C-Brick標準の開発中の技術支援については、Shanghai Tolo Biotechに感謝します。この研究は、中国科学アカデミーの戦略的優先研究プログラム（助成金XDB19040200）の助成金によって支えられました。

1.crRNAの調製<ol><li> crRNAテンプレートの調製 <ol><li> RNアーゼフリー水中の個々のオリゴヌクレオチド（ 表1 ）を10μMの濃度に再懸濁する。 </li><li> 22.5μLのトップストランドオリゴヌクレオチド（ 表1の T7-F）、22.5μLのボトムストランドオリゴヌクレオチド（ 表1 ）、および5μLの10×アニーリングバッファーを0.2mLのPCRチューブに加える。総容量が50μLであることを確認する。 注：6つの異なるボトムストランドオリゴヌクレオチドが表1に示されており、その各々は、トップストランドT7-Fと個々に対合されるべきである。 表1の小文字は、crRNAのガイド配列に転写される配列を表す。 10x Taq PCRバッファーを10xアニーリングバッファの代わりに使用することができます。 </li><li> PCRチューブをサーモサイクラーに入れる。 </li><li>アニーリングプログラムを実行する：95℃での最初の変性5分間、次いで95-20℃の冷却時間（サーマルサイクラーで1分当たり1℃の減少）であった。 注：すぐにステップ1.2.1のサンプルを使用してください。 </li></ol></li><li> crRNAの転写および精製 <ol><li> RNaseフリー水38μL、ステップ1.1.4の鋳型8μL、5×T7転写バッファー20μL、NTP混合物（10μM）20μL、組換えRNase阻害剤（RRI）4μL、および10 μLのT7 RNAポリメラーゼを1.5mLのマイクロ遠心チューブに添加した。総容量が100μLであることを確認してください。 </li><li>マイクロ遠心チューブを37℃の水浴に一晩（約16時間）置く。 </li><li>転写されたRNAを精製するには、RNAクリーンアップキットと濃縮キットを使用してください。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li> UV-Vis分光光度計でRNAを定量し、RNAを10μMの濃度に希釈する。すぐにサンプルを使用するか、-80°Cで保存してください。 注：crRNA配列表2にリストされています。 </li></ol></li></ol> 2.C-ブリック部品の構成（ すなわち、 C-ブリック標準ベクトルへの生物学的部品の挿入） 注：この手順には3つのサブステップがあります。短い生物学的部分（ 例えば、プロモーターおよびターミネーター）については、ダイレクトPCR法を使用して、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに挿入することが最善である4 。補足データにはベクター全体の配列が示されており、接頭辞と接尾辞の配列は図1に示されています （下のステップ2.1）。 PCR（ 例えば、ゲノムDNA、プラスミド、または新しく合成されたDNA配列の鋳型を用いて）を介して容易に得ることができる生物学的部分に関しては、C-Brick標準ベクターに生物学的部分を挿入するために継ぎ目のないアセンブリ方法を使用することが最もよい（ステップ2.2、以下）。 BioBrickおよびBglBrick標準から得られた部分については、制限酵素媒介消化およびT4 DNAリガーゼ媒介ライゲーションを用いて、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに挿入することができる（以下の工程2.3）。 <ol><li> 直接PCR増幅による構築 <ol><li> PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計および注文。 注：オリゴヌクレオチドの5 &#39;末端はDNA部分の配列を含み、オリゴヌクレオチドの3&#39;末端はベクター配列（ すなわち、フォワード鎖の3 &#39;末端に「GGATCCACTAGTCTCTAGCTCG」を含み、そしてフォワード鎖の「GGATCCTTTCTCCTCTTTCTAG」逆鎖の場合）。オリゴヌクレオチドの5 &#39;末端にオーバーハングがないか、約20bpのオーバーハングを設計することができる。特定の例は、以前の研究4に見出すことができる。 </li><li>超純水中の個々のオリゴヌクレオチドを10μMの濃度に再懸濁する。 </li><li>氷上で0.2 mLのPCRチューブでPCR反応をセットアップする：18μLの超純水、25μLの2×PCR緩衝液、1μLのdNTP（10μM）、ステップ2.1.2からのフォワード及びリバースプライマー（10μM）各2.5μL、鋳型としてのC-ブリック標準ベクター（50ng）0.5μL、高忠実度のDNAポリメラーゼの使用。総容量が50μLであることを確認する。 </li><li>チューブをサーモサイクラーに直接入れ、サーモサイクラープログラムを開始します。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li><li>サーモサイクラープログラム：98℃で3分間1サイクル; 98℃で10秒、55℃で20秒、および72℃で2分のサイクルを30サイクル; 72℃で10分間1サイクル。サンプルを16℃に保つ。 </li><li>ステップ2.1.4からの混合物9μLを1.5mL微量遠心管に加える。 </li><li> 1μLのDpnIを添加し、37℃の水浴中で1時間インキュベートする。 注：プライマーに重複配列がない場合は、0.5μLのT4ポリヌクレオチドキナーゼ（PNK）と0.5μLのT4 DNAリガーゼを添加し、1時間22℃の水浴。そうでなければ、プライマーが約20nt重複配列を含む場合、DpnI処理産物を大腸菌 （DH10B）コンピテント細胞に直接形質転換する（工程2.4）。線状化されたPCR産物は、宿主内の組換え系によって環化される。 </li><li>すぐにサンプルを使用するか、-20℃で保存してください。 </li></ol></li><li> シームレスな組み立てによる構造 <ol><li> PCR増幅のためのオリゴヌクレオチドの設計および注文。 注：オリゴヌクレオチドの3 &#39;末端はDNA部分の末端配列を含み、オリゴヌクレオチドの5&#39;末端は線状化されたC-ブリック標準ベクター配列の末端を含む（ すなわち、 5 &#39;末端には 「CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC」、フォワードストランドの5 &#39;末端のための「CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC」）。特定の例は、以前の研究4に見出すことができる。 </li><li>個体を再停止する超純水中の10μMのオリゴヌクレオチドを10μMの濃度に希釈した。 </li><li>超純水18μL、2×PCRバッファー25μL、dNTPs（10μM）1μL、フォワードおよびリバースプライマー（10μM）の各2.5μLを加えます。 ）、0.5μLの鋳型（20〜500ng）、および0.5μLの高忠実度DNAポリメラーゼを添加した。総容量が50μLであることを確認する。 </li><li>チューブをサーモサイクラーに直接置き、サーモサイクラープログラムを実行してください。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 注：サーモサイクラープログラムを次のように設定します：98℃で3分間1サイクル; 98℃で10秒間、プライマーのアニーリング温度に応じて55℃で20秒間、および72℃で1分間（生物学的部位の長さに応じて）30サイクル; 72℃で10分間1サイクル。サンプルを16℃に保つ。 </li><li> PCR精製システムを使用してPCR産物を精製する。テンキット;製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li> C-ブリック標準ベクターをBamHIで消化します：34μLの超純水、10μLのプラスミド（1μg）、5μLの10倍緩衝液、および1μLのBamHIをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃で2時間、水浴中でインキュベートする。 </li><li>ゲルクリーンアップシステムキットを使用して上記の生成物を精製する。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>ステップ2.2.7からの線状化ベクター（50ng）2μL、ステップ2.2.4からのフラグメント（200ng）の5μL、シームレス組立キットからの5x継ぎ目のないアセンブリ緩衝液2μLおよびシームレス組立酵素1μLを加える。 1.5 mLのマイクロ遠心チューブに加えます。総容量は10μLです。 </li><li>これを37℃の水浴に30分間置く。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></li><li> 制限酵素媒介消化およびT4 DNAリガーゼ媒介性連結による構築。 注意：BioBrick（ステップ2.3.4-2.3.7）およびBglBrick（ステップ2.3.1-2.3.3）標準から得られた部分については、制限酵素媒介消化およびT4DNAリガーゼ媒介ライゲーションを使用して、生物学的部分をC-ブリック標準ベクターに組み込む。 <ol><li> BglHIおよびBglIIでBglBrick標準品を消化する：超純水34μL、プラスミド10μL（2μg）、10倍バッファー5μL、BamHI0.5μLおよびBglII0.5μLをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li> 1％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてフラグメントを精製する。 </li><li>フラグメントとC-Brick標準ベクターをライゲーションする：ステップ2.1.12の線状化ベクター（50ng）2μLとステップ2.3.3のフラグメント（200ng）6μLを1.5mLマイクロ遠心チューブに加える。 10μLの10×T4 DNAリガーゼバッファーと1μLのT4 DNAリガーゼを加えます。 22℃で2時間インキュベートする。すぐにサンプルを使用するかフリーズする-20℃で保存してください。 </li><li> XbaIおよびSpeIでBioBrick標準品を消化する：超純水34μL、プラスミド10μL（2μg）、10倍バッファー5μL、XbaI0.5μLおよびSpeI0.5μLをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li> C-ブリック標準ベクターをXbaIとSpeIで消化します：34μLの超純水、10μLのプラスミド（1μg）、5μLの10倍緩衝液、0.5μLのXbaI、および0.5μLのSpeIをマイクロ遠心チューブに加えます。 37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li> 1％アガロースゲル電気泳動を行い、ゲル精製システムキットを用いて、ステップ2.3.4のフラグメントおよびステップ2.3.5の直線化ベクターを精製する。製造業者のプロトコールに従って調製した。 </li><li>フラグメントとC-Brickベクターをライゲーションする：ステップ2.3.5の線状化ベクター（50ng）2μLとステップ2.3.4のフラグメント（200ng）6μLを1.5mL微量遠心チューブに加える。広告d1μLの10×T4 DNAリガーゼ緩衝液および1μLのT4 DNAリガーゼ。 22℃で2時間インキュベートする。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></li><li> 大腸菌 （DH10B）のコンピテント細胞への化学的形質転換のために、ステップ2.1.8,22.9,2.3.3または2.3.7からの生成物10μLを添加する。 </li><li>いくつかのクローンを5 mL液体Luria-Bertani（LB）チューブに取り、37℃でシェーカー（220 rpm）で一晩インキュベートする。 </li><li>プラスミド調製キットを用いてプラスミドを抽出する。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>サンガー配列決定による正しいクローンの同定11 。 </li></ol> 3. C-ブリックアセンブリ（ 図2 ） <ol><li> C-BrickベクターのCpf1による消化 <ol><li> RNaseフリー水22.5μL、10x Cpf1緩衝液4μL、ステップ2.6のプラスミド（1μg）10μL、RRI0.5μL、および1＆＃181; LのCpf1（5μM）を1.5mLのマイクロ遠心チューブに添加する。 注：Cpf1は、市販のものを購入することも、前の研究4のプロトコルに従って精製することもできます4 。 </li><li> T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T2（10μM）を添加し、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。さらに30分間、1μLのcrRNA-T1（10μM）およびCpf1（5μM）を添加する。 注：T3およびT4部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T3（10μM）を添加し、37℃の水浴中で30分間インキュベートします。 1μLのcrRNA-T4（10μM）をさらに30分間添加する。 </li><li> 1μLの感熱アルカリ性ホスファターゼを添加し、チューブを37℃の水浴中でさらに1時間インキュベートする。 </li><li>アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてベクターを精製する。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></&gt; <li> Cpf1によるDNA断片の消化 <ol><li> RNaseフリー水21.5μL、10x Cpf1バッファー4μL、ステップ2.6（2μg）のプラスミド10μL、RRI0.5μL、およびCpf1（5μM）2μLを1.5mL微量遠心管に加えます。 </li><li> T1およびT2部位に外来DNA断片を挿入するには、1μLのcrRNA-T1（10μM）と1μLのcrRNA-T3（10μM）を添加し、37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 注：あるいは、1μLのcrRNA-T2（10μM）と1μLのcrRNA-T4（10μM）を添加し、37℃の水浴中で2時間インキュベートする。 </li><li>アガロースゲル電気泳動を行い、ゲルクリーンアップシステムキットを用いてフラグメントを精製する。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li></ol></li><li> C-ブリックアセンブリとさらなる検証 <ol><li>外来DNA断片とC-Brickベクターをライゲーションします：2μLの線状化ベクター（50ng）およびステップ3.2.3のDNAフラグメント（200ng）6μLを1.5mL微量遠心チューブに添加する。 1×10 4個のT4 DNAリガーゼバッファーと1μLのT4 DNAリガーゼを加えます。 22℃で2時間インキュベートする。サンプルを直ちに使用するか、-20℃で凍結保存してください。 </li><li> 大腸菌 （DH10B） - コンピテント細胞への化学的形質転換のために10μLのライゲーション産物（段階3.3.1）を添加する。 </li><li>いくつかのクローンを5mL液体LBチューブに加え、シェーカー上で220 rpm、37℃で一晩インキュベートする。 </li><li>プラスミド調製キットを用いてプラスミドを抽出する。製造元のプロトコルに従ってください。 </li><li>サンガー配列決定による正しいクローンの同定11 。 </li></ol></li><li> C-Brickアセンブリの新しいラウンドを実行します。手順3.3.4の正しいクローンは、手順3.1-3.3と同じプロトコルに従い、さらなる反復C-ブリックアセンブリのための新しいC-ブリックベクターまたはDNA部分として使用することができる。 注：T2 &#39;とT3のitesはT2サイトとT3サイトのバックアップとして設計されています（ 図1a ）。ステップ2.3.7から得られたプラスミドについては、C-Brick標準アセンブリのためにT2 &#39;およびT3&#39;のみを使用することができる。 </li></ol>

<ol>
	<li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices.">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li><li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts.">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li><li>Knight, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks. , 1-11 (2003).</li><li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C-Brick:+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1.">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li><li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=BglBricks:+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly.">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li><li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=iBrick:+a+new+standard+for+iterative+assembly+of+biological+parts+with+homing+endonucleases.">iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases.</a> PLoS One. 9 (10), e110852 (2014).</li><li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering.">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li><li>Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems:+Harnessing+Nature's+Toolbox+for+Genome+Engineering.">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li><li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity.">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li><li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system.">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li><li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors.">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li><li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+one+pot,+one+step,+precision+cloning+method.">A one pot, one step, precision cloning method.</a> PLoS One. 3 (11), e3647 (2008).</li><li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases.">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li><li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bricks+and+blueprints:+methods+and+standards+for+DNA+assembly.">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li><li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+brief+history+of+synthetic+biology.">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li><li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry.">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li></ol>

著者は何も開示することはない。

このプロトコールは、DNAアセンブリ標準C-ブリックの手順を記載する。このプロトコルの最も重要なステップは、C-Brick標準ベクトルの線形化です。ベクターの不完全な切断は、成功率に重大な影響を及ぼす可能性がある。さらに、Cpf1は、主に「18-23」切断パターンの標的DNA配列を切断するが、2つの塩基の近くの不正確な切断もまた検出され、DNAアセンブリ後に少数の突然変異を引き起こす可...

DNA生物学的部分の標準化は、合成生物学の発展にとって重要である1 。 DNAアセンブリ手順の開発は、 臨機応変な実験設計に取って代わることができ、遺伝的構成要素をより大きなシステムに組み立てる際に生じる予想外の結果の多くを除去することができる。 BioBrick標準（BBF RFC 10）は、最も初期に提案されたDNAアセンブリ標準の1つでした。これは接頭配列（EcoRIおよびXbaI切断部位を含む）および接尾配列（SpeIおよびPstI切断部位を含む） 2,3を使用する 。 XbaIとSpeIは相補的な凝集末端を有するため、XbaIとSpeIで切断されたBioBrick DNA部分を結合して、さらなる反復アセンブリのための新しいBioBrickを生成することができる。 BioBrick標準を使用していくつかの欠陥が確認されています4 。例えば、8-bpの傷跡を生じる融合タンパク質の構築を可能にしないDNA部分の間に存在する。さらに、上記の4種類の6bpの制限部位をDNA部分から除去しなければならず、これは非常に不便である。最初の問題を解決するためにBglBrick標準が確立されました5 。これは、6-bpの「GGATCT」傷跡を作り、Gly-Serを産生し、複数のタンパク質またはタンパク質ドメインの融合を可能にする。 iBrickは第2の問題に対処するために開発されました6 。長いDNA配列を認識するホーミングエンドヌクレアーゼ（HE）を使用します。 HE認識部位は天然のDNA配列にほとんど存在しないので、iBrick標準は、DNA配列を改変することなくiBrick部位の直接構築に使用することができる。しかし、iBrickスタンダードはDNA部分の間に21 bpの傷跡を残します。これは、その不評の理由です。 近年、クラスタリングされた規則的に間隔を置いた短い回文繰り返し（CRISPR）システムが急速に発展した。 CRISPR関連（Cas）タンパク質の中で、 ストレプトコッカス・ピオゲネス（Streptococcus pyogenes）由来のCas9エンドヌクレアーゼが現在広く使用されている。大部分は、平滑末端を有する二本鎖DNA切断（DSB）を導入する9 。 2015年に、Zhangと共同研究者は、Cpf1（ PrevotellaとFrancisellaの CRISPR）を初めて特徴付けました 。それはクラス2型V CRISPR-Cas系に属し、CRISRP RNA（crRNA）誘導エンドヌクレアーゼ10である。 Cas9とは異なり、Cpf1は、4または5ntの5 &#39;オーバーハング10を有するDSBを導入する。この特性に基づいて、Cpf1を用いてDNAアセンブリ標準C-Brick 4を開発した。 C-ブリック標準ベクターでは、接頭語T1 / T2および接尾辞付きT3 / T4の4つのCpf1標的部位が生物学的部分に隣接する。これはBioBrick標準に似ています。 T2およびT3部位の切断として、p相補的な粘着末端を生じるので、DNA部分の反復アセンブリを実施することが可能であり、一方パーツ間に「GGATCC」傷を生成することが可能である。特に、C-Brick標準には2つの主な利点があります。長いターゲットシーケンスを認識し、短い傷跡を残します。 C-ブリックによって生成された6bpの「GGATCC」傷は、融合タンパク質の構築を可能にするGly-Serをコードする。さらに、C-Brick標準もBglBrickおよびBioBrick標準と部分的に互換性があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="828">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Comercial Oligonucleotide</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;"></td>
			<td style="width:191px;"></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Taq PCR Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">#J40928</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ultra Pure Distilled Water</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">10977-015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x RNA Transcription Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">K0441</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T7 RNA polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EP0111</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">NTP mixture</td>
			<td style="width:160px;">Sangon</td>
			<td style="width:161px;">#ND0056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RRI(Recombinant RNase Inhibitor)</td>
			<td style="width:160px;">Takara</td>
			<td style="width:161px;">2313A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">RNA Clean &#38; Concentrator-5</td>
			<td style="width:160px;">Zymo Research</td>
			<td style="width:161px;">R1015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">UV-Vis Spectrometer</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">Nano-Drop 2000c</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">2x Phanta Max Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">PB505</td>
			<td>PCR buffer</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">dNTPs</td>
			<td style="width:160px;">Transgen</td>
			<td style="width:161px;">AD101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:316px;">Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td style="width:160px;">Vazyme</td>
			<td style="width:161px;">P505-d1</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Ezmax for One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">24303-1</td>
			<td>seamless assembly kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">5x Buffer for Ezmax One-step Cloning</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BamHI-HF</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3136L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">BglII&#160;</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0144L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">XbaI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R0145L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SpeI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R3133L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Buffer 3</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#B7003S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x CutSmart Buffer</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">B7204S</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x T4 DNA ligase Buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 PNK</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">T4 DNA ligase</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32210</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">DpnI</td>
			<td style="width:160px;">NEB</td>
			<td style="width:161px;">#R01762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">SV Gel and PCR clean-up system</td>
			<td style="width:160px;">Promega</td>
			<td style="width:161px;">A9282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Plasmid Mini Kit I</td>
			<td style="width:160px;">Omega</td>
			<td style="width:161px;">D6943-02</td>
			<td>plasmid preparation kit</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermosensitive alkaline phosphatase&#160;</td>
			<td style="width:160px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:161px;">#EF0651</td>
			<td>FastAP</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">10x Cpf1 buffer</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32008</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Cpf1</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">32105</td>
			<td>FnCpf1</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">thermocycler</td>
			<td style="width:160px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:161px;">veriti 96 well</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">C-Brick standard vector</td>
			<td style="width:160px;">Tolobio</td>
			<td style="width:161px;">98101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">E. coli [DH10B]</td>
			<td style="width:160px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:161px;">18297010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (tryptone)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (yeast extract)</td>
			<td style="width:160px;">Oxoid</td>
			<td style="width:161px;">LP0021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:316px;">Luria-Bertani media (NaCl)</td>
			<td style="width:160px;">Sangon Biotech</td>
			<td style="width:161px;">B126BA0007</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

protocols for c-brick dna standard assembly using cpf1

CRISPR関連タンパク質Cpf1は、CRISPR RNA（crRNA）の誘導下で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特徴のために、Cpf1は、長い認識部位および短い傷跡の利点を有するC-ブリックと呼ばれるDNAアセンブリ標準の確立に用いられてきた。標準的なC-Brickベクターには、接頭部（T1およびT2部位）および接尾部（T3およびT4部位） - 隣接する生物学的DNA部分の4つのCpf1認識部位がある。 T2およびT3部位の切断は相補的な粘着末端を生成し、T2およびT3部位を有するDNA部分のアセンブリを可能にする。一方、組立後に部品間に短い「GGATCC」傷が発生する。新たに形成されたプラスミドが再び4つのCpf1切断部位を含むので、この方法は、BioBrickおよびBglBrick標準のものと同様のDNA部分の反復的組み立てを可能にする。 DNA部品を組み立てるためのC-Brick標準の使用法の概要ここで説明します。 C-Brick標準は、科学者、大学院生、学部生、さらにはアマチュアでも広く使用できます。

<html>このプロトコールは、3つの色素タンパク質カセット（cjBlue（BBa_K592011）、eforRed（BBa_K592012）、およびamilGFP（BBa_K592010））のアセンブリを実証した。最初に、上記の3つの遺伝子およびターミネーターのコード配列をC-ブリック標準ベクターに個々にクローニングした。短いDNA部分、プロモーターおよびターミネーターを、5 &#39;末端に短いDNA部分を含むプライマーを...

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Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

CRISPR関連タンパク質Cpf1は、特別に設計されたCRISPR RNA（crRNA）によって導かれ、所望の部位で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特性に基づいて、DNAアセンブリ標準（C-Brick）が確立され、その使用方法を詳述したプロトコルがここに記載されている。

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

8.2K ビュー.  Chinese Academy of Sciences.  CRISPR関連タンパク質Cpf1は、特別に設計されたCRISPR RNA（crRNA）によって導かれ、所望の部位で二本鎖DNAを切断し、粘着末端を生成する。この特性に基づいて、DNAアセンブリ標準（C-Brick）が確立され、その使用方法を詳述したプロトコルがここに記載されている。 

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Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

遺伝学

Determination of the Optimal Chromosomal Location(s) for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In bacteria, the impact of the genetic context on the function of a genetic element can be difficult to assess. Several mechanisms, including topological effects, transcriptional interference from neighboring genes, and/or replication-associated gene dosage, may affect the function of a given genetic element. Here, we describe a method that permits the random integration of a DNA element into the chromosome of Escherichia coli and select the most favorable locations using a simple growth competition experiment. The method takes advantage of a well-described transposon-based system of random insertion, coupled with a selection of the fittest clone(s) by growth advantage, a procedure that is easily adjustable to experimental needs. The nature of the fittest clone(s) can be determined by whole-genome sequencing on a complex multi-clonal population or by easy gene walking for the rapid identification of selected clones. Here, the non-coding DNA region DARS2, which controls the initiation of chromosome replication in E. coli, was used as an example. The function of DARS2 is known to be affected by replication-associated gene dosage; the closer DARS2 gets to the origin of DNA replication, the more active it becomes. DARS2 was randomly inserted into the chromosome of a DARS2-deleted strain. The resultant clones containing individual insertions were pooled and competed against one another for hundreds of generations. Finally, the fittest clones were characterized and found to contain DARS2 inserted in close proximity to the original DARS2 location.

Determination of the Optimal Chromosomal Locations for a DNA Element in Escherichia coli Using a Novel Transposon-mediated Approach

Here, the power of a transposon-mediated random insertion of a non-coding DNA element was used to resolve its optimal chromosomal position.

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

The optimal chromosomal position(s) of a given DNA element was/were determined by transposon-mediated random insertion followed by fitness selection. In ...

Immunostaining for DNA Modifications: Computational Analysis of Confocal Images

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of enzymatic oxidation of 5mC to 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) as well as detection of N6-methyladenine (6mA) in the DNA of multicellular organisms provided additional degrees of complexity to the epigenetic research. According to a growing body of experimental evidence, these novel DNA modifications may play specific roles in different cellular and developmental processes. Importantly, as some of these marks (e. g. 5hmC, 5fC and 5caC) exhibit tissue- and developmental stage-specific occurrence in vertebrates, immunochemistry represents an important tool allowing assessment of spatial distribution of DNA modifications in different biological contexts. Here the methods for computational analysis of DNA modifications visualized by immunostaining followed by confocal microscopy are described. Specifically, the generation of 2.5 dimension (2.5D) signal intensity plots, signal intensity profiles, quantification of staining intensity in multiple cells and determination of signal colocalization coefficients are shown. Collectively, these techniques may be operational in evaluating the levels and localization of these DNA modifications in the nucleus, contributing to elucidating their biological roles in metazoans.

Newly discovered oxidized forms of 5-methylcytosine (oxi-mCs), 5-hydroxymethylcytosine (5hmC), 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC) may represent distinct DNA modifications with unique functional roles. Here a semi-quantitative workflow for visualization of oxi-mCs' spatial distribution, signal intensity profiling and colocalization is described.

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

For several decades, 5-methylcytosine (5mC) has been thought to be the only DNA modification with a functional significance in metazoans. The discovery of ...

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Investigation of Protein Recruitment to DNA Lesions Using 405 Nm Laser Micro-irradiation

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand genome maintenance mechanisms. Since recruitment and exchange of proteins at lesions are highly dynamic, their study requires the ability to generate DNA damage in a rapid and spatially-delimited manner. Here, we describe procedures to locally induce DNA damage in human cells using a commonly available laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser line. Accumulation of genome maintenance factors at laser stripes can be assessed by immunofluorescence (IF) or in real-time using proteins tagged with fluorescent reporters. Using phosphorylated histone H2A.X (&#947;-H2A.X) and Replication Protein A (RPA) as markers, the method provides sufficient resolution to discriminate locally-recruited factors from those that spread on adjacent chromatin. We further provide ImageJ-based scripts to efficiently monitor the kinetics of protein relocalization at DNA damage sites. These refinements greatly simplify the study of the DDR dynamics.

Studying DNA damage repair kinetics requires a system to induce lesions at defined sub-nuclear regions. We describe a method to create localized double-stranded breaks using a laser-scanning confocal microscope equipped with a 405 nm laser and provide automated procedures to quantify the dynamics of repair factors at these lesions.

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

The DNA Damage Response (DDR) uses a plethora of proteins to detect, signal, and repair DNA lesions. Delineating this response is critical to understand ...

Rare Event Detection Using Error-corrected DNA and RNA Sequencing

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been used to analyze the spectrum of clonal mutations in malignancy. Though far more efficient than traditional Sanger methods, NGS struggles with identifying rare clonal and subclonal mutations due to its high error rate of ~0.5&#8211;2.0%. Thus, standard NGS has a limit of detection for mutations that are &#62;0.02 variant allele fraction (VAF). While the clinical significance for mutations this rare in patients without known disease remains unclear, patients treated for leukemia have significantly improved outcomes when residual disease is &#60;0.0001 by flow cytometry. In order to mitigate this artefactual background of NGS, numerous methods have been developed. Here we describe a method for Error-corrected DNA and RNA Sequencing (ECS), which involves tagging individual molecules with both a 16 bp random index for error-correction and an 8 bp patient-specific index for multiplexing. Our method can detect and track clonal mutations at variant allele fractions (VAFs) two orders of magnitude lower than the detection limit of NGS and as rare as 0.0001 VAF.

Next-generation sequencing (NGS) is a powerful tool for genomic characterization that is limited by the high error rate of the platform (~0.5&#8211;2.0%). We describe our methods of error-corrected sequencing that allow us to obviate the NGS error rate and detect mutations at variant allele fractions as rare as 0.0001.

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

Conventional next-generation sequencing techniques (NGS) have allowed for immense genomic characterization for over a decade. Specifically, NGS has been ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning (STAgR)

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic engineering became applicable to a large range of systems. Moreover, many transcriptional and epigenomic engineering approaches are now generally feasible for the first time. One reason for the broad applicability of CRISPR lies in its bipartite nature. Small gRNAs determine the genomic targets of the complex, variants of the protein Cas9, and the local molecular consequences. However, many CRISPR approaches depend on the simultaneous delivery of multiple gRNAs into individual cells. Here, we present a customizable protocol for string assembly gRNA cloning (STAgR), a method that allows the simple, fast and efficient generation of multiplexed gRNA expression vectors in a single cloning step. STAgR is cost-effective, since (in this protocol) the individual targeting sequences are introduced by short overhang primers while the long DNA templates of the gRNA expression cassettes can be re-used multiple times. Moreover, STAgR allows single step incorporation of a large number of gRNAs, as well as combinations of different gRNA variants, vectors and promoters.

A Customizable Protocol for String Assembly gRNA Cloning STAgR

Here, we present string assembly gRNA cloning (STAgR), a method to easily multiplex gRNA vectors for CRISPR/Cas9 approaches. STAgR makes gRNA multiplexing simple, efficient and customizable.

文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

The bacterial CRISPR/Cas9 system has substantially increased methodological options for life scientists. Due to its utilization, genetic and genomic ...

Assessing Stem Cell DNA Integrity for Cardiac Cell Therapy

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data in all cells, including stem cells, and its integrity is fundamental to its regenerative ability. Stem cells undergo rapid propagation in labs to achieve the necessary numbers for transplantation. Accelerated cell growth leads to the loss of DNA integrity by accumulated metabolites, such as reactive oxygen, carbonyl, and alkylating agents. Transplanting these cells would result in poor engraftment and regeneration of the deteriorating organ. Moreover, transplanting DNA-damaged cells leads to mutations, DNA instability, cellular senescence, and possibly, life-threatening diseases such as cancer. Therefore, there is an immediate need for a quality control method to evaluate the cell's suitability for transplantation. Here, we provide step-by-step protocols for the assessment of the DNA integrity of stem cells prior to cell transplantation.

Here, we provide a detailed description of an experimental setup for an analysis of the assessment of DNA integrity in stem cells prior to cell transplantation.

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

Stem and stem-cell-derived cells have immense potential as a regenerative therapy for various degenerative diseases. DNA is the storehouse of genetic data ...

High-Throughput DNA Plasmid Multiplexing and Transfection Using Acoustic Nanodispensing Technology

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often performed at low throughput, it is moreover time-consuming and error-prone, even more so when multiplexing several plasmids. We developed an easy, fast, and accurate method to perform cell transfection in a 384-well plate layout using acoustic droplet ejection (ADE) technology. The nanodispenser device used in this study&#160;is based on this technology and allows precise nanovolume delivery at high speed from a source well plate to a destination one. It can dispense and multiplex DNA and transfection reagent according to a predesigned spreadsheet. Here we present an optimal protocol to perform ADE-based high-throughput plasmid transfection which makes it possible to reach an efficiency of up to 90% and a nearly 100% cotransfection in cotransfection experiments. We extend initial work by proposing a user-friendly spreadsheet-based macro, able to manage up to four plasmids/wells from a library containing up to 1,536 different plasmids, and a tablet-based pipetting guide application. The macro designs the necessary template(s) of the source plate(s) and generates the ready-to-use files for the nanodispenser and tablet-based application. The four-steps transfection protocol involves i) a diluent dispense with a classical liquid handler, ii) plasmid distribution and multiplexing, iii) a transfection reagent dispense by the nanodispenser, and iv) cell plating on the prefilled wells. The described software-based control of ADE plasmid multiplexing and transfection allows even nonspecialists in the field to perform a reliable cell transfection in a fast and safe way. This method enables rapid identification of optimal settings for a given cell type and can be transposed to higher-scale and manual approaches. The protocol eases applications, such as human ORFeome protein (set of open reading frames [ORFs] in a genome) expression or CRISPR-Cas9-based gene function validation, in nonpooled screening strategies.

This protocol describes high-throughput plasmid transfection of mammalian cells in a 384-well plate using acoustic droplet ejection technology. The time-consuming, error-prone DNA dispensing and multiplexing, but also the transfection reagent dispensing, are software-driven and performed by a nanodispenser device. The cells are then seeded in these prefilled wells.

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

Cell transfection, indispensable for many biological studies, requires controlling many parameters for an accurate and successful achievement. Most often ...

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

要約

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この動画の章

患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

In Vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

Cpf1を用いたC-ブリックDNA標準アセンブリのプロトコール

要約

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患者の組織のためのメチル結合DNA捕捉シーケンシング

新規トランスポゾンを介したアプローチを使用してエシェリヒア属大腸菌DNA 要素の最適な染色体の場所の決定

DNA 変更染色: 共焦点画像の数値解析

In Vivoモデル システムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

405 Nm レーザ マイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査

エラー修正 DNA ・ RNA シーケンスを用いた珍しいイベント検出

ミトコンドリア DNA のメチル化の正確な検出のための方法論

文字列アセンブリ gRNA のカスタマイズ可能なプロトコル (STAgR) のクローニング

心臓の細胞治療幹細胞 DNA の完全性を評価します。

音響ナノディスペンス技術を用いたハイスループットDNAプラスミド多重化とトランスフェクション

In Vivoモデルシステムとしてゼブラフィッシュを用いた DNA 複製タイミングのプロファイリング

405 Nm レーザマイクロ照射による DNA 損傷にタンパク質募集調査