることを示唆しています。重要な課題は、関数をgrに割り当てることですヒストンPTMの特定の組み合わせがどのようにしてクロマチンに関連する動的機能を調整するかを決定することができる。 抗体は、ヒストンPTMの検出のためのリンチピン試薬である。このように、クロマチン生化学研究に使用するために、1,000を超えるヒストンPTM特異的抗体が商業的に開発されている。ハイスループットDNA配列決定技術の急速な発展に伴い、これらの試薬は、チップ配列の個々の研究者および大規模エピゲノミクス「ロードマップ」の取り組み（ 例えば 、ENCODEおよび青写真）によって広く使用されている（次世代シークエンシングと結合クロマチン免疫沈降）パイプラインヒストンPTM分布ゲノムワイド10、11の高解像度空間マップを生成します。しかし、最近の研究により、ヒストンPTM抗体の特異性は非常に可変であり得、これらの試薬は非<html>特定の残基に変更順序を識別ようなオフターゲットエピトープ認識、隣接のPTMによる強い正および負の影響、及び困難としてavorable特性（ 例えば 、モノ- 、ジ- 、またはトリ-メチルリジン）12、13、14、15 、16、17、18。したがって、これらの貴重な試薬で生成されたデータを正確に解釈するには、ヒストンPTM特異的抗体試薬の厳密な品質管理が必要です。 マイクロアレイ技術は、ハイスループットで、再現性があり、かつ小型化されたフォーマットで、何千もの高分子相互作用の同時検査を可能にする。このため、マイクロアレイプラットフォームの様々なタンパク質-DNA 19を分析するために作成されています、「&gt; 20、タンパク質-タンパク質21、及びタンパク質-ペプチド相互作用22。実際、ヒストンペプチドマイクロアレイは消しゴム、作家のハイスループットプロファイリングを可能にする、クロマチン生化学研究のための有益な発見プラットフォームとして浮上し、そしてヒストンのPTM 15の読者ました、23、24、またヒストン抗体特異性17、25の分析のため。クロマチンとエピジェネティクス研究におけるそれらの用途を超えて、ヒストンペプチド配列は、抗全身性エリテマトーデスおよび他の自己免疫疾患の診断/予後診断検査としての潜在的有用性を有しますクロマチン自己抗体は26、27を生成しています。 ここでは、設計、製造、および開発のために開発した統合パイプラインについて説明しますヒストンおよびそれらのPTMを認識する抗体の特異性プロファイルを生成するためにヒストンペプチドマイクロアレイをライニングする。このパイプラインは、我々が最近開発したオープンソースのインタラクティブなソフトウェアアプリケーションであるArrayNinjaによって容易にされ、マイクロアレイ実験の設計と解析段階を統合している28 。 ArrayNinjaはGoogle Chromeで最適に動作します。簡単に述べると、ロボット接触マイクロアレイプリンターを用いて、ストレプトアビジン被覆ガラス顕微鏡スライド上の規定された位置にビオチン結合ヒストンペプチドのライブラリーを沈着させる。次いで、抗体 - エピトープ相互作用を調べるために、競合的および並行アッセイ形式でアレイを使用することができる（ 図1 ）。ペプチドライブラリーは、PTM（リジンアセチル化、リシン/アルギニンメチル化、およびセリン/スレオニンリン酸化）を単独で、プロテオミクスデータセットに主に由来する関連する組み合わせを有する何百ものユニークな合成ペプチドからなる。ペプチド合成および検証のための方法<html>他の場所で詳述されている23 。このアレイプラットフォームを利用した、現在行われているヒストンPTM抗体スクリーニングの取り組みから得られたデータは、公開されているWebリソース、Histone Antibody Specificity Database（www.histoneantibodies.com）に保存されています。注目すべきことに、このプロトコルのバリエーションで製造ヒストンペプチドマイクロアレイはまた、ヒストンPTMリーダードメイン8、29、30、31、32、33、34、35、36、37の活性を特徴づけるために広く使用されており、より最近ヒストンをプロファイルしますPTMライターと消しゴムの活動24 。 /files/ftp_upload/55912/55912fig1.jpg &quot;/&gt; 図1：ヒストンペプチドマイクロアレイ上の抗体スクリーニングのための段階的手順の漫画の描写。定義された翻訳後修飾（赤色および青色の円）を有するビオチン化ヒストンペプチドを、ストレプトアビジン被覆ガラス上のビオチン - フルオレセインと同時プリントする。陽性の相互作用は、赤色蛍光として視覚化される。 <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55912/55912fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。</a>

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="746">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Printing Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">PPB</td>
			<td style="width:281px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">BSA</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2390</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Streptavidin-coated glass microscope slides</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td>439003-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">polypropylene 384 well plate</td>
			<td style="width:107px;">Greiner Bio-one</td>
			<td align="right" style="width:105px;">784201</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Biotin-fluorescein</td>
			<td style="width:107px;">Sigma</td>
			<td align="right" style="width:105px;">53608</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Aushon</td>
			<td align="right" style="width:105px;">2470</td>
			<td style="width:281px;">Aushon 2470 Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">contact microarray printer</td>
			<td style="width:107px;">Gene Machines</td>
			<td style="width:105px;">OmniGrid 100</td>
			<td style="width:281px;">OmniGrid Microarray Printer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">PBS</td>
			<td style="width:107px;">Invitrogen</td>
			<td align="right" style="width:105px;">14190</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Blocking Buffer</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">SBB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Hydrophobic wax pen</td>
			<td style="width:107px;">Vector Labs</td>
			<td style="width:105px;">H-4000</td>
			<td>ImmEdge Hydrophobic Barrier PAP Pen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Silicon Gasket</td>
			<td style="width:107px;">Grace Bio-labs</td>
			<td align="right" style="width:105px;">622511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Hybridization Vessel</td>
			<td style="width:107px;">Thermo Scientific</td>
			<td align="right">267061</td>
			<td>or similar vessel</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21244</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-rabbit)</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Fluorescent-dye conjugated secondary antibody</td>
			<td style="width:107px;">Life Technologies</td>
			<td>A-21235</td>
			<td style="width:281px;">Alexa Fluor 647 (anti-mouse)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax Imprinter</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td>MSI48</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Tween-20</td>
			<td style="width:107px;">Omnipure</td>
			<td align="right" style="width:105px;">9490</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microarray Scanner</td>
			<td style="width:107px;">Innopsys</td>
			<td style="width:105px;">InnoScan 1100AL</td>
			<td>or equivalent microarray scanner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">EipTitan Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Epicypher</td>
			<td align="right" style="width:105px;">112001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">AbSurance Pro Histone Peptide Microarray</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td align="right" style="width:105px;">16668</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">MODified Histone Peptide Array</td>
			<td style="width:107px;">Active Motif</td>
			<td align="right" style="width:105px;">13001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Histone Code Peptide Microarrays</td>
			<td style="width:107px;">JPT</td>
			<td style="width:105px;">His_MA_01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Wax</td>
			<td style="width:107px;">Royal Oak</td>
			<td style="width:105px;">GulfWax</td>
			<td>for wax imprinter</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">Humidified Microarray Slide Hybridization Chamber</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td style="width:105px;">97000-284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:255px;">High throughput microscope slide washing chamber</td>
			<td style="width:107px;">ArrayIt</td>
			<td style="width:105px;">HTW</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Microscope slide centrifuge</td>
			<td style="width:107px;">VWR</td>
			<td>93000-204</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 1</td>
			<td>Abcam</td>
			<td align="right" style="width:105px;">8898</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">Antibody 2</td>
			<td style="width:107px;">Millipore</td>
			<td style="width:105px;">07-473</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:255px;">Biotinylated histone peptide</td>
			<td style="width:107px;">EpiCypher</td>
			<td>12-0001</td>
			<td style="width:281px;">Example peptide. Similar peptides with various modifications are available from several commercial sources.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ImageMagick</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://www.imagemagick.org/script/index.php</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:255px;">ArrayNinja</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:105px;"></td>
			<td>https://rothbartlab.vai.org/tools/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

analysis of histone antibody specificity with peptide microarrays

ヒストンタンパク質の翻訳後修飾（PTM）は、クロマチン構造および遺伝子発現の調節におけるそれらの役割について広く研究されている。ヒストンPTMに特異的な抗体の大量生産および分布は、これらのマークの研究を非常に容易にした。ヒストンPTM抗体は多くのクロマチン生化学アプリケーションにとって重要な試薬であるため、正確なデータ解釈と現場での継続的な進歩には抗体特異性の厳密な解析が必要です。このプロトコルは、ヒストン抗体の特異性をプロファイリングするためのペプチドマイクロアレイの設計、製作および使用のための統合されたパイプラインを記載している。この手順の設計と分析の側面は、マイクロアレイ印刷フォーマットのカスタマイズを合理化するために最近開発したオープンソースのインタラクティブなソフトウェアパッケージであるArrayNinjaによって容易になります。このパイプラインは、市販されて広く使用されている多数のヒストンPTM抗体のスクリーニングに使用されているこれらの実験から生成されたデータは、オンラインおよび拡大Histone Antibody Specificity Databaseを通じて自由に入手できます。ヒストンを越えて、本明細書に記載の一般的な方法論は、PTM特異的抗体の分析に広く適用することができる。

このプロトコルは、ヒストンPTM抗体特異性の分析のためのペプチドマイクロアレイプラットフォームを設計し、製造するために使用されてきた。このアレイは、コアおよびバリアントヒストンタンパク質38に見られるPTMの既知の組み合わせの多くを表す、300を超える独自のペプチド機能（長さ20〜40残基）のライブラリを照会します38</sup...

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Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。

Post-translational modifications (PTMs) on histone proteins are widely studied for their roles in regulating chromatin structure and gene expression. The ...

analysis-of-histone-antibody-specificity-with-peptide-microarrays

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

39.8K ビュー.  Van Andel Research Institute. この原稿では、ヒストンとその翻訳後修飾を認識する抗体の特異性プロファイリングにペプチドマイクロアレイ技術を適用する方法が記載されています。 

ビデオ: Analysis of Histone Antibody Specificity with Peptide Microarrays

Laboratory Scale Production and Purification of a Therapeutic Antibody

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the antibody genes followed by stable transfection into a suitable cell line. The stable clones are subjected to screening in order to select those clones with desired production and growth characteristics. This is a critical albeit time-consuming step in the process. This protocol considers vector selection and sourcing of antibody sequences for the expression of a therapeutic antibody. The methods describe preparation of vector DNA for stable transfection of a suspension variant of human embryonic kidney 293 (HEK-293) cell line, using polyethylenimine (PEI). The cells are transfected as adherent cells in serum-containing media to maximize transfection efficiency, and afterwards adapted to serum-free conditions. Large scale production, setup as batch overgrow cultures is used to yield antibody protein that is purified by affinity chromatography using an automated fast protein liquid chromatography (FPLC) instrument. The antibody yields produced by this method can provide sufficient protein to begin initial characterization of the antibody. This may include in vitro assay development or physicochemical characterization to aid in the time-consuming task of clonal screening for lead candidates. This method can be transferable to the development of an expression system for the production of biosimilar antibodies.

This protocol describes the production of a therapeutic antibody in a mammalian expression system. The methods described include preparation of vector DNA, stable transfection and serum-free adaptation of a human embryonic kidney 293 cell line, set up of large scale cultures and purification using affinity chromatography.

治療用抗体の実験室規模の産生および精製

Ensuring the successful production of a therapeutic antibody begins early on in the development process. The first stage is vector expression of the ...

生化学

Easy Manipulation of Architectures in Protein-based Hydrogels for Cell Culture Applications

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field of 3D templates is rising due to the potential resemblance of those materials to the natural extracellular matrix. Protein-based hydrogels are particularly promising because they can easily be functionalized and can achieve defined structures with adjustable physicochemical properties. However, the production of macroporous 3D templates for cell culture applications using natural materials is often limited by their weaker mechanical properties compared to those of synthetic materials. Here, different methods were evaluated to produce macroporous bovine serum albumin (BSA)-based hydrogel systems, with adjustable pore sizes in the range of 10 to 70 &#181;m in radius. Furthermore, a method to generate channels in this protein-based material that are several hundred microns long was established. The different methods to produce pores, as well as the influence of pore size on material properties such as swelling ratio, pH, temperature stability, and enzymatic degradation behavior, were analyzed. Pore sizes were investigated in the native, swollen state of the hydrogels using confocal laser scanning microscopy. The feasibility for cell culture applications was evaluated using a cell-adhesive RGD peptide modification of the protein system and two model cell lines: human breast cancer cells (A549) and adenocarcinomic human alveolar basal epithelial cells (MCF7).

Different methods to manipulate three-dimensional architecture in protein-based hydrogels are evaluated here with respect to material properties. The macroporous networks are functionalized with a cell-adhesive peptide, and their feasibility in cell culture is evaluated using two different model cell lines.

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

Hydrogels are recognized as promising materials for cell culture applications due to their ability to provide highly hydrated cell environments. The field ...

Semi-automated Biopanning of Bacterial Display Libraries for Peptide Affinity Reagent Discovery and Analysis of Resulting Isolates

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. Peptide affinity reagents can be used for similar applications to antibodies, including sensing and therapeutics, but are more robust and able to perform in more extreme environments. Specific enrichment of peptide capture agents to a protein target of interest is enhanced using semi-automated sorting methods which improve binding and wash steps and therefore decrease the occurrence of false positive binders. A semi-automated sorting method is described herein for use with a commercial automated magnetic-activated cell sorting device with an unconstrained bacterial display sorting library expressing random 15-mer peptides. With slight modifications, these methods are extendable to other automated devices, other sorting libraries, and other organisms. A primary goal of this work is to provide a comprehensive methodology and expound the thought process applied in analyzing and minimizing the resulting pool of candidates. These techniques include analysis of on-cell binding using fluorescence-activated cell sorting (FACS), to assess affinity and specificity during sorting and in comparing individual candidates, and the analysis of peptide sequences to identify trends and consensus sequences for understanding and potentially improving the affinity to and specificity for the target of interest.

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for discovery of peptide affinity reagents, a robust alternative to antibodies. The semi-automated sorting method herein has streamlined biopanning to decrease the occurrence of false positives. Here we illustrate the thought process and techniques applied in evaluating candidates and minimizing downstream analysis.

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

Biopanning bacterial display libraries is a proven technique for peptide affinity reagent discovery for recognition of both biotic and abiotic targets. ...

The Determination of Protease Specificity in Mouse Tissue Extracts by MALDI-TOF Mass Spectrometry: Manipulating PH to Cause Specificity Changes

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important for revealing protease function. The method proposed in this study determines protease specificity by measuring the molecular weight of unique substrates using Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. The substrates contain iminobiotin, while the cleaved site consists of amino acids, and the spacer consists of polyethylene glycol. The cleaved substrate will generate a unique molecular weight using a cleaved amino acid. One of the merits of this method is that it may be carried out in one pot using crude samples, and it is also suitable for assessing multiple samples. In this article, we describe a simple experimental method optimized with samples extracted from mouse lung tissue, including tissue extraction, placement of digestive substrates into samples, purification of digestive substrates under different pH conditions, and measurement of the substrates&#39; molecular weight using MALDI-TOF mass spectrometry. In summary, this technique allows for the identification of protease specificity in crude samples derived from tissue extracts using MALDI-TOF mass spectrometry, which may easily be scaled up for multiple sample processing.

Here, we present a protocol to determine protease specificity in crude mouse tissue extracts using MALDI-TOF spectrometry.

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

Proteases have several biological functions, including protein activation/inactivation and food digestion. Identifying protease specificity is important ...

Kinase Inhibitor Screening In Self-assembled Human Protein Microarrays

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with clinical implications. Several methodologies have been reported to accomplish such screening. However, each has its own limitations (e.g., the screening of only ATP analogues, restriction to using purified kinase domains, significant costs associated with testing more than a few kinases at a time, and lack of flexibility in screening protein kinases with novel mutations). Here, a new protocol that overcomes some of these limitations and can be used for the unbiased screening of kinase inhibitors is presented. A strength of this method is its ability to compare the activity of kinase inhibitors across multiple proteins, either between different kinases or different variants of the same kinase. Self-assembled protein microarrays generated through the expression of protein kinases by a human-based in vitro transcription and translation system (IVTT) are employed. The proteins displayed on the microarray are active, allowing for measurement of the effects of kinase inhibitors. The following procedure describes the protocol steps in detail, from the microarray generation and screening to the data analysis.

A detailed protocol for the generation of self-assembled human protein microarrays for the screening of kinase inhibitors is presented.

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

The screening of kinase inhibitors is crucial for better understanding properties of a drug and for the identification of potentially new targets with ...

Isolation of Histone from Sorghum Leaf Tissue for Top Down Mass Spectrometry Profiling of Potential Epigenetic Markers

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. Post-translational modifications (PTMs) of histones, which are highly dynamic and can be added or removed by enzymes, play critical roles in regulating gene expression. In plants, epigenetic factors, including histone PTMs, are related to their adaptive responses to the environment. Understanding the molecular mechanisms of epigenetic control can bring unprecedented opportunities for innovative bioengineering solutions. Herein, we describe a protocol to isolate the nuclei and purify histones from sorghum leaf tissue. The extracted histones can be analyzed in their intact forms by top-down mass spectrometry (MS) coupled with online reversed-phase (RP) liquid chromatography (LC). Combinations and stoichiometry of multiple PTMs on the same histone proteoform can be readily identified. In addition, histone tail clipping can be detected using the top-down LC-MS workflow, thus, yielding the global PTM profile of core histones (H4, H2A, H2B, H3). We have applied this protocol previously to profile histone PTMs from sorghum leaf tissue collected from a large-scale field study, aimed at identifying epigenetic markers of drought resistance. The protocol could potentially be adapted and optimized for chromatin immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq), or for studying histone PTMs in similar plants.

The protocol has been developed to effectively extract intact histones from sorghum leaf materials for profiling of histone post-translational modifications that can serve as potential epigenetic markers to aid engineering drought resistant crops.

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

Histones belong to a family of highly conserved proteins in eukaryotes. They pack DNA into nucleosomes as functional units of chromatin. ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this protocol, we describe the implementation of a new single-molecule technique, mass photometry (MP), for this purpose. MP is a label- and immobilization-free technique that detects and quantifies molecular masses and populations of antibodies and antigen-antibody complexes on a single-molecule level. MP analyzes the antigen-antibody sample within minutes, allowing for the precise determination of the binding affinity and simultaneously providing information on the stoichiometry and the oligomeric state of the proteins. This is a simple and straightforward technique that requires only picomole quantities of protein and no expensive consumables. The same procedure can be used to study protein-protein binding for proteins with a molecular mass larger than 50 kDa. For multivalent protein interactions, the affinities of multiple binding sites can be obtained in a single measurement. However, the single-molecule mode of measurement and the lack of labeling imposes some experimental limitations. This method gives the best results when applied to measurements of sub-micromolar interaction affinities, antigens with a molecular mass of 20 kDa or larger, and relatively pure protein samples. We also describe the procedure for performing the required fitting and calculation steps using basic data analysis software.

We describe a single-molecule approach to antigen-antibody affinity measurements using mass photometry (MP). The MP-based protocol is fast, accurate, uses a very small amount of material, and does not require protein modification.

質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Cell-Free Production of Proteoliposomes for Functional Analysis and Antibody Development Targeting Membrane Proteins

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug discovery because they are the targets of more than half of all drugs. An obstacle to conducting biochemical, biophysical, and structural studies of membrane proteins as well as antibody development has been the difficulty in producing large amounts of high-quality membrane protein with correct conformation and activity. Here we describe a &#8220;bilayer-dialysis method&#8221; using a wheat germ cell-free system, liposomes, and dialysis cups to efficiently synthesize membrane proteins and prepare purified proteoliposomes in a short time with a high success rate. Membrane proteins can be produced as much as in several milligrams, such as GPCRs, ion channels, transporters, and tetraspanins. This cell-free method contributes to reducing the time, cost and effort for preparing high-quality proteoliposomes, and provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

This protocol describes an efficient cell-free method for production of high-quality proteoliposome by bilayer-dialysis method using wheat cell-free system and liposomes. This method provides suitable means for functional analysis of membrane proteins, drug targets screening, and antibody development.

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

Membrane proteins play essential roles in a variety of cellular processes and perform vital functions. Membrane proteins are medically important in drug ...

Cryo-EM and Single-Particle Analysis with Scipion

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at near-atomic resolution. In single-particle analysis, the vitrified sample is imaged by an electron beam and the detectors at the end of the microscope column produce movies of that sample. These movies contain thousands of images of identical particles in random orientations. The data need to go through an image processing workflow with multiple steps to obtain the final 3D reconstructed volume. The goal of the image processing workflow is to identify the acquisition parameters to be able to reconstruct the specimen under study. Scipion provides all the tools to create this workflow using several image processing packages in an integrative framework, also allowing the traceability of the results. In this article the whole image processing workflow in Scipion is presented and discussed with data coming from a real test case, giving all the details necessary to go from the movies obtained by the microscope to a high resolution final 3D reconstruction. Also, the power of using consensus tools that allow combining methods, and confirming results along every step of the workflow, improving the accuracy of the obtained results, is discussed.

Single-particle analysis in cryo-electron microscopy is one of the main techniques used to determine the structure of biological ensembles at high resolution. Scipion provides the tools to create the whole pipeline to process the information acquired by the microscope and achieve a 3D reconstruction of the biological specimen.

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

Cryo-electron microscopy has become one of the most important tools in biological research to reveal the structural information of macromolecules at ...

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting of two copies of the core histones H2A, H2B, H3, and H4, wrapped around by the DNA. The octamer is composed of two copies of an H2A/H2B dimer and a single copy of an H3/H4 tetramer. The highly charged core histones are prone to non-specific interactions with several proteins in the cellular cytoplasm and the nucleus. Histone chaperones form a diverse class of proteins that shuttle histones from the cytoplasm into the nucleus and aid their deposition onto the DNA, thus assisting the nucleosome assembly process. Some histone chaperones are specific for either H2A/H2B or H3/H4, and some function as chaperones for both. This protocol describes how in vitro laboratory techniques such as pull-down assays, analytical size-exclusion chromatography, analytical ultra-centrifugation, and histone chaperoning assay could be used in tandem to confirm whether a given protein is functional as a histone chaperone.

In Vitro Characterization of Histone Chaperones using Analytical, Pull-Down and Chaperoning Assays

This protocol describes a battery of methods that includes analytical size-exclusion chromatography to study histone chaperone oligomerization and stability, pull-down assay to unravel histone chaperone-histone interactions, AUC to analyze the stoichiometry of the protein complexes, and histone chaperoning assay to functionally characterize a putative histone chaperone in vitro.

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

Histone proteins associate with DNA to form the eukaryotic chromatin. The basic unit of chromatin is a nucleosome, made up of a histone octamer consisting ...

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

要約

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治療用抗体の実験室規模の産生および精製

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

インビトロ分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

ペプチドマイクロアレイによるヒストン抗体特異性の解析

要約

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治療用抗体の実験室規模の産生および精製

細胞培養用ヒドロゲルの蛋白質ベースのアーキテクチャの簡単な操作

結果菌株のペプチド親和性試薬の発見と解析のため細菌表示ライブラリの半自動バイオパニング

MALDI-TOF 質量分析法によるマウス組織におけるプロテアーゼの特異性の定量抽出: 特異性変化を引き起こすに PH を操作します。

自己組み立てヒトタンパク質マイクロアレイにおけるキナーゼ阻害剤スクリーニング

潜在的エピジェネティックマーカーのトップダウン質量分析プロファイリングのためのソルガム葉組織からのヒストンの分離

質量光測定による抗体-抗原アフィニティーの迅速な測定

膜タンパク質を標的とした機能解析と抗体開発のためのプロテオリポソームの無細胞生産

クリオEMとシピオンによる単粒子分析

インビトロ 分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価

インビトロ分析アッセイ、プルダウンアッセイ、シャペロニングアッセイを使用したヒストンシャペロンの特性評価