おかげでメロディー ニーリー, ジョンアレン、バーゼルの Abuaita とドナ Runft ゼブラフィッシュ モデルの開発を助けることに彼らの努力のため。ここで報告された研究は、国立研究所のアレルギーと感染症 [受賞番号 R21AI095520 と R01AI127390 (ジェフリー ・ h. Withey) に健康の国民の協会によって支えられました。内容は著者の責任と国立衛生研究所の公式見解を必ずしも表さない。

ここで説明したすべてのメソッドは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) ウェイン州立大学によって承認されています。このメソッドは最初に Runftらの説明12
1. 腸の植民地化のレベルの決定
注: 相対フィットネス系統のコレラまたは突然変異や遺伝子のノックアウトの効果を比較する使用できるように、腸の植民地化はゼブラフィッシュ モデルで最も有用な指標です。
<ol><li>浸漬によるゼブラフィッシュの接種 注: 露出のつまり感染症の自然経過と似ています。<ol>
<li>コレラの準備
		<ol>
<li>ホストゲノム スープ (LB)、分離のコレラとの 5 mL を接種する LB から植民地板し、6-8 時間 (夜間文化) 37 ° C (180 rpm) を揺れインキュベートします。</li>
			<li>上記の宿泊文化の 50 μ L で 250 mL の三角フラスコに新鮮なオートクレーブ LB 培地の 25 mL を接種します。それは揺れ (150 rpm) で 37 ° C で 16-18 時間孵化させなさい。</li>
			<li>600 の光学濃度を読む 1 mL あたりの菌数を推定するため一晩文化の 1/10 希釈の nm (外径600) (外径600 = 1 は 10 〜9 CFU/mL)。</li>
			<li>ピペットでメディア 6,000 g で 10 分間削除での遠心分離によって細胞を収穫したり消毒液にオフそれを注ぐ。目的の濃度は、通常の 1 x 107 1 x 10 の10 ml の PBS あたり間滅菌 PBS で細胞を再懸濁します。 注: ここでは、我々 はオートクレーブ逆浸透水滅菌感染水として 60 mg/L 海塩を含むを参照してください。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
接種と培養
		<ol>
<li>滅菌感染水 200 ミリリットルを含む 400 mL ビーカーに 4 つまたは 5 つのゼブラフィッシュを配置します。</li>
			<li>感染水の 200 mL の目的感染濃度 (通常 5 × 104 5 x 107 CFU/mL) を取得する (ステップ 1.1.1.4) からのコレラの 1 mL を追加します。</li>
			<li>ジャンプから魚を防ぐために穴あきふた付きビーカーをカバーします。200 μ L チップ ボックスの上部はこのためにうまく動作します。</li>
			<li>各ビーカーにラベルを付けるし、実験の期間の 28 ° C で設定前面ガラスの定温器に配置します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
一時的な露出のための手順 注: 接種した細菌の除去が続くコレラ(通常 6 h) に一時的な露出は伝送を勉強し、排泄細菌のより正確な定量化するのに役立ちます。<ol>
<li>露出の 6 h 後魚を収集するために網タイツをビーカーの水を注ぐ。コレラを殺すために漂白剤の容器には、感染した水を破棄します。</li>
			<li>滅菌感染水の 200 mL のビーカーに削除された魚を配置します。魚魚から表面の細菌を除去するために 5 分でこのきれいな水で泳ぐことができます。</li>
			<li>Net 手順 (ステップ 1.2.2) を繰り返し、新しい滅菌感染水を 200 mL ビーカーに魚を置きます。このビーカーで実験の期間の魚を保ちます。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>安楽死
	<ol>
<li>実験が目的のエンドポイントに達したら、感染のサンプル水を取る (15 mL は通常十分な) 排泄の細菌数と下痢 (ムチン アッセイ、たんぱく、OD など) の計測を可能にする場合に必要な (セクション 2)。</li>
		<li>(魚を集める) に網目を通して水の残りを注ぎ、コレラ水を殺すために漂白剤。</li>
		<li>感染水に加えて 336 μ g/mL のエチル 3-アミノ安息香酸メタンスルホン酸 (tricaine) を含むビーカーに魚を置き、室温に 20 分間この tricaine ソリューションで魚を孵化させなさい 注: フィッシュ ネット 10% の漂白剤溶液で殺菌されました。</li>
	</ol></li>
	<li>郭清
	<ol>
<li>魚の準備<ol>
<li>使い捨てのプラスチック スプーンで tricaine ソリューションから魚をすくうし、解離性の表面の上に置きます。</li>
			<li>位置の腹側を上向きに、ピンで魚体の中心から離れて角度ピンの鈍端と下顎を介して。別のピン配置も体から離れて角度、肛門にちょうど後部。</li>
		</ol>
</li>
		<li>腸管の露出<ol>
<li>綿棒 - リントフリーで魚の腹側表面は、70% エタノールに浸漬。</li>
			<li>70% エタノールに浸漬して、それらを炎のメスと Vannas のはさみを滅菌します。</li>
			<li>スケールを貫通し、メスを使用して皮膚のすぐ下の腹で縦の小切開を作る。腸管は皮膚のすぐ下に位置する、あまりにも深く切らないように注意してください。</li>
			<li>はさみを使って、皮膚レベルよりも深い切断の肛門を回避、体の長さに沿って慎重に切開を拡張します。</li>
			<li>切開の開くことを許可する魚の頭に向かってハサミで 2 つの水平カットを作る。</li>
			<li>体から、ピンを釣り、解離性表面に横切開の各側に皮膚をピンします。 注意: ピンの先端が以前アルコールとそれらを燃やすことによって殺菌します。</li>
		</ol>
</li>
		<li>
腸管の除去 注: 腸管が他の臓器の上に薄い、非常に薄いチューブとして表示されます。<ol>
<li>鉗子を火炎滅菌するし、全体の腸管の長さ (通常 12-15 mm) を削除するそれらを使用します。ガラスビーズ (手順 1.4.1–1.4.2 を参照) および PBS または氷の上のポンド x 1 の 1 mL を含む均質化管に腸管を配置します。</li>
		</ol>
</li>
	</ol></li>
	<li>均質化
	<ol>
<li>均質化管の事前準備 1 mm ガラスビーズの注ぐ ~1.5 g で 2 mL にスクリュー キャップ チューブ (それらの約半分の方法を記入) し、オートクレーブに入れることによってそれらを殺菌しなさい。</li>
		<li>1 mL 滅菌ポンドまたは 1x PBS を追加します。</li>
		<li>ゼブラフィッシュ腸にされている追加 (手順を 1.3.3.1 詳細ページ)、チューブ、スクリュー キャップ、非常にしっかりと、渦ホモジナイザーでチューブを固定します。</li>
		<li>最大の設定で 1 分のサンプルを均質化し、クールで 1-2 分間氷の上にサイクルを繰り返すこの均質化もう一度完全な均質化のため。 注意: 均質化のためのいくつかの代替方法も稼働します。</li>
	</ol></li>
	<li>腸の植民地化のレベルを定量化
	<ol>
<li>磨砕液の連続希釈の管 (小さなガラス試験管や 1.5 mL 容マイクロ チューブ) を準備するには、各管に LB または 1x PBS の 900 μ L を追加します。それぞれの魚の 5-6 管を準備し、最初の管の磨砕液 100 μ L を追加することによって腸の磨砕液の 10 倍のシリアル希薄を作るボルテックス ミックス、および最初のチューブから 2 番目の管に 100 μ L を追加します。</li>
		<li>この手順を繰り返してすべての希釈液が用意されています。</li>
		<li>各希釈ストレプトマイシン (ストレプトマイシン耐性菌の場合) の 100 μ g/mL と X-gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) の 40 μ G/ml を含む LB 寒天培地プレート上の 100-200 μ L をプレートします。16-18 h 30 ° C でプレートを孵化させなさい。</li>
		<li>一晩インキュベートした後カウント; 植民地のカウントを手動でまたは自動コロニー カウンターを使用して、プレートのコロニーのコレラマーカー先端で数えられたコロニーをマークすることをお勧めします。</li>
		<li>メッキ量を考慮して、懸濁液の希釈倍率のプレート数を乗じて魚腸あたり CFU を決定します。</li>
	</ol></li>
</ol>2. 魚下痢の測定
注: 4 つの異なる評価指標を用いて魚下痢を評価する: 水、水、水13で、水と、コレラCFU の OD600の全体的な排泄タンパク質レベルで粘液のレベル。下痢は通常視覚的に明白になるコレラ前述のように、ゼブラフィッシュの暴露後約 6 時間。
<ol><li>
粘液のレベルを決定します。 注: 粘液分泌のコレラ植民地時代は誘導され、感染13の特に早い段階での排泄レベルの良い指標です。ムチン アッセイ マイクロタイター過ヨウ素酸シッフ アッセイ19のバリエーションであります。<ol>
<li>以下の資料を準備: 50% (w/v) 周期酸原液と 0.1% 水溶液作業の周期 (7% 酢酸 5 mL に添加 50% 過ヨウ素酸株式の 10 μ L-後すぐに使用)、ムチン基準、96 ウェル マイクロ プレート、シフ試薬です。<ol>
<li>ナトリウム酢酸緩衝液 (100 mM ナトリウム 5.5 氷酢酸と酢酸、5 ミリメートルの EDTA、pH) に次 (ブタの胃型 III) から粘液量を中断することにより粘液の基準を準備: 400 μ g/mL、300 μ g/mL、200 μ g/mL、150 μ g/mL、100 μ g/mL、75 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL、10 μ g/mL。 板を準備するには、次のように試金で使用される各ウェルに水感染の 100 μ L を追加することによって: 空白の 1x PBS。前述のように、ムチン基準や魚の感染症からの水のサンプル。3 通の各サンプルを行います。</li>
		</ol>
</li>
		<li>上下に数回ピペッティングで混ぜるし、それぞれよくマルチ チャンネル ピペットに新鮮な 0.1% 周期酸の 50 μ L を追加します。</li>
		<li>プレートをしっかりとラップで包み、1-1.5 h の 37 ° C でそれを孵化させなさい。</li>
		<li>各井戸と上下にそれをミックスするピペットにフクシン溶液 (シフの試薬) の 5-10 分を追加 100 μ L の室温までプレートを冷やします。</li>
		<li>プレートをラップで包み、インキュベートそれロッキング プラットフォームで室温まで色を開発してきました。色は 560 で吸光度を読み 20 分以内一般に開発される nm プレート リーダーを使用しています。</li>
		<li>ムチン標準曲線 (外径560対μ G/ml ムチン標準) をプロットします。各未知の外径560が標準曲線に該当の識別とその値に対応するムチン濃度未知のムチン レベルが決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
タンパク質レベルを決定します。 注: 別にムチン、タンパク質レベルで水の全体的な魚によって生成される下痢 (曇り、液体便) のレベルの別のプロキシです。この手順では、標準のブラッドフォードの試金を使用して蛋白質のレベルを推定します。タンパク質レベルは、ウシ血清アルブミン (BSA) の標準曲線に基づいて推定されます。<ol>
<li>ミックス (下のメモを参照) BSA の標準の 1 つの 100 μ L または 100 μ L 水感染症 (感染した魚を含んでいるビーカーから水) のブラッドフォードの 900 μ L で使い捨てのキュベットの試金の試薬 (ピアス蛋白質の試金の試薬はこのためにうまく動作します)。すべてのサンプルを 2 分間室温で孵化させなさい。 注: 次の BSA の標準は使用された: 1,800 μ g/mL、1,000 μ g/mL、750 μ g/mL、500 μ g/mL、250 μ g/mL、125 μ g/mL、50 μ g/mL、25 μ g/mL。BSA の標準は、オートクレーブの蒸留水で希釈されました。</li>
		<li>各標準の OD660を読んだり、サンプルの分光光度計を使用してください。</li>
		<li>BSA の標準曲線 (660対OD μ g/mL) をプロットします。各未知の OD660が BSA の標準曲線に落ちるし、その値に対応するムチン濃度を読んで識別することによって未知の蛋白質のレベルを決定します。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
メジャーの OD600 注: いくつか h と OD600の簡易定量法は、これを定量化する使用ことができます後、下痢 (曇り、液体便) の存在は目に見えて明らか。<ol>
<li>内容を均等に数回感染水を含むチューブを反転します。使い捨てのキュベットに水サンプルの 1 ミリリットルを追加します。陰性対照として滅菌感染水 1 mL を使用します。</li>
		<li>600 で分光光度計を使用して「空白」の測定を行い陰性対照サンプルを使用して nm。600 nm でのレコードごとの水のサンプルを読んで結果。</li>
	</ol>
</li>
	<li>
定量感染後のコレラCFU/mL の排泄 注: ゼブラフィッシュによって生成される下痢の主要成分は排泄のコレラ。CFU/mL の定量は、伝送実験の伝染性の線量の測定と魚の腸管内細菌の複製の推定などの目的で使用できます。このメジャーは最高、一過性感染が行われたときに行われます。感染症は 24 h を使用すると、この試金は複合菌に加えて、排泄のコレラ測ります。<ol>
<li>目的の時点で水サンプルを取るし、連続希釈して前述のよう。</li>
		<li>選択培地 (DCL または別の適切な抗生物質ストレプトマイシンを含む LB 寒天培地) のシリアル希薄をプレートし、30 ° C 24 時間でそれらを孵化させなさい。</li>
		<li>コロニーをカウントします。手順 1.5 mL の水当たり CFU を計算します。</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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著者が明らかに何もありません。

ゼブラフィッシュのコレラ研究の比較的新しいモデルですが、将来コレラ生物学および病因11,12,13の未知の側面の発見を多くの約束を保持しています。.アダルト ゼブラフィッシュ モデルに両方自然であることの利点は、そのままに、成熟した腸内細菌叢と環境モデルを含むホストのコレラ。モデルの?...

コレラは、散発的な下痢1,2と同様、人間の病気のコレラを引き起こす水生、グラム陰性細菌です。コレラは、しばしば他の水生生物に関連付けられている、世界中の多くの地域で環境にあります。プランクトン、昆虫の卵塊、貝、および脊椎動物の魚の種3,4,5,6、7これらの関連付けられた生物が含まれます。いくつかの研究はコレラの異なる地理的領域7,8,9,10魚の腸管から分離しています。魚のコレラの存在は、魚環境の貯水池として機能するかもしれないことを示します。魚は人間に病気を送信およびコレラ菌6の地理的な広がりにも関与する可能性が。
理解どのように魚と対話するコレラ、動脈分布としてよりもっとよく知られているゼブラフィッシュはコレラ対e11を研究するためのモデル システムとして開発されました。ゼブラフィッシュ、コレラの初期貯留層と考えられているベンガル湾の地域を含む南アジアにネイティブです。1817 年に最初コレラ大流行開始、する前にコレラはインドとバングラデシュは今外報告されていなかった。したがって、ゼブラフィッシュとコレラほぼ確実に関連付けられてお互い進化的時間スケールでそのゼブラフィッシュが自然環境12内のコレラのホストを示唆しています。
コレラのゼブラフィッシュ モデルが実行するシンプルで全体の病原性を研究するためのコレラのライフ サイクル。魚は、コレラの知られている数に接種されている水で入浴でコレラにさらされています。数時間以内腸の植民地化は下痢の生産に続いて、起こる。下痢は、粘液、蛋白質、排泄の細菌や他の腸の内容で構成されています。下痢の程度は、いくつかの簡単な測定13を用いて定量化することができます。コレラ感染魚が排泄されていることができますを行く素朴な魚に感染する感染のサイクルを完了します。したがって、ゼブラフィッシュ モデルはコレラ人間の病気プロセス12,14を繰り返します。
コレラ最も頻繁に使用される動物モデル マウスおよびウサギ14,15,16,17,18されてきました。これらのモデルは、コレラ発症の私達の知識に追加するのに尽力されています。ただし、自然のコレラはマウスおよびウサギのためのホストのコレラのライフ サイクルのどのような側面を学ぶことができますに制限があります。マウスおよびウサギのコレラ菌は通常、腸内細菌叢、腸内細菌叢を損傷するために抗生物質を用いる前処理の不在を必要とします。両方のモデルでは、消化管に細菌を導入する強制経口投与または直接腸に細菌を注入する手術操作のいずれかを必要があります。ゼブラフィッシュそのまま腸内細菌叢と成魚はすぐに植民地化および伝染のプロセスは、必要な操作をすることがなく、自然に起こりますという点で利点があります。
現在の仕事は、コレラ感染のモデルとしてのゼブラフィッシュの使用率を示しています。感染症、解離、植民地化のコレラの列挙およびコレラによる下痢の定量化説明12,13になります。このモデルは、コレラ病プロセスとコレラ環境生活の両方に興味がある科学者に有用である可能性が高いです。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Instrument&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Shaker incubator</td><td>New Brunswick Scientific, Edison, NJ</td><td>Excella E25</td><td></td></tr><tr><td>Incubator</td><td>NUAIRE, Plymouth, MN</td><td>Auto Flow</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>Geaesys 6</td><td></td></tr><tr><td>Vortex homogenizer</td><td>Minibeadbeater24</td><td>112011</td><td></td></tr><tr><td>Weighing Machine</td><td>Ohaus, Columbia, MD</td><td>Adventurer Pro</td><td></td></tr><tr><td>Heat Stirer</td><td>Corning, Corning, NY</td><td>PC-420D</td><td></td></tr><tr><td>Burner</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>automated colony counter</td><td>REVSCI</td><td>120417B</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Materials&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>400 ml glass beakers</td><td>Pyrex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>perforated lids</td><td>Microtip holder with holes from tip box</td><td></td><td></td></tr><tr><td>disposable plastic spoons</td><td>Office Depot, Boca Raton, FL</td><td>D15-25-7008</td><td></td></tr><tr><td>Fish Tank System</td><td>Aquaneering, San Diego, CA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>RO Water Purifier</td><td>Aqua FX</td><td>TK001</td><td></td></tr><tr><td>Fish net</td><td>Marina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fish food</td><td>Tetra fin</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Brine Shrimp</td><td>Red jungle brand</td><td>O.S.I. pro 80</td><td></td></tr><tr><td>Styrofoam board</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pins</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scalpels</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>10000-10</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>11223-20</td><td></td></tr><tr><td>Vannas scissors</td><td>Fine Scientific tools, Foster City, CA</td><td>15000-11</td><td></td></tr><tr><td>2 ml screw cap tubes</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>02-681-375</td><td></td></tr><tr><td>1 mm glass beads</td><td>Bio Spec</td><td>11079110</td><td></td></tr><tr><td>Glass beads for spreading</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>18406-500G</td><td></td></tr><tr><td>Petri plate</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml centrifuge tube</td><td>Midsci, Valley Park, MO</td><td>AVSS1700</td><td></td></tr><tr><td>50 ml centrifuge tube</td><td>Corning Falcon, Corning, NY</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>Test tubes</td><td>Pyrex</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>Glass Pipette</td><td>Fisher Brand, Hampton, NH</td><td>13675K</td><td></td></tr><tr><td>Micro pipettes</td><td>Sartorius Biohit, G&amp;ouml;ttingen, Germany</td><td>m1000/m200/m20</td><td></td></tr><tr><td>Tips</td><td>Genesee Scientific, San Diego, CA</td><td>24-150RS/24-412</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Instant Ocean salts</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>phosphate buffered saline</td><td>VWR Life Science, Radnor, PA</td><td>K813-500ml</td><td></td></tr><tr><td>Tricaine (ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>A5040</td><td></td></tr><tr><td>5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-&amp;beta;-D-galactopyranoside</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>10651745001</td><td></td></tr><tr><td>Schiff&amp;rsquo;s reagent</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>84655-250 mL</td><td></td></tr><tr><td>periodic acid</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>10450-60-9</td><td></td></tr><tr><td>Mucin from porcine stomach</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>M2378-100G</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>9046-46-8</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 660nm Protein Assay Reagent</td><td>Thermo, Waltham, MA</td><td>22660</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypton</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Teast Extract</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NACL</td><td>Fisher Scientific, Hampton, NH</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>TCBS Agar</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>265020</td><td></td></tr><tr><td>DCLS Agar</td><td>Sigma, St. Louis, MO</td><td>70135-500gm</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsoft office</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Prism 5</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

quantifying vibrio cholerae colonization and diarrhea in the adult zebrafish model

コレラは、コレラの人間の病気を引き起こす病原菌として有名です。人間のホストの外のコレラ主に存在する様々 な高い水生種のやり取り、水生環境で。脊椎動物の魚環境のホスト知られているで、本質的に潜在的なコレラの貯水池です。コレラゼブラフィッシュ、通称魚類種動脈分布、水生環境で長期にわたる相互作用を示唆しているインドの亜大陸から起きる。ゼブラフィッシュは、感染症を含む生物学の多くの側面を研究するための理想的なモデル生物です。ゼブラフィッシュことができます簡単かつ迅速に植民地化されるコレラによって水の暴露後。コレラによって腸の植民地化は、下痢の生産とレプリケートされたコレラの排泄に します。これらの細菌が排泄し、新たに魚のホストを植民地化するに行きます。ここでは、コレラを評価する方法を示します-ゼブラフィッシュとコレラを定量化する方法で腸の植民地化-ゼブラフィッシュ下痢を誘発します。植民地化モデルは興味の遺伝子が環境の生存および/またはホストの植民地化の重要な可能性があるかどうかを研究している研究者に役立つはずです。ゼブラフィッシュ下痢の定量化は、モデルとしてのゼブラフィッシュを探究することに興味を持っているすべての腸内の病原体を勉強して研究者に役立つはずです。

ゼブラフィッシュ腸管のコレラ菌
遵守する典型的な植民地化のレベルの例を提供するために 5 × 106エル Torのコレラパンデミック N16961 いくつかのゼブラフィッシュを含むビーカーの水の 200 ml の CFU を接種しました。感染症の 6 h 後魚は新鮮な水で洗浄されプロトコルで説明されているようにオートクレ...

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Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

ゼブラフィッシュが自然なコレラをホストし、要約し、トランス ミッションに植民地から全体の感染サイクルを研究する使用ことができます。ここでは、植民地化レベルのコレラを評価し、下痢ゼブラフィッシュを定量化する方法を示します。

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

quantifying-vibrio-cholerae-colonization-diarrhea-adult-zebrafish

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

8.3K ビュー.  Wayne State University School of Medicine. ゼブラフィッシュが自然なコレラをホストし、要約し、トランス ミッションに植民地から全体の感染サイクルを研究する使用ことができます。ここでは、植民地化レベルのコレラを評価し、下痢ゼブラフィッシュを定量化する方法を示します。

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Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote its motility and dissemination. New work has shown that proteins involved in actin-based motility are also linked to autophagy, an intracellular degradation process crucial for cell autonomous immunity. Strikingly, host cells may prevent actin-based motility of S. flexneri by compartmentalizing bacteria inside &#8216;septin cages&#8217; and targeting them to autophagy. These observations indicate that a more complete understanding of septins, a family of filamentous GTP-binding proteins, will provide new insights into the process of autophagy. This report describes protocols to monitor autophagy-cytoskeleton interactions caused by S. flexneri in vitro using tissue culture cells and in vivo using zebrafish larvae. These protocols enable investigation of intracellular mechanisms that control bacterial dissemination at the molecular, cellular, and whole organism level.

Use of Shigella flexneri to Study Autophagy-Cytoskeleton Interactions

To counteract pathogen dissemination, host cells reorganize their cytoskeleton to compartmentalize bacteria and induce autophagy. Using Shigella infection of tissue culture cells, host and pathogen determinants underlying this process are identified and characterized. Using zebrafish models of Shigella infection, the role of discovered molecules and mechanisms are investigated in vivo.

使用<em&gt;フレクスナー赤痢菌</em&gt;オートファジー細胞骨格の相互作用を研究するために

Shigella flexneri is an intracellular pathogen that can escape from phagosomes to reach the cytosol, and polymerize the host actin cytoskeleton to promote ...

免疫・感染学

Modeling Mucosal Candidiasis in Larval Zebrafish by Swimbladder Injection

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their intercommunication, are paramount for the protection against infections. The interactions of epithelial and innate immune cells with a pathogen are best investigated in vivo, where complex behavior unfolds over time and space. However, existing models do not allow for easy spatio-temporal imaging of the battle with pathogens at the mucosal level.
The model developed here creates a mucosal infection by direct injection of the fungal pathogen, Candida albicans, into the swimbladder of juvenile zebrafish. The resulting infection enables high-resolution imaging of epithelial and innate immune cell behavior throughout the development of mucosal disease. The versatility of this method allows for interrogation of the host to probe the detailed sequence of immune events leading to phagocyte recruitment and to examine the roles of particular cell types and molecular pathways in protection. In addition, the behavior of the pathogen as a function of immune attack can be imaged simultaneously by using fluorescent protein-expressing C. albicans. Increased spatial resolution of the host-pathogen interaction is also possible using the described rapid swimbladder dissection technique.
The mucosal infection model described here is straightforward and highly reproducible, making it a valuable tool for the study of mucosal candidiasis. This system may also be broadly translatable to other mucosal pathogens such as mycobacterial, bacterial or viral microbes that normally infect through epithelial surfaces.

In vivo spatio-temporal interactions of pathogen and immune defenses at the mucosal level are not easily imaged in existing vertebrate hosts. The method presented here describes a versatile platform to study mucosal candidiasis in live vertebrates using the swimbladder of the juvenile zebrafish as an infection site.

浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

Early defense against mucosal pathogens consists of both an epithelial barrier and innate immune cells. The immunocompetency of both, and their ...

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen interactions.&#160;The ease of obtaining large numbers of embryos, their accessibility due to external development, their optical transparency as well as the availability of a wide panoply of genetic/immunological tools and transgenic reporter line collections, contribute to the versatility of this model.&#160;In this respect, the present manuscript describes the use of zebrafish as an&#160;in vivo&#160;model system to investigate the chronology of Mycobacterium abscessus infection. This human pathogen can exist either as smooth (S) or rough (R) variants, depending on cell wall composition, and their respective virulence can be imaged and compared in zebrafish embryos and larvae. Micro-injection of either S or R fluorescent variants directly in the blood circulation via the caudal vein, leads to chronic or acute/lethal infections, respectively. This biological system allows high resolution visualization and analysis of the role of mycobacterial cording in promoting abscess formation. In addition, the use of fluorescent bacteria along with transgenic zebrafish lines harbouring fluorescent macrophages produces a unique opportunity for multi-color imaging of the host-pathogen interactions. This article describes detailed protocols for the preparation of homogenous M. abscessus inoculum and for intravenous injection of zebrafish embryos for subsequent fluorescence imaging of the interaction with macrophages. These techniques open the avenue to future investigations involving mutants defective in cord formation and are dedicated to understand how this impacts on M. abscessus pathogenicity in a whole vertebrate.

Deciphering and Imaging Pathogenesis and Cording of Mycobacterium abscessus in Zebrafish Embryos

Optically transparent zebrafish embryos are widely used to study and visualize in real time the interactions between pathogenic microorganisms and the innate immune cells. Micro-injection of Mycobacterium abscessus, combined with fluorescence imaging, is used to scrutinize essential pathogenic features such as cord formation in zebrafish embryos.

イメージング病因とのコーディングを解読し、<em&gt;マイコバクテリウム膿瘍</em&gt;ゼブラフィッシュ胚で

Zebrafish (Danio rerio) embryos are increasingly used as an infection model to study the function of the vertebrate innate immune system in host-pathogen ...

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United States. The innate immune response against C. difficile has been described, but the exact roles of neutrophils and macrophages in CDI are less understood. In the current study, Danio rerio (zebrafish) larvae are used to establish a C. difficile infection model for imaging the behavior and cooperation of these innate immune cells in vivo. To monitor C. difficile, a labeling protocol using a fluorescent dye has been established. A localized infection is achieved by microinjecting labeled C. difficile, which actively grows in the zebrafish intestinal tract and mimics the intestinal epithelial damage in CDI. However, this direct infection protocol is invasive and causes microscopic wounds, which can affect experimental results. Hence, a more noninvasive microgavage protocol is described here. The method involves delivery of C. difficile cells directly into the intestine of zebrafish larvae by intubation through the open mouth. This infection method closely mimics the natural infection route of C. difficile.

Development of a Larval Zebrafish Infection Model for Clostridioides difficile

Presented here is a safe and effective method to infect zebrafish larvae with fluorescently labeled anaerobic C. difficile by microinjection and noninvasive microgavage.

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

Clostridioides difficile infection (CDI) is considered to be one of the most common healthcare-associated gastrointestinal infections in the United ...

発生生物学

Using Zebrafish Models of Human Influenza A Virus Infections to Screen Antiviral Drugs and Characterize Host Immune Cell Responses

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare burden. The principle strategy to curtail infections is yearly vaccination. In individuals who have contracted influenza, antiviral drugs can mitigate symptoms. There is a clear and unmet need to develop alternative strategies to combat influenza. Several animal models have been created to model host-influenza interactions. Here, protocols for generating zebrafish models for systemic and localized human influenza A virus (IAV) infection are described. Using a systemic IAV infection model, small molecules with potential antiviral activity can be screened. As a proof-of-principle, a protocol that demonstrates the efficacy of the antiviral drug Zanamivir in IAV-infected zebrafish is described. It shows how disease phenotypes can be quantified to score the relative efficacy of potential antivirals in IAV-infected zebrafish. In recent years, there has been increased appreciation for the critical role neutrophils play in the human host response to influenza infection. The zebrafish has proven to be an indispensable model for the study of neutrophil biology, with direct impacts on human medicine. A protocol to generate a localized IAV infection in the Tg(mpx:mCherry) zebrafish line to study neutrophil biology in the context of a localized viral infection is described. Neutrophil recruitment to localized infection sites provides an additional quantifiable phenotype for assessing experimental manipulations that may have therapeutic applications. Both zebrafish protocols described faithfully recapitulate aspects of human IAV infection. The zebrafish model possesses numerous inherent advantages, including high fecundity, optical clarity, amenability to drug screening, and availability of transgenic lines, including those in which immune cells such as neutrophils are labeled with fluorescent proteins. The protocols detailed here exploit these advantages and have the potential to reveal critical insights into host-IAV interactions that may ultimately translate into the clinic.

Systemic and localized zebrafish infection models for human influenza A virus are demonstrated. Using a systemic infection model, zebrafish can be used to screen antiviral drugs. Using a localized infection model, zebrafish can be used to characterize host immune cell responses.

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

Each year, seasonal influenza outbreaks profoundly affect societies worldwide. In spite of global efforts, influenza remains an intractable healthcare ...

GF ゼブラフィッシュモデルの最適化:生成、維持管理、および微生物研究

Generation, Maintenance, and Identification of Germ-Free Zebrafish Models from Larvae to Juvenile Stages

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent embryos developed in a relatively clean chorion environment, and extremely rapid development of larvae compared to rodent models. Germ-free (GF) zebrafish (Danio rerio) are crucial for evaluating pollutant toxicity and establishing human-like disease models related to microbial functions. In comparison to conventionally raised (CR) models (fish in common husbandry), GF zebrafish allow for more accurate manipulation of the host microbiota, aiding in determining the causal relationship between microorganisms and hosts. Consequently, they play a critical role in advancing our understanding of these relationships. However, GF zebrafish models are typically generated and researched during the early life stages (from embryos to larvae) due to limitations in immune function and nutrient absorption. This study optimizes the generation, maintenance, and identification of early GF zebrafish models without feeding and with long-term feeding using GF food (such as Artemia sp., brine shrimp). Throughout the process, daily sampling and culture were performed and identified through multiple detections, including plates and 16S rRNA sequencing. The aseptic rate, survival, and developmental indexes of GF zebrafish were recorded to ensure the quality and quantity of the generated models. Importantly, this study provides details on bacterial isolation and infection techniques for GF fish, enabling the efficient creation of GF fish models from larvae to juvenile stages with GF food support. By applying these procedures in biomedical research, scientists can better understand the relationships between intestinal bacterial functions and host health.

著者スポットライト:微生物叢と宿主の関係研究のための無菌ゼブラフィッシュの確立

This protocol outlines the primary steps for obtaining germ-free (GF) fish embryos and maintaining them from larvae until the juvenile stage, including sampling and detecting their sterile status. The use of GF models with infection is important for understanding the role of microbes in host health.

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

Zebrafish serve as valuable models for research on growth, immunity, and gut microbiota due to their genomic similarities with mammals, transparent ...

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this bacterium causes a wide disease spectrum in humans ranging from a sterilized infection to an actively progressing deadly disease. The most common form is the latent tuberculosis, which is asymptomatic, but has the potential to reactivate into a fulminant disease. Adult zebrafish and its natural pathogen Mycobacterium marinum have recently proven to be an applicable model to study the wide disease spectrum of tuberculosis. Importantly, spontaneous latency and reactivation as well as adaptive immune responses in the context of mycobacterial infection can be studied in this model. In this article, we describe methods for the experimental infection of adult zebrafish, the collection of internal organs for the extraction of nucleic acids for the measurement of mycobacterial loads and host immune responses by quantitative PCR. The in-house-developed, M. marinum-specific qPCR assay is more sensitive than the traditional plating methods as it also detects DNA from non-dividing, dormant or recently dead mycobacteria. As both DNA and RNA are extracted from the same individual, it is possible to study the relationships between the diseased state, and the host and pathogen gene-expression. The adult zebrafish model for tuberculosis thus presents itself as a highly applicable, non-mammalian in vivo system to study host-pathogen interactions.

Modeling Tuberculosis in Mycobacterium marinum Infected Adult Zebrafish

Here, we present a protocol to model human tuberculosis in an adult zebrafish using its natural pathogen Mycobacterium marinum. Extracted DNA and RNA from the internal organs of infected zebrafish can be used to reveal the total mycobacterial loads in the fish and the host&#39;s immune responses with qPCR.

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

Mycobacterium tuberculosis is currently the deadliest human pathogen causing 1.7 million deaths and 10.4 million infections every year. Exposure to this ...

Oral Intubation of Adult Zebrafish: A Model for Evaluating Intestinal Uptake of Bioactive Compounds

Most pathogens invade organisms through their mucosa. This is particularly true in fish as they are continuously exposed to a microbial-rich water environment. Developing effective methods for oral delivery of immunostimulants or vaccines, which activate the immune system against infectious diseases, is highly desirable. In devising prophylactic tools, good experimental models are needed to test their performance. Here, we show a method for oral intubation of adult zebrafish and a set of procedures to dissect and prepare the intestine for cytometry, confocal microscopy and quantitative polymerase chain reaction (qPCR) analysis. With this protocol, we can precisely administer volumes up to 50 &#181;L to fish weighing approximately 1 g simply and quickly, without harming the animals. This method allows us to explore the direct in vivo uptake of fluorescently labelled compounds by the intestinal mucosa and the immunomodulatory capacity of such biologics at the local site after intubation. By combining downstream methods such as flow cytometry, histology, qPCR and confocal microscopy of the intestinal tissue, we can understand how immunostimulants or vaccines are able to cross the intestinal mucosal barriers, pass through the lamina propria, and reach the muscle, exerting an effect on the intestinal mucosal immune system. The model could be used to test candidate oral prophylactics and delivery systems or the local effect of any orally administered bioactive compound.

The protocol describes intubating adult zebrafish with a biologic; then dissecting and preparing the intestine for cytometry, confocal microscopy and qPCR. This method allows administration of bioactive compounds to monitor intestinal uptake and the local immune stimulus evoked. It&#160;is relevant for testing the intestinal dynamics of oral prophylactics.

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュモデルで下痢を定量化

要約

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浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

イメージング病因とのコーディングを解読し、

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

大人のゼブラフィッシュの経口挿管: 生理活性化合物の腸管吸収の評価モデル

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュ モデルで下痢を定量化

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浮袋注入による幼虫ゼブラフィッシュにおける粘膜カンジダ症のモデル化

イメージング病因とのコーディングを解読し、

クロストリジオイド・ディフィシルの幼虫ゼブラフィッシュ感染モデルの開発

抗ウイルス薬をスクリーニングし、宿主の免疫細胞応答を特徴づけるために、ヒトインフルエンザAウイルス感染のゼブラフィッシュモデルを使用して、

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

幼生期から幼魚期までの無菌ゼブラフィッシュモデルの生成、維持、同定

結核抗酸菌 marinum感染成人ゼブラフィッシュをモデル化

大人のゼブラフィッシュの経口挿管: 生理活性化合物の腸管吸収の評価モデル

コレラの植民地化と大人のゼブラフィッシュモデルで下痢を定量化