New Hampshire-INBREの支援を受け、NIHの全米医科学研究所の施設開発賞（IDeA）、P20GM103506によって支援されました。

注：各アッセイの時間の考慮事項は、個々の培地調製が異なる時間を必要とするために行う必要があります。例えば、固体寒天プレート培地は、十分に冷やして乾燥させるべきである（1~2日）。追加の時間の考慮（ すなわち、単一コロニーおよび一晩の培養増殖）は、各プロトコルの下で特定され、 表2に見られる。 1.メディアの準備<ol><li> 1×リン酸緩衝食塩水（PBS） <ol><li> 4.0gのNaCl、0.1gのKCl、0.72gのNa 2 HPO 4 、および0.12gのKH 2 PO 4を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水で容量を500mLに調整し、pH計を用いてpHを7.2に調整し、HClを溶液に滴下し、0.22μmフィルターを用いてオートクレーブまたはフィルターで滅菌する。 1x PBSは室温で無期限に保存できます。 注意：HClは濃酸ですので、施設、地方、州、および連邦の規制に適用されます。適切な取り扱いガイドラインについては、製造元が提供する安全性データシートを参照してください。 </li></ol></li><li> Luria-Bertani（LB）ブロス <ol><li> 5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、および2.5gのNaClを計量する。構成成分を1Lボトルに混合し、脱イオン水、オートクレーブで容量を500mLに調整し、室温で最大6ヶ月間保存する。古典的なバイオタイプ毒性誘発条件については、オートクレーブする前にHClを用いてpHを6.5に調整する。 </li></ol></li><li> 0.03％（w / v）のNaHCO 3を含有するAKI培地 <ol><li>成分1（AKI培地）について：ペプトン7.5g、酵母エキス2.0g、NaCl 2.5gを計量する。構成成分を1Lボトルに混合し、脱イオン水およびオートクレーブで容量を450mLに調整する。 AKI培地は、室温で最大6ヶ月間保存することができます。 </li><li>成分2（NaHCO 3 ）の場合：1.5gのNaHCO 3を秤量し、滅菌ベシクル中の脱イオン水で50mLに希釈する。 0.22μmフィルターを使用してNaHCO 3を濾過滅菌する。 NaHCO 3は、使用直前に調製しなければならない。 </li><li>使用前にコンポーネント2をコンポーネント1にフィルタリングすることにより、1：10の比率を作成する2つのコンポーネントを無作為に組み合わせます。 </li></ol></li><li> Luria-Bertani（LB）寒天プレート <ol><li> 5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、2.5gのNaCl、および7.5gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水、オートクレーブで容量を500mLに調整し、標準サイズの100mm×15mm滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、最大6ヵ月間プラスチックで包まれ、4℃で蓋の上に保管されます。 </li></ol></li><li> ポリミキシンBを補充したLB寒天プレート <ol><li>成分1（LB寒天）の場合：5.0gのトリプトン、2.5gの酵母エキス、2.5gのNaCl、および7.5gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコに混合し、容量を500mLに調整する脱イオン水およびオートクレーブに入れた。 </li><li>成分2（ポリミキシンB）の場合：ポリミキシンBを脱イオン水に滅菌2 mL微量遠心チューブで50,000 IU /μLの濃度で溶解し、0.22μmフィルターを使用してフィルター滅菌する。 </li><li>成分1が触ってもまだ凝固していないが、凝固していない場合は、無菌的に成分2に500μLを加えて最終濃度50IU /μLとし、完全に混合する。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、標準サイズの100mm×15mmの滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、3ヵ月まではプラスチックで包まれ、4℃では蓋の上に保管されます。 </li></ol></li><li> 最小クエン酸培地寒天培地 <ol><li>成分1（ブロモチモールブルーを含む寒天）：7.5gの寒天と0.02gのブロモチモールブルーを計量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコ中で混合し、脱イオン水で容量を450mLに調整し、混合物をオートクレーブする。 </li><li>コンポーネント2（10x VBMM）の場合：10.06gのMgSO 4・ 7H 2 O、10.0gのクエン酸H 2 O、50.0gの無水K 2 HPO 4 、および17.5gのNaNH 4 HPO 4・ 4H 2 Oを含む.1L三角フラスコ中の成分を合わせ、500mL 0.22μmのフィルターを用いて脱イオン水およびオートクレーブまたはフィルターで滅菌する。 10x VBMMは室温で6ヶ月まで保存できます。 </li><li>成分1に50mgの成分2を添加し、混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、標準サイズの100mm×15mm滅菌ペトリ皿で調製する。メッキされた培地は、最大6ヵ月間プラスチックで包まれ、4℃で蓋の上に保管されます。 </li></ol></li><li> ミルク寒天プレート <ol><li>構成成分1（ミルク）の場合：1リットル三角フラスコ中で脱脂粉乳8.0gを秤量し、脱イオン水およびオートクレーブで容量を200mLに調整する。 </li><li>成分2（脳心臓注入を伴う寒天）：脳心臓注入物3.68gおよび寒天6.0gを秤量する。コンバインド500 mLの三角フラスコに入れ、脱イオン水とオートクレーブで容量を200 mLに調整する。 </li><li>オートクレーブ後、成分2を成分1に注ぎ、2つの成分を混合し、完全に混合する。 150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。ミルクプレートは、プラスチックで包まれた1週間まで保存することができ、リッド側は4℃で保存することができます。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。 </li></ol></li><li> 運動性寒天プレート <ol><li>成分1（LB寒天）について：5.0gのトリプトン、2.5gの酵母抽出物、2.5gのNaCl、および2.0gの寒天を秤量する。成分を1Lエルレンマイヤーフラスコに入れ、脱イオン水とオートクレーブで容量を500mLに調整する。 </li><li>成分2（1％（w / v）塩化トリフェニルテトラゾリウム; TTC）：0.25gのTTCを秤量する。滅菌ベシクル内の脱イオン水で25 mLに調整し、0.22μmフィルターを使用してフィルターを滅菌します。室温で6ヶ月間保管してください光の暴露を最小限にするために箔で覆われています。 </li><li> 2.5mLの1％（w / v）滅菌TTCをオートクレーブした培地に加える。 </li><li>大150 mm×15 mmの滅菌ペトリ皿に培地をできるだけ厚く（≧50 mL /プレート）注ぎます。メッキされた培地は、1週間までプラスチックに包まれ、4℃で蓋が上になるように保管することができます。混合寒天培地をペトリ皿に注ぐことにより、150mm×15mmの無菌ペトリ皿で調製する。 </li></ol></li><li> ヴォーグ・プロスカウアー（VP） <ol><li>成分1（Methyl Red-Voges-Proskauer broth; MR-VP）：500mLの三角フラスコ中で1.7gのMR-VP培地を秤量し、脱イオン水およびオートクレーブで100mLに調整する。無菌MR-VPブイヨンは、室温で最大6ヶ月間保存することができます。 </li><li>成分2（5％（w / v）アルファ（α）ナフトール）：滅菌ベシクル中で1.0gのα-ナフトールを秤量し、95％エタノールで20mLに調整する。 α-ナフトールは、光を最小限に抑えるために、ホイルで包んだ最長1週間室温で保存することができますオスレ。 </li><li>成分3（40％（w / v）水酸化カリウム; KOH）：滅菌ベシクル中で20.0gのKOHを秤量し、滅菌脱イオン水で50mLに調整する。 KOHはプラスチック容器内で室温で6ヶ月まで保存することができます。 </li></ol></li></ol> 2. Vの維持と成長コレラ菌株<ol><li> 凍結ストック培養物の調製および使用 <ol><li>滅菌2 mL微量遠心管内で遠心分離（≧8,600 xg）により2分間、1.8 mLの液体一晩培養し、上清を除去し、新鮮なLBブロス900μLにピペットで再懸濁する。 </li><li>滅菌60％（v / v）グリセロール900μLを培養液に加え、ボルテックスで混合する。 </li><li>混合物を滅菌2 mL極低温チューブに移し、無期限に-80°Cで保存します。 </li><li>使用するには、滅菌接種ループを使用して少量の凍結ストックを除去し、LB agarプレート。培養物が完全に解凍するのを防ぐため、使用後は直ちに凍結保存液を-80℃に戻します。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li></ol></li><li> 液体培地中での一夜培養の増殖 <ol><li>凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニー（セクション2.1.4による）についてのストリーク。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li><li>無菌のアプリケータースティックで単一のコロニーの表面に触れ、コロニーを液体ブロスに移すことによって、単一のコロニーを有する滅菌10mL培養チューブ中に液体LBブロス4mLを接種する。 </li><li> 37℃で12〜16時間、225rpmでのシェーカーインキュベーター中での通気によりインキュベートする。 </li></ol></li><li> 成長曲線 <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。 </li><li> 250μLの一晩培養液を2に移すことによって一晩培養物を1：100に希釈する滅菌250mL三角フラスコ中の5mLの新鮮なLBブロス。 </li><li>接種時（T 0 ）に開始する毎時600nm （OD 600 ）の液体培養物の光学密度を測定する。 </li><li> 37℃で30時間まで225rpmのシェーカーインキュベーター中で、または培養物が最大密度に達するまで、1：100希釈の一晩培養物をインキュベートする。 </li><li> OD 600対時間をグラフ化し、線形回帰を使用して各株のおよそ2倍の時間を決定する。 </li></ol></li><li> El Tor Biotype毒性誘導条件 <ol><li>凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニーの連鎖。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li><li> 0.03％（w / v）のNaHCO 3を含む10mLのAKI培地に単一のコロニーを接種する。 </li><li>通気せずに37℃で3.5時間培養物をインキュベートする。 </li><li> 7 mLの培養液を除去し、残りの3 mLの培養液をインキュベートする。さらに4時間225rpmでシェーカーインキュベーター内で通気させる。 </li></ol></li><li> 古典的なバイオタイプの病原性誘導条件 <ol><li>凍結ストックからLB寒天プレート上への単一コロニーの連鎖。 37℃で12〜16時間、プレートの蓋を下にしてインキュベートする。 </li><li>単一のコロニーを有する4mL液体LBブロス（pH6.5）を接種する。 </li><li> 30℃で12〜16時間225rpmでシェーカーインキュベーター中で通気してインキュベートする。 </li></ol></li><li> 1×PBS中で細胞ペレットを洗浄する <ol><li>滅菌2 mL微量遠心管内で遠心分離（≧8,600 xg）により2分間、1.8 mLの一晩培養し、ピペットを用いて上清を除去する。ピペッティングにより1.8mLの1×PBS中で細胞ペレットを再懸濁する。 </li><li>洗浄手順を3回繰り返した後、1.8mLの1×PBSで最終的に再懸濁する。 </li></ol></li></ol> 3. Vのキャラクタリゼーション。 コレラバイオタイプ<ol><li> PctxBおよびtcpAを用いたCRベースの遺伝的スクリーニング<ol><li> ctxBおよびtcpAの翻訳開始および停止部位の上流および下流にそれぞれ約50〜70bpをアニールするプライマーセットを設計する。 </li><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。 </li><li>グラム陰性細菌用に設計された市販のキットを用いて染色体DNAを単離する。精製された染色体DNAは、-20℃で無期限に保存することができます。市販のキットを用いた染色体DNA単離は、一般に約4時間かかる。 </li><li>微量分光光度計を使用して、染色体DNAサンプルが高品質であることを確認します（A 260/280 &gt; 1.8）。 </li><li>各染色体DNA単離物について、滅菌200μLPCRチューブ中で氷上でポリメラーゼ連鎖反応（PCR）を行い、標準PCR成分を用いてctxBおよびtcpAの領域を増幅する： Taqポリメラーゼおよびbuffer（または等価物）、dNTP溶液、およびフォワード/リバースプライマーを含む。標準的なPCRパラメータを使用する（約3時間）。たとえば、次のプロトコルを使用します。 <ol><li> 95℃で120秒間の初期変性。 </li><li> 95℃で60秒間変性させる。 </li><li> 60℃で45秒間アニールプライマー。 </li><li> 72℃で90秒間伸長する。 </li><li>手順3.1.5.2〜3.1.5.4を34サイクル繰り返します。 </li><li>最終伸長は72℃で600秒。 </li><li> 4℃で無限に保持する。 </li></ol></li><li>標準的な6×DNAゲルローディング色素を用いて5μLのそれぞれのPCR産物を染色し、1×トリス - ボレート-EDTA（TBE）中の1％アガロースゲル上に約10μLの1kbラダーおよび10μLのPCR産物を負荷する。バッファ。 </li><li>染料フロントがゲルの末端に到達するまで（130分）、130Vでゲル電気泳動を行う（約90分）。一定の監視は電圧として推奨され、実行時間は機器によって異なります。 </li><li>確認時期待されるサイズでのPCR増幅が成功したら、市販のDNAクリーン＆コンセントレーターキットを使用して残りの45μLPCR産物を精製する。 </li><li> PCR増幅に使用したのと同じプライマーを用いてPCR産物を精製し、局所シーケンシング施設のガイドラインに従って調製する。 </li><li>各単離物からの遺伝子配列のFASTAフォーマットと、NCBIウェブサイト（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/）で入手可能な公開配列とを、検索クエリーボックス内の以下の受託番号を検索することによって比較する。 </li><li> ctxB ：VC0395_A1059からVC0395_A1060（El Tor）までの（古典的な）領域VC_1456 </li><li> tcpA ：（古典的）VC0395_A0353（エル・トール）VC_0828 </li></ol></li><li> スポッティングによる生物型分類のための表現型アッセイ <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LB培地で一晩培養します。 </li><li>プロトコル2.6で指定されているように細胞ペレットを洗浄する。 </li><li>ピペットを使用して洗浄した培養液1μLをそれぞれの培地にスポットする。培地の選択およびインキュベーションの仕様については、表2を参照してください。 </li></ol></li><li> 運動性アッセイ <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LBブロス中で一晩培養液を調製する。 </li><li>プロトコル2.6で指定されているように細胞ペレットを洗浄する。 </li><li>接種したスタブを洗浄した液体培養物に挿入し、培地中に垂直に「刺す」ことにより、運動性寒天プレートに接種する。各接種の間に、ブンゼンバーナーを用いてワイヤースタブを滅菌し、寒天を刺したら接種したスタブが曲がらないようにしてください。 </li><li> 37℃で14〜24時間、プレートの蓋を上にしてインキュベートする。 14時間後、運動性プレートを密接にモニターして、培養物の過剰増殖を防ぐ。 </li></ol></li><li> Voges-Proskauer（VP）アッセイ <ol><li>プロトコール2.2に記載されているように、液体LBブロス中で一晩培養液を調製する。 </li><li>接種4前もって調製した一晩培養物10μLを滅菌培養チューブ中の4mLのMR-VPブロス中にピペッティングし、シェーカー・インキュベーター中で225rpmで12〜16日間曝気してインキュベートすることにより、メチルレッド・ボージュ・プロスカウアー、 hで37℃でインキュベートした。 </li><li>滅菌培養管中でMR-VP一晩培養の1mLアリコートに5％（w / v）α-ナフトール150μLおよび40％（w / v）KOH50μLをそれぞれ添加する。 </li><li>短時間ボルテックスして、色の変化が生じるまで室温で4時間まで放置する。 </li></ol></li></ol>

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著者は何も開示することはない。

200以上の識別されたVのうち、 コレラ血清型、O1およびO139のみが流行の可能性がある。 O1血清群は、古典的およびエル・トールという2つのバイオタイプに分類することができる。しかしながら、El Tor変異体13,17と呼ばれるハイブリッド株は、El Torバイオタイプの背景を有し、古典的な特徴8,9,10,11,12,13,14,15,16,17を有する。この原稿に記載されているプロトコルは?...

コレラ（Cholera）は、水生グラム陰性細菌であるコレラ菌（Vibrio cholerae）を含む汚染された食物または水の消費によって引き起こされる遠位小腸の病気である。 コレラの症状には、吐き気や制御不能な水様の下痢があり、重度の脱水症状につながり、適切に治療しなければ死に至る。 V。 コレラは、細胞表面リポ多糖O-抗原の構造に基づいて200を超える血清群に分けることができる。しかし、O1とO139の2つの血清群のみが、流行またはパンデミックの可能性1,2を示している。さらに、血清群O139は、主に東南アジア3、4に単離され、血清群O1は世界中に分布している。さらに、O1血清群は、2つの主なバイオタイプに分類することができる：クラシックおよびエル・トール。古典的なバイオタイプは、最初の6つのコレラパンデミック進行中の第七のパンデミックは、環境の古典的バイオタイプを世界的に置き換えたEl Torバイオタイプの結果である5,6,7 。最近、古典的およびエルトールバイオタイプ8,9,10,11,12,13,14,15,16,17の両方の顕著な特徴を含む株が生じており、以来、El Torバリアント13,17と呼ばれている。一部のEl Tor変異体は、以前に観察されたものよりも迅速かつ重度の疾患進行を伴って病原性能力の上昇を示しており、代理人の特定と疾病の予防と治療に対するより包括的なアプローチの必要性8,9,18。バイオタイプの同定は治療を即座に指示しないが、ワクチン開発および将来の治療剤のさらなる進歩は、バイオタイプの区別の恩恵を受ける可能性がある。 ここに記載された最初の一連のプロトコルは、研究者がVを適切に維持することを可能にする。実験室環境でのコレラ菌株。一貫性およびその後の分析には、バイオタイプに依存しない分離物のストック調製および増殖が必要である。しかし、病原性遺伝子発現を最適に誘導するためには、独立した生物型特異的培養技術が必要とされる19 。さらに、様々な遺伝的および生化学的アッセイのための準備がこの原稿に概説されている。 コレラトキシン（CT）と毒素が共存する（ V）の両方のバイオタイプにおいて、マスターレギュレーターToxTによって制御される2つの主要なビルレンス因子である。 コレラ O1血清群20 。 CTは、5つのCtxB 単一のCtxAサブユニットを取り囲むサブユニットであり、コレラに伴う急速な電解質損失を引き起こす。 TCPは、 tcpオペロン（ tcpABQCRDSTEF ）によってコードされるIV型線毛であり、遠位小腸の付着およびコロニー形成に関与する。 tcpAは、線毛8の構築に必須の個々のピリンサブユニットをコードするtcpオペロンの最初の遺伝子である。 ctxAの遺伝子配列は、古典型とEl Torのバイオタイプの間で完全に保存されていますが、 ctxBとtcpAは2つのバイオタイプで異なりますが、各バイオタイプ8内で保存されています。 ctxBは、2塩基posi以外のバイオタイプ間で完全に保存されている（115と203）。 El Torバイオタイプでは、チミンは塩基番号115および203に存在し、古典的なバイオタイプはこれらの塩基にシトシンを含む。 tcpAは、各バイオタイプ内で完全に保存されているが、バイオタイプ間の複数の塩基で異なる。これらの遺伝子の区別は、一次バイオタイプ同定マーカーとして役立ち、これらの部位を含むポリメラーゼ連鎖反応（PCR）増幅産物の配列決定後、野生型（WT）古典的O395またはWT El Tor N16961と比較して、 CTおよびTCPの、それぞれ、 V. cholerae分離株における。 古典的およびEl Torバイオタイプ21,22,23の間の表現型の特徴を特徴付けるために、多数のプロトコルが開発されている。ポリミキシンBは、グラム陰性菌の外細胞膜の完全性を危うくするペプチド抗生物質であるテリアおよびポリミキシンB耐性は、ポリミキシンB耐性アッセイ21を介して視覚化することができる。クエン酸塩はクレブスサイクルの主要な基質であり、唯一の炭素源としてクエン酸塩を代謝する能力は、クエン酸代謝アッセイ22を用いて決定することができる。 hapR は、様々なプロモーター領域に結合し、遺伝子およびオペロンの発現を調節する、 V. cholerae、 HapRのグローバルレギュレーターおよびマスタークオラムセンシングレギュレーターをコードする24 。 V. choleraeのいくつかの病原性株は、 病原性遺伝子発現のこの密度依存的調節を失わせたhapR遺伝子に天然に存在するフレームシフト突然変異を有する24,25 。乳寒天培地を用いてHapR調節プロテアーゼ活性を測定することにより、研究者は、特定の単離物が機能的HapR 23を含むかどうかを同定することができる。ザ赤血球を溶解する溶血酵素を分泌する株の能力についての溶血アッセイ試験;血液寒天プレート23上に溶血の程度を視覚化することができる。運動性はしばしばコレラ菌の病原性に関連し、運動性寒天プレート23を用いて分析することができる。 Voges-Proskauerアッセイは、唯一の炭素源としてグルコースを発酵させ、副産物アセトイン21を産生する株の能力を試験する。 El Tor変異体の出現により、広範な遺伝子型スクリーニングなしに、およびVのバイオタイプバックグラウンドを推定する前に、任意の表現型アッセイの結果を予測することは困難である。 コレラ菌単離物の場合、アッセイ23のこのアセンブリを実施し、その結果を表2のような参照株と比較することが推奨される。 ここでは、一連のプロトコルを進めており、これらのプロトコルをまとめて使用していますVを特徴付けるためのより包括的なアプローチのための遺伝子型および表現型アッセイを提供する。 コレラバイオタイプ。さらに、我々は既知のVの遺伝子型と表現型の区別を述べた。 （WT古典的なO395、WT El Tor C6706、およびWT El Tor N16961; 表1 ）と比較して、コレラエルEl Tor変異体（MQ1795およびBAA-2163）を使用した。 El Tor変異体の出現は、以前に採用された単一アッセイバイオタイプの特徴付けプロトコルの信頼性に対する課題を提示した。しかしながら、この複数のアッセイ同定システムは、臨床的および環境的Vのより信頼性の高い特徴付けを可能にする。 コレラ分離株。

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glycerol</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agar with brain-heart infusion</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&amp;amp;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&amp;amp;_dynSessConf=1766917479792147141&amp;amp;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&amp;amp;lastLanguage=en&amp;amp;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&amp;amp;_D%3AcurrentLanguage=+&amp;amp;currentLanguage=en&amp;amp;_D%3AlastLanguage=+&amp;amp;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P288500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Blood Agar Plates</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C;&amp;nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A73500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromothymol Blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=B38810&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Cirtric acid &amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S311500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator&amp;trade; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr><tr><td>Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Corrosive;&amp;nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A144212&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P217500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P285500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P250500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr><tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=M63500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&amp;amp;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&amp;amp;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Broth</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S374500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S27110&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S233500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S218500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophtometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>Nonfat dry milk</td><td>Nestle Carnation</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=FB0875714&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Store at 2-4 &amp;deg;C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_pageLabel=search_page&amp;amp;sfMode=search&amp;amp;sfStartNumber=1&amp;amp;clearQR=true&amp;amp;js=1&amp;amp;searchString=1840148&amp;amp;database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&amp;amp;tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Triphenyltetrazolium chloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=BP1521&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

水生グラム陰性菌であるビブリオ・コレラ（Vibrio cholerae）は、感染性胃腸疾患コレラの病原体である。この病気の世界的な有病率および重症度のために、 V 。 コレラは環境および実験室の環境の両方で広範に研究されており、適切な維持および培養技術が必要である。古典とエルトールは、 Vを構成する2つの主要なバイオタイプです。 コレラ菌 O1血清群であり、それぞれがバイオタイプの特徴付けのための信頼性のある機構を提供するユニークな遺伝子型および表現型特性を示し、培養条件を誘導する特異的ビルレンスを必要とする。所与の感染またはアウトブレイクの原因となる菌株のバイオタイプに関わらず、この疾患の標準的な治療には、抗生物質のレジメンを補充した再水和療法が含まれる。しかしながら、バイオタイプの分類は、実験室研究に必要であり、生物医学分野においてより広い影響を及ぼす可能性がある。2000年代初期には、古典的およびEl Torバイオタイプの両方からの遺伝子型および表現型形質を示す臨床分離株が同定された。 El Tor変異体と呼ばれる新しく同定されたハイブリッドは、従来の伝統的な単一アッセイ同定プロトコールよりも臨床的および環境的な分離生物型同定をより複雑にしている。 Vを記述することに加えて。 （ ctxBおよびtcpA ）PCRベースの遺伝子スクリーニングおよび表現型アッセイ（ポリミキシンB耐性、クエン酸代謝、タンパク質分解活性、溶血活性、運動性、およびグルコース代謝）を、Voges- Proskauerアッセイ）は、古典的なタイプとEl Torのバイオタイプを特徴付けるおよび/または区別するために集合的に使用された。一緒に、これらのアッセイは、代用品として、または加えて、特徴的な費用のかかる労働集約的実験に使用される効率的な体系的アプローチを提供するVの コレラ（臨床的および環境的）分離株。

任意の細菌株の適切な維持および使用のために、目的の株の倍加時間を知ることが推奨される。ここでは、一般に使用されるVの変化する成長速度が、 コレラ菌株は増殖曲線により示され、近似倍化時間は線形回帰を用いて計算された。 WT El Tor N16961およびEl Tor変異体MQ1795は、WT古典的O395（〜2時間）より短い倍加時間（それぞれ〜1時間および〜1時間）を...

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Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

この原稿は、一連の生化学的アッセイに加えて、適切なビブリオコレラ（Vibrio cholerae）の維持技術を説明し、臨床的および環境的V間の迅速かつ確実な区別のために集合的に利用される。 コレラバイオタイプは実験室環境で使用されます。

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術<em&gt;コレラ（Vibrio cholerae）</em&gt;臨床分離株

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.8K ビュー.  Plymouth State University. この原稿は、一連の生化学的アッセイに加えて、適切なビブリオコレラ（Vibrio cholerae）の維持技術を説明し、臨床的および環境的V間の迅速かつ確実な区別のために集合的に利用される。 コレラバイオタイプは実験室環境で使用されます。 

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Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

I am Es.In MindUP, we study biology of human pathogens in non hosts environments. Many human pathogens after exiting their human host have to survive in the environment before infecting another host. So our goal is to better understand processes that control survival of human pathogens in the environment.And our goal is to then better understand transmission dynamics of infectious agents. So we are using Vibrio cholera, the cost of agent of diarrhea, disease, cholera as a model organism. Vibrio cholera is a facultative human pathogen and it has an aquatic lifecycle.Therefore, it provides us great opportunity to study the survival of human pathogen in a natural environment. There are many tools to study this organism. Its genome is completely sequenced and there are micro array representing every gene in the genome.And furthermore, there are many tools that we can manipulate the genome of this organism. My research program takes advantage of these tools and integrates them to study aquatic lifecycle of cholera. So in our experiments, we try to simulate the aquatic environments that organism lives in.And then we would like to know how does this organism so senses fluctuations in its environment with respect to nutrient load, temperature, salinity, or other biological stressors such as pages and tzo? So in aquatic environment, RIA cholera is found either in a free living form or in a surface attached form. And the surface attached forms are known as biofilms, which are simply composed of microorganisms and their extra polymeric substances, which can be exo polysaccharide and proteins and sometimes DNA.And this matrix acts as a glue and hold the organism together. And when grown in biofilm mode, these organisms are actually resistant to fluctuating parameters of their environments and they can be better protected from, for example, phage and proteasome probations. And these are factors that are controlling abundance of microorganisms in the environment.Some of the recent techno technological advance that helped us in our studies are the completion of the genome sequence of the organism and development of microray technology. Using these technologies, we can determine at the whole genome level how this organism responds to major fluctuations in its environment such as nutrient deprivation or changes in temperature. Or one of our major goal is to integrate our whole genome expression studies to a network analysis.So we would like to identify genetic regulatory network that controls response of to fluctuating environmental parameters. We would like to be able to model behavior of organism in the environment. And also we still do not know when in the environment with whom Vibra Cide interacts with.We do not know much about ecology of this organism, and we also do not know relevance of the genes and processes we identified to be important for survival of this organism in the laboratory to the real world. No are the genes that we identified express when Ria cholera is present in natural environment. We also would like to be able to identify and culture organisms that Vibrio Cora interacts with because in the environment, Vibrio Cora is a part of the complex microbial community.So I think understanding biology of Vibrio Cora in natural environment would be a, it's a challenging and it's critical for us to understand biology of the organism. Within the next five years, I hope that we would be able to better characterize op polysaccharide components of biofilms. For example, in Vibrio cholera, we still do not know structure of the op polysaccharide that is holding the cells together.We also do not know all the components of biofilm metrics. Eventually I think it be great to be able to quantify components of the biofilm metrics in natural biofilms of these organisms. I think another major challenge is to study, be OC in natural environment.And I hope that we would be able to take advantage of comparative genomic studies and combine whole genomic expression profiling comparative genomics to better understand evolution of IBR cholera as a pathogen.

コレラ菌：細菌性病因を研究するモデル生物 - インタビュー

生物学

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

免疫・感染学

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - 遺伝的に変更する方法<em&gt;コレラ菌</em&gt;自然形質転換およびFLP組換えに基づき

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

培養およびメンテナンス<em&gt;クロストリジウム·ディフィシル</em&gt;嫌気性環境での

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;その他<em&gt;ビブリオ</em&gt;種

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

細胞分化および単細胞イメージングの誘導<em&gt;腸炎ビブリオ</em&gt;スイマーとスマーマー細胞

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル<em&gt;エシェリヒア·コリ</em&gt;と<em&gt;コレラ菌</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術

要約

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コレラ菌：細菌性病因を研究するモデル生物 - インタビュー

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

TransFLP - 遺伝的に変更する方法

培養およびメンテナンス

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発

細胞分化および単細胞イメージングの誘導

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオフィルム形成: 同定及び定量化の手法

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュモデルで下痢を定量化

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル

バイオタイプの維持と差別化に使用される実験技術

要約

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コレラ菌：細菌性病因を研究するモデル生物 - インタビュー

ウイルス性病原体のために臨床サンプルをスクリーニングするためにパンウイルスマイクロアレイアッセイ（Virochip）を使用して、

TransFLP - 遺伝的に変更する方法

培養およびメンテナンス

の検出のためのより高感度で特異的な発色性寒天培地の開発

細胞分化および単細胞イメージングの誘導

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオ フィルム形成: 同定及び定量化の手法

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

ビブリオ・フィシェリ・アイシス間の競争的相互作用を定量化するためのコインキュベーション・アッセイ

エレクトロ作成のための迅速なプロトコル

腸管病原体の胆汁酸塩によるバイオフィルム形成: 同定及び定量化の手法

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュモデルで下痢を定量化