Forschung unterstützt von New Hampshire-INBRE durch einen Institutional Development Award (IDeA), P20GM103506, vom Nationalen Institut für Allgemeine Medizinische Wissenschaften des NIH.

Hinweis: Zeitliche Betrachtungen für jeden Assay müssen gemacht werden, da einzelne Medienvorbereitungen unterschiedliche Zeiten erfordern. Zum Beispiel sollten feste Agarplattenmedien ausreichend kühlen und trocknen lassen (1-2 Tage). Zusätzliche Zeitüberlegungen ( dh Einzelkolonie und Übernachtkulturwachstum) werden unter jedem Protokoll spezifiziert und sind in Tabelle 2 zu finden . 1. Vorbereitung der Medien <ol><li> 1x Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) <ol><li> Wiegen 4,0 g NaCl, 0,1 g KCl, 0,72 g Na 2 HPO 4 und 0,12 g KH 2 PO 4 . Die Bestandteile werden in einem 1 l Erlenmeyerkolben vermischt, mit deionisiertem Wasser auf 500 ml eingestellt, mit einem pH-Meter den pH-Wert auf 7,2 eingestellt und HCl tropfenweise zu der Lösung gegeben und mit einem 0,22 μm-Filter autoklaviert oder filtriert. 1x PBS kann bei Raumtemperatur auf unbestimmte Zeit gelagert werden. ACHTUNG: HCl ist eine konzentrierte Säure und sollte entsprechend behandelt werdenZu institutionellen, lokalen, staatlichen und bundesstaatlichen Vorschriften. Für entsprechende Handhabungsrichtlinien beachten Sie bitte das Sicherheitsdatenblatt des Herstellers. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Brühe <ol><li> Wiegen 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl. Kombinieren Sie die Bestandteile in einer 1 l Flasche, stellen Sie das Volumen auf 500 ml mit entionisiertem Wasser, Autoklav und speichern Sie bei Raumtemperatur für bis zu 6 Monate. Für klassische Biotyp-Virulenz-induzierende Bedingungen, pH-Wert auf 6,5 mit HCl vor dem Autoklavieren einstellen. </li></ol></li><li> AKI Medium mit 0,03% (w / v) NaHCO 3 <ol><li> Für Komponente 1 (AKI-Medium): 7,5 g Pepton, 2,0 g Hefeextrakt und 2,5 g NaCl wiegen. Kombinieren Sie die Bestandteile in einer 1 l Flasche, stellen Sie das Volumen auf 450 ml mit deionisiertem Wasser und Autoklav ein. AKI-Medium kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Für Komponente 2 (NaHCO 3 ): 1,5 g NaHCO 3 wiegen und Volumen einstellenBis 50 ml mit deionisiertem Wasser in einem sterilen Vesikel. Filter sterilisieren NaHCO 3 mit einem 0,22 μm Filter. NaHCO 3 muss unmittelbar vor Gebrauch hergestellt werden. </li><li> Aseptisch kombinieren die beiden Komponenten ein 1:10 Verhältnis durch Filtern von Komponente 2 in Komponente 1 vor der Verwendung. </li></ol></li><li> Luria-Bertani (LB) Agar Platten <ol><li> 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 7,5 g Agar abwiegen. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml mit deionisiertem Wasser, Autoklaven einstellen und in Standard-100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vorbereiten. Überzogene Medien können bis zu 6 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> LB-Agarplatten ergänzt mit Polymyxin B <ol><li> Für Komponente 1 (LB-Agar): 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 7,5 g Agar. Kombinieren Sie die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben, stellen Sie das Volumen auf 500 ml wi einTh deionisiertes Wasser und Autoklav. </li><li> Für Komponente 2 (Polymyxin B): Polymyxin B in deionisiertem Wasser in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen auf eine Konzentration von 50.000 IE / μl auflösen und mit einem 0,22 μm Filter filtrieren. </li><li> Sobald die Komponente 1 zu der Berührung kalt ist, aber noch nicht verfestigt ist, fügen Sie 500 μl der Komponente 2 zu der Komponente 1 aseptisch hinzu, wodurch eine Endkonzentration von 50 IE / μL entsteht und sorgfältig vermischt wird. Bereiten Sie in standardisierten 100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. Überzogene Medien können bis zu 3 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> Minimale Citrat-Mittel-Agar-Platten <ol><li> Für Komponente 1 (Agar mit Bromthymolblau): 7,5 g Agar und 0,02 g Bromthymolblau wiegen. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 450 ml mit deionisiertem Wasser einstellen und die Mischung autoklavieren. </li><li> Für Komponente 2 (10x VBMM): wiegen 10 g MgSO 4 7H 2 O, 10,0 g Zitronensäure H 2 O, 50,0 g wasserfreies K 2 HPO 4 und 17,5 g NaNH 4 HPO 4 4H 2 O. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml einstellen Mit entionisiertem Wasser und Autoklav oder Filter sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. 10x VBMM kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monaten gelagert werden. </li><li> Fügen Sie 50 ml Komponente 2 zu Komponente 1 hinzu und bereiten Sie in standardisierten 100 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. Überzogene Medien können bis zu 6 Monate in Plastik verpackt werden, Deckel-Seite bis 4 ° C. </li></ol></li><li> Milch-Agar-Platten <ol><li> Für Komponente 1 (Milch): 8,0 g sofortige fettfreie Trockenmilch in einem 1 l Erlenmeyerkolben wiegen, das Volumen auf 200 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Für Komponente 2 (Agar mit Hirn-Herz-Infusion): 3,68 g Hirn-Herz-Infusion und 6,0 ​​g Agar. Kombinieren Sie die conSubstituenten in einem 500 mL Erlenmeyerkolben, Volumen auf 200 ml mit deionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Kombinieren Sie die beiden Komponenten, indem Sie die Komponente 2 nach dem Autoklavieren in die Komponente 1 gießen und gründlich mischen. Vorbereiten in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen. Milchplatten können bis zu einer Woche in Plastik gepackt werden, Deckel-Seite nach unten bei 4 ° C. Bereiten Sie in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. </li></ol></li><li> Motility Agar Platten <ol><li> Für Komponente 1 (LB-Agar): 5,0 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 2,5 g NaCl und 2,0 g Agar. Die Bestandteile in einem 1 l Erlenmeyerkolben vereinigen, das Volumen auf 500 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklav einstellen. </li><li> Für Komponente 2 (1% (Gew./Vol.) Triphenyltetrazoliumchlorid, TTC): 0,25 g TTC. Einstellen des Volumens auf 25 ml mit deionisiertem Wasser in einem sterilen Vesikel und Filter sterilisieren mit einem 0,22 μm Filter. Lagerung bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur eingewickeltIn der Folie, um die Belichtung zu minimieren. </li><li> Füge 2,5 ml 1% (w / v) sterile TTC zu autoklavierten Medien hinzu. </li><li> Gießen Sie die Medien so dick wie möglich (≥ 50 ml / Platte) in große 150 mm x 15 mm sterile Petrischalen. Überzogene Medien können bis zu einer Woche in Plastik gepackt werden, Deckel-Seite nach oben bei 4 ° C. Bereiten Sie in 150 mm x 15 mm sterilen Petrischalen vor, indem Sie gemischte Agarmedien in die Petrischalen gießen. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) <ol><li> Für die Komponente 1 (Methyl-Rot-Voges-Proskauer-Brühe, MR-VP): 1,7 g MR-VP-Medium in einem 500 mL Erlenmeyerkolben abwiegen, das Volumen auf 100 ml mit entionisiertem Wasser und Autoklaven einstellen. Sterile MR-VP-Brühe kann bei Raumtemperatur bis zu 6 Monate gelagert werden. </li><li> Für Komponente 2 (5% (w / v) alpha (α) Naphthol): 1,0 g α-Naphthol in einer sterilen Vesikel abwiegen und das Volumen auf 20 ml mit 95% igem Ethanol einstellen. Α-Naphthol kann bei Raumtemperatur bis zu 1 Woche in Folie eingewickelt werden, um Licht exp zu minimierenOsure </li><li> Für Komponente 3 (40% (w / v) Kaliumhydroxid, KOH): 20,0 g KOH in einer sterilen Vesikel wiegen, das Volumen auf 50 ml mit sterilem deionisiertem Wasser einstellen. KOH kann bis zu 6 Monate bei Raumtemperatur in einem Kunststoffgefäß aufbewahrt werden. </li></ol></li></ol> 2. Instandhaltung und Wachstum von V. Cholerae- Stämme <ol><li> Vorbereitung und Verwendung von Tiefkühlkulturen <ol><li> Pellet 1,8 ml flüssige über Nacht Kultur für 2 min durch Zentrifugation (≥8,600 xg) in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen, entfernen Sie den Überstand und re-suspendieren Sie das Zellpellet in 900 &amp; mgr; l frische LB-Brühe durch Pipettieren. </li><li> Fügen Sie 900 μl steriles 60% (v / v) Glycerin der Kultur hinzu und mischen durch Vortexen. </li><li> Übertragen Sie die Mischung auf ein steriles 2 mL Kryo-Röhrchen und lagern Sie auf unbegrenzt bei -80 ° C. </li><li> Um zu verwenden, entfernen Sie eine kleine Menge von gefrorenen Bestand mit einer sterilen Impfschleife und Streifen für einzelne Kolonien auf LB agAr Platten. Sofort Rücklauf von gefrorenem Lager auf -80 ° C nach Gebrauch, um zu verhindern, dass Kulturen vollständig auftauen. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wachstum von Übernachtkulturen in flüssigem Medium <ol><li> Streifen für Einzelkolonien (nach Abschnitt 2.1.4) aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li><li> 4 ml flüssige LB-Brühe in einem sterilen 10-ml-Kulturrohr mit einer einzigen Kolonie inokulieren, indem man die Oberfläche der einzelnen Kolonie mit einem sterilen Applikatorstock berührt und die Kolonie in die flüssige Brühe überführt. </li><li> Inkubieren mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li></ol></li><li> Wachstumskurve <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Mischen Sie eine 1: 100-Verdünnung der Übernachtkultur durch Übertragen von 250 μl über Nacht Kultur auf 25 ml frische LB-Brühe in einem sterilen 250 mL Erlenmeyerkolben. </li><li> Messen Sie die optische Dichte der Flüssigkulturen bei 600 nm (OD 600 ) jede Stunde, die zum Zeitpunkt der Inokulation beginnt (T 0 ). </li><li> Inkubieren Sie eine 1: 100-Verdünnung der Übernachtkultur mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für bis zu 30 h bei 37 ° C oder bis die Kultur die maximale Dichte erreicht. </li><li> Zeichnen Sie die OD 600 vs. Time und verwenden Sie eine lineare Regression, um die ungefähre Verdopplungszeit für jeden Stamm zu bestimmen. </li></ol></li><li> El Tor Biotype Virulenz Inducing Bedingungen <ol><li> Streifen für einzelne Kolonien aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten, für 12 bis 16 Stunden bei 37 ° C. </li><li> Inokulieren Sie 10 ml AKI-Medium, das 0,03% (w / v) NaHCO 3 mit einer einzigen Kolonie enthält. </li><li> Inkubieren Sie die Kultur ohne Belüftung bei 37 ° C für 3,5 h. </li><li> 7 ml Kultur entfernen und die restlichen 3 ml Kultus inkubierenRe mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für weitere 4 h. </li></ol></li><li> Klassische Biotyp Virulenz Inducing Bedingungen <ol><li> Streifen für einzelne Kolonien aus gefrorenem Bestand auf LB-Agarplatten. Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite nach unten für 12 bis 16 h bei 37 ° C. </li><li> 4 ml flüssige LB-Brühe (pH 6,5) mit einer einzigen Kolonie inokulieren. </li><li> Inkubieren mit Belüftung in einem Shaker-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 h bei 30 ° C. </li></ol></li><li> Waschzelle Pellet in 1x PBS <ol><li> Pellet 1,8 ml über Nacht Kultur für 2 min durch Zentrifugation (≥8,600 xg) in einem sterilen 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen und entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette. Das Pellet in 1,8 ml 1x PBS durch Pipettieren erneut suspendieren. </li><li> Wiederholen Sie den Waschvorgang dreimal, gefolgt von einer abschließenden Resuspension in 1,8 ml 1x PBS. </li></ol></li></ol> 3. Charakterisierung von V. Cholerae Biotypen <ol><li> PCR-basierte Genetische Bildschirme mit ctxB und tcpA <ol><li> Entwerfen Sie einen Satz von Primern, die etwa 50-70 bp stromaufwärts und stromabwärts der Translationsstart- und Stoppstellen von ctxB bzw. tcpA anlagern. </li><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Isolieren Sie chromosomale DNA mit einem handelsüblichen Kit, der für Gram-negative Bakterien entwickelt wurde. Gereinigte chromosomale DNA kann unbegrenzt bei -20 ° C gelagert werden. Die chromosomale DNA-Isolierung unter Verwendung von im Handel erhältlichen Kits dauert im allgemeinen etwa 4 h. </li><li> Verwenden Sie ein Mikro-Volumen-Spektrophotometer, um sicherzustellen, dass die chromosomale DNA-Probe von hoher Qualität ist (A 260/280 &gt; 1,8). </li><li> Für jedes chromosomale DNA-Isolat wird die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) auf Eis in sterilen 200 &amp; mgr; l PCR-Röhrchen hergestellt und die Bereiche von ctxB und tcpA unter Verwendung von Standard-PCR-Komponenten amplifiziert: Taq- Polymerase und BuFfer (oder äquivalente), dNTP-Lösung und Vorwärts- / Rückwärts-Primer. Verwenden Sie Standard-PCR-Parameter (~ 3 Std.). Verwenden Sie zum Beispiel das folgende Protokoll: <ol><li> Anfängliche Denatur bei 95 ° C für 120 s. </li><li> Denaturierung bei 95 ° C für 60 s. </li><li> Anneal-Primer bei 60 ° C für 45 s. </li><li> Verlängere bei 72 ° C für 90 s. </li><li> Wiederholen Sie die Schritte 3.1.5.2 bis 3.1.5.4 für 34 Zyklen. </li><li> Endverlängerung 72 ° C für 600 s. </li><li> Unendlicher Halten bei 4 ° C. </li></ol></li><li> Färben Sie 5 &amp; mgr; l des jeweiligen PCR-Produkts unter Verwendung eines Standard-6 × DNA-Gel-Beladungsfarbstoffs und laden Sie etwa 10 &amp; mgr; l 1 kb-Leiter und 10 &amp; mgr; l PCR-Produkt auf ein 1% Agarosegel in 1x Tris-Borat-EDTA (TBE) Puffer. </li><li> Führen Sie die Gelelektrophorese bei 130 V aus, bis die Farbstofffront das Ende erreicht hat, aber nicht aus dem Gel (ca. 90 min). Eine ständige Überwachung wird empfohlen, da die Spannungs- und Laufzeiten je nach Ausstattung variieren können. </li><li> Bei der Überprüfung vonErfolgreiche PCR-Amplifikation bei der erwarteten Größe, reinigen die verbleibenden 45 μL PCR-Produkte mit einem handelsüblichen DNA Clean &amp; Concentrator Kit. </li><li> Sequenz gereinigtes PCR-Produkt (e) unter Verwendung der gleichen Primer, die für die PCR-Amplifikation verwendet werden, und die Vorbereitung pro lokalen Sequenzierungsrichtlinien-Richtlinien. </li><li> Vergleichen Sie das FASTA-Format von Gensequenzen von jedem Isolat zu der veröffentlichten Sequenz, die auf der NCBI-Website (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/) verfügbar ist, indem Sie die folgenden Zugangsnummern im Suchabfragefeld durchsuchen. </li><li> CtxB : (klassische) Region zwischen VC0395_A1059 bis VC0395_A1060 (El Tor) VC_1456 </li><li> TcpA : (klassisch) VC0395_A0353 (El Tor) VC_0828 </li></ol></li><li> Phänotypische Assays zur Biotyp-Klassifikation über Spotting <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur in flüssiger LB Brühe vor, wie oben in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet (s) gemäß Protokoll 2.6. </li><li> Verwenden Sie eine Pipette zuSpritzen 1 &amp; mgr; l gewaschene Kultur auf dem jeweiligen Medium. Für mittlere Auswahl- und Inkubationsangaben siehe Tabelle 2. </li></ol></li><li> Motilitätsassay <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur (en) in flüssiger LB-Brühe vor, wie zuvor in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Waschen Sie das Zellpellet (s) gemäß Protokoll 2.6. </li><li> Inokulieren Sie Motilitäts-Agarplatten, indem Sie Inokulationsstab in die gewaschene Flüssigkeitskultur einfügen und &quot;vertikal&quot; in das Medium &quot;stab&quot;. Zwischen jeder Inokulation sterilisieren Sie den Drahtstab mit einem Bunsenbrenner, und wenn Sie Agar stechen, stellen Sie sicher, dass sich der Impfstab nicht beugt, da dies die Ergebnisse verändern kann. </li><li> Inkubieren Sie die Platten Deckel-Seite für 14 bis 24 h bei 37 ° C. Nach 14 h, überwachen Motilitätsplatten eng zu verhindern Überwachsen von Kulturen. </li></ol></li><li> Voges-Proskauer (VP) Assay <ol><li> Bereiten Sie über Nacht Kultur (en) in flüssiger LB-Brühe vor, wie zuvor in Protokoll 2.2 angegeben. </li><li> Inokulieren 4Ml Methylrot Voges-Proskauer oder MR-VP-Brühe durch Pipettieren von 10 &amp; mgr; l der zuvor hergestellten Übernachtkultur in 4 ml MR-VP-Brühe in einem sterilen Kulturrohr und Inkubieren mit Belüftung in einem Schüttel-Inkubator bei 225 U / min für 12 bis 16 H bei 37 ° C. </li><li> Füge 150 μl 5% (w / v) α-Naphthol und 50 μl 40% (w / v) KOH zu 1 mL Aliquoten der MR-VP-Übernachtkultur in sterilen Kulturröhrchen hinzu. </li><li> Kurz vorwirbeln und bei Raumtemperatur bis zu 4 h stehen lassen, bis sich Farbwechsel entwickelt. </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Shimada, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extended+serotyping+scheme+for+Vibrio+cholerae.">Extended serotyping scheme for Vibrio cholerae.</a> Curr. Microbiol. 28 (3), 175-178 (1994).</li><li>Yamai, S., Tadayuki, O., Toshio, S., Yasuji, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distribution+of+serogroups+of+Vibrio+cholerae+non-O1+non-O139+with+specific+reference+to+their+ability+to+produce+cholera+toxin,+and+addition+of+novel+serogroups.">Distribution of serogroups of Vibrio cholerae non-O1 non-O139 with specific reference to their ability to produce cholera toxin, and addition of novel serogroups.</a> Jpn. J. Infect. Dis. 71 (10), 1037-1045 (1997).</li><li>Karaolis, D. K., Lan, R., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sixth+and+seventh+cholera+pandemics+are+due+to+independent+clones+separately+derived+from+environmental,+nontoxigenic,+non-O1+Vibrio+cholerae.">The sixth and seventh cholera pandemics are due to independent clones separately derived from environmental, nontoxigenic, non-O1 Vibrio cholerae.</a> J. Bacteriol. 177 (11), 3191-3198 (1995).</li><li>Albert, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Large+epidemic+of+cholera-like+disease+in+Bangladesh+caused+by+Vibrio+cholerae+O139+synonym+Bengal.">Large epidemic of cholera-like disease in Bangladesh caused by Vibrio cholerae O139 synonym Bengal.</a> Lancet. 342 (8868), 387 (1993).</li><li>Barua, D., Barua, D., Greenough III, W. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=History+of+Cholera.">History of Cholera.</a> Cholera. , 1-36 (1992).</li><li>Morales, R., Delgado, G., Cravioto, A., Faruque, S. M., Nair, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Population+Genetics+of+Vibrio+cholerae.">Population Genetics of Vibrio cholerae.</a> Vibrio cholerae-Genomics and Molecular Biology. , 29-47 (2008).</li><li>Samadi, A. R., Chowdhury, M. K., Huq, M. K., Khan, M. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Seasonality+of+classical+and+El+Tor+cholera+in+Dhaka,+Bangladesh:+17-year+trends.">Seasonality of classical and El Tor cholera in Dhaka, Bangladesh: 17-year trends.</a> Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 77 (6), 853-856 (1983).</li><li>Son, M. S., Megli, C. J., Kovacikova, G., Qadri, F., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Vibrio+cholerae+O1+El+Tor+biotype+variant+clinical+isolates+from+Bangladesh+and+Haiti,+including+a+molecular+genetic+analysis+of+virulence+genes.">Characterization of Vibrio cholerae O1 El Tor biotype variant clinical isolates from Bangladesh and Haiti, including a molecular genetic analysis of virulence genes.</a> J. Clin. Microbiol. 49 (11), 3739-3749 (2011).</li><li>Ghosh-Banerjee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+toxin+production+by+the+El+Tor+variant+of+Vibrio+cholerae+O1+compared+to+prototype+El+Tor+and+classical+biotypes.">Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor and classical biotypes.</a> J. Clin. Microbiol. 48 (11), 4283-4286 (2010).</li><li>Ansaruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholera+in+Mozambique,+variant+of+Vibrio+cholerae.">Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae.</a> Emerg. Infect. Dis. 10 (11), 2057-2059 (2004).</li><li>Ansaruzzaman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+diversity+of+El+Tor+strains+of+Vibrio+cholerae+O1+with+hybrid+traits+isolated+from+Bangladesh+and+Mozambique.">Genetic diversity of El Tor strains of Vibrio cholerae O1 with hybrid traits isolated from Bangladesh and Mozambique.</a> Int. J. Med. Microbiol. 297 (6), 443-449 (2007).</li><li>Lan, R., Reeves, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pandemic+spread+of+cholera:+genetic+diversity+and+relationships+within+the+seventh+pandemic+clone+of+Vibrio+cholerae+determined+by+amplified+fragment+length+polymorphism.">Pandemic spread of cholera: genetic diversity and relationships within the seventh pandemic clone of Vibrio cholerae determined by amplified fragment length polymorphism.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (1), 172-181 (2002).</li><li>Nair, G. B., Faruque, S. M., Bhuiyan, N. A., Kamruzzaman, M., Siddique, A. K., Sack, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+variants+of+Vibrio+cholerae+O1+biotype+El+Tor+with+attributes+of+the+classical+biotype+from+hospitalized+patients+with+acute+diarrhea+in+Bangladesh.">New variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh.</a> J. Clin. Microbiol. 40 (9), 3296-3299 (2002).</li><li>Nair, G. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Vibrio+cholerae+O1+strains+similar+to+pre-seventh+pandemic+El+Tor+strains+during+an+outbreak+of+gastrointestinal+disease+in+an+island+resort+in+Fiji.">Isolation of Vibrio cholerae O1 strains similar to pre-seventh pandemic El Tor strains during an outbreak of gastrointestinal disease in an island resort in Fiji.</a> J. Med. Microbiol. 55 (11), 1559-1562 (2006).</li><li>Nair, G. B., Mukhopadhyay, A. K., Safa, A., Takeda, Y., Faruque, S. M., Nair, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+hybrid+variants+of+Vibrio+cholerae+O1.">Emerging hybrid variants of Vibrio cholerae O1.</a> Vibrio cholerae—Genomics and Molecular Biology. , 179-190 (2008).</li><li>Safa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+characteristics+of+Matlab+variants+of+Vibrio+cholerae+O1+that+are+hybrids+between+classical+and+El+Tor+biotypes.">Genetic characteristics of Matlab variants of Vibrio cholerae O1 that are hybrids between classical and El Tor biotypes.</a> J. Med. Microbiol. 55 (11), 1563-1569 (2006).</li><li>Nusrin, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diverse+CTX+phages+among+toxigenic+Vibrio+cholerae+O1+and+O139+strains+isolated+between+1994+and+2002+in+an+area+where+cholera+is+endemic.">Diverse CTX phages among toxigenic Vibrio cholerae O1 and O139 strains isolated between 1994 and 2002 in an area where cholera is endemic.</a> J. Clin. Microbiol. 42 (12), 5854-5856 (2004).</li><li>Carignan, B. M., Brumfield, K. D., Son, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+nucleotide+polymorphisms+in+regulator-encoding+genes+have+an+additive+effect+on+virulence+gene+expression+in+a+Vibrio+cholerae+clinical+isolate.">Single nucleotide polymorphisms in regulator-encoding genes have an additive effect on virulence gene expression in a Vibrio cholerae clinical isolate.</a> mSphere. 1 (5), e00253 (2016).</li><li>Iwanaga, M., Yamamoto, K., Higa, N., Ichinose, Y., Nakasone, N., Tanabe, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culture+conditions+for+stimulating+cholera+toxin+production+by+Vibrio+cholerae+O1+El+Tor.">Culture conditions for stimulating cholera toxin production by Vibrio cholerae O1 El Tor.</a> Microbiol. Immunol. 30 (11), 1075-1083 (1986).</li><li>DiRita, V. J., Claude, P., Georg, J., Mekalanos, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulatory+cascade+controls+virulence+in+Vibrio+cholerae.">Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88 (12), 5403-5407 (1991).</li><li>Kovacikova, G., Lin, W., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Duel+regulation+of+genes+involved+in+acetoin+biosynthesis+and+motility/biofilm+formation+by+the+virulence+activator+AphA+and+the+acetate-responsive+Lys-R+type+regulator+AlsR+in+Vibrio+cholerae.">Duel regulation of genes involved in acetoin biosynthesis and motility/biofilm formation by the virulence activator AphA and the acetate-responsive Lys-R type regulator AlsR in Vibrio cholerae.</a> Mol. Microbiol. 57 (2), 420-433 (2005).</li><li>Vogel, H. J., Bonner, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acetylornithinase+of+Escherechia+coli:+partial+purification+and+some+properties.">Acetylornithinase of Escherechia coli: partial purification and some properties.</a> J. Biol. Chem. 218 (1), 97-106 (1956).</li><li>Son, M. S., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+screens+and+biochemical+assays+to+characterize+Vibrio+cholerae+O1+biotypes:+classical+and+El+Tor.">Genetic screens and biochemical assays to characterize Vibrio cholerae O1 biotypes: classical and El Tor.</a> Curr. Protoc. Microbiol. , 6A.2.1-6A.2.17 (2011).</li><li>Kovacikova, G., Skorupski, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+virulence+gene+expression+in+Vibrio+cholerae+by+quorum+sensing:+HapR+functions+at+the+aphA+promoter.">Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter.</a> Mol. Microbiol. 46 (4), 1135-1147 (2002).</li><li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+prevalence+of+functional+quorum-sensing+systems+in+recently+emerged+Vibrio+cholerae+toxigenic+strains.">The prevalence of functional quorum-sensing systems in recently emerged Vibrio cholerae toxigenic strains.</a> Environ. Microbiol. Rep. 3 (2), 218-222 (2011).</li><li>Sanders, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aseptic+laboratory+techniques.">Aseptic laboratory techniques.</a> J. Vis. Exp. (63), e3064 (2012).</li><li>Martinez, R. M., Megli, C. J., Taylor, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Growth+and+laboratory+maintenance+of+Vibrio+cholerae.">Growth and laboratory maintenance of Vibrio cholerae.</a> Curr. Protoc. , 6A.1.1-6A.1.6 (2010).</li></ol>

Die Autoren haben nichts zu offenbaren.

Von den über 200 identifizierten V. Cholerae Serogruppen, nur O1 und O139 haben epidemisches Potential. Die O1 Serogruppe kann in zwei Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Allerdings sind Hybrid-Stämme, die als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden, entstanden, die den El-Tor-Biotyp-Hintergrund besitzen und klassische Merkmale 8 , 9 , 10 <su...

Cholera ist eine Erkrankung des distalen Dünndarms, die durch den Verzehr von kontaminierten Lebensmitteln oder Wasser verursacht wird, die das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae enthalten. Symptome der Cholera sind Erbrechen und unkontrollierbare wässrige Durchfall, was zu schweren Dehydratation, die, wenn nicht richtig behandelt, wird zum Tod führen. V. Cholerae können in über 200 Serogruppen aufgeteilt werden, basierend auf der Struktur des Zelloberflächen-Lipopolysaccharids O-Antigens. Allerdings haben nur 2 Serogruppen, O1 und O139, epidemisches oder pandemisches Potential 1 , 2 gezeigt . Darüber hinaus ist die Serogruppe O139 in erster Linie nach Südostasien 3 , 4 isoliert, während die Serogruppe O1 weltweit verteilt ist. Darüber hinaus kann die O1-Serogruppe in 2 Haupt-Biotypen unterteilt werden: klassisch und El Tor. Der klassische Biotyp war für die erste 6 Cholera-Pandemie verantwortlichS zwischen 1817 und 1923. Die laufende siebte Pandemie ist ein Ergebnis des El Tor Biotyps, der weltweit den klassischen Biotyp in der Umwelt 5 , 6 , 7 vertrieben hat . In letzter Zeit sind Stämme aufgetreten, die charakteristische Merkmale sowohl der klassischen als auch der El Tor-Biotypen 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 enthalten und seither als El Tor-Varianten 13 , 17 bezeichnet werden . Einige El Tor-Varianten haben erhöhte Virulenz-Fähigkeiten mit einer schnelleren und schweren Krankheitsprogression gezeigt als bisher beobachtet, betontDie Notwendigkeit eines umfassenderen Ansatzes zur Identifizierung von Mitteln und zur Vorbeugung von Krankheiten 8 , 9 , 18 . Während die Biotyp-Identifizierung nicht sofort die Behandlung diktiert, können weitere Fortschritte in der Impfstoffentwicklung und zukünftigen therapeutischen Mitteln von der Biotypunterscheidung profitieren. Die erste Reihe von Protokollen, die hier aufgelistet sind, ermöglicht es den Ermittlern, V richtig zu pflegen. Cholerae-Stämme im Laborbereich. Konsistenz und anschließende Analyse erfordert die Vorbereitung und das Wachstum von Isolaten, die nicht biotypabhängig sind. Um jedoch die Virulenzgenexpression optimal zu induzieren, sind unabhängige biotypspezifische Kultivierungstechniken erforderlich. Darüber hinaus ist die Vorbereitung für verschiedene genetische und biochemische Assays in diesem Manuskript skizziert. Cholera-Toxin (CT) und das Toxin co-reGulf Pilot (TCP) sind zwei Hauptvirulenzfaktoren, die vom Masterregler ToxT in beiden Biotypen des V gesteuert werden. Cholerae O1 serogruppe 20 CT ist ein bipartites Toxin aus fünf CtxB Untereinheiten, die eine einzelne CtxA-Untereinheit umgeben, und ist verantwortlich für den schnellen Elektrolytverlust, der mit Cholera verbunden ist. TCP ist ein Typ-IV-Pilus, der von dem tcp- Operon ( tcpABQCRDSTEF ) codiert wird, und ist an der Anhaftung und Besiedlung des distalen Dünndarms beteiligt. TcpA ist das erste Gen des tcp- Operons, das für die einzelnen Pilinuntereinheiten kodiert, die für den Bau des Pilus 8 wesentlich sind. Die Gensequenz für ctxA ist vollständig zwischen klassischen und El Tor Biotypen konserviert , während ctxB und tcpA sich über die beiden Biotypen unterscheiden, aber in jedem Biotyp 8 konserviert sind. CtxB ist vollständig zwischen Biotypen außer bei zwei Base posi konserviert(115 und 203). Im El-Tor-Biotyp befindet sich Thymin an den Basenpositionen 115 und 203, während der klassische Biotyp an diesen Basen Cytosin enthält. TcpA ist in jedem Biotyp vollständig konserviert, unterscheidet sich aber bei mehreren Basen zwischen Biotypen. Diese genetischen Unterscheidungen dienen als primäre Biotyp-Identifikationsmarker, und nach der Sequenzierung des Polymerasekettenreaktions- (PCR-) Amplifikationsprodukts einschließlich dieser Stellen können Isolationssequenzen mit Wildtyp (WT) klassischem O395 oder WT El Tor N16961 verglichen werden, um den Biotyphintergrund zu bestimmen Von CT und TCP in einem gegebenen V. cholerae- Isolat. Es wurden zahlreiche Protokolle entwickelt, um die phänotypischen Unterscheidungen zwischen den klassischen und den El Tor Biotypen 21 , 22 , 23 zu charakterisieren. Polymyxin B ist ein Peptid-Antibiotikum, das die Integrität der äußeren Zellmembran im Gram-negativen bac kompromittiertTeria und Polymyxin B-Resistenz können durch den Polymyxin-B-Resistenz-Assay 21 sichtbar gemacht werden. Citrat ist ein primäres Substrat des Kreb-Zyklus, und die Fähigkeit, Citrat als einzige Kohlenstoffquelle zu metabolisieren, kann unter Verwendung des Citratmetabolismus-Assays 22 bestimmt werden . HapR kodiert einen globalen regulator und den master quorum-sensing regulator in V. cholerae, HapR, der an verschiedene Promotorregionen bindet und die Gen- und Operon-Expression 24 reguliert. Einige pathogene Stämme von V. cholerae haben eine natürlich vorkommende Frame-Shift-Mutation im hapR- Gen, die diese dichteabhängige Regulation der Virulenzgenexpression verursacht hat, um 24 , 25 verloren zu werden. Die Messung der HapR-regulierten Protease-Aktivität unter Verwendung von Milch-Agar-Medien ermöglicht es dem Forscher zu identifizieren, ob ein bestimmtes Isolat eine funktionelle HapR 23 enthält . DasHämolyse-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, hämolytische Enzyme zu sezernieren, die rote Blutkörperchen lysieren; Der Grad der Hämolyse kann auf Blut-Agarplatten 23 sichtbar gemacht werden. Die Motilität ist oft mit der Virulenz in V. cholerae assoziiert und kann mit Motilitäts-Agarplatten 23 analysiert werden. Die Voges-Proskauer-Assay-Tests für die Fähigkeit eines Stammes, Glukose als einzige Kohlenstoffquelle zu gären und das Nebenprodukt Acetoin zu produzieren 21 . Mit der Entstehung von El Tor-Varianten ist es schwierig, die Ergebnisse eines gegebenen phänotypischen Assays ohne umfangreiches genotypisches Screening vorherzusagen und vor dem Ableiten des Biotyp-Hintergrunds von V. Cholerae-Isolate ist es empfehlenswert, diese Assemblierung von Assays 23 durchzuführen und die Ergebnisse mit Referenzstämmen wie in Tabelle 2 zu vergleichen. Hier haben wir eine Reihe von Protokollen vorgestellt, die gemeinsam den Vorläufer nutzenGenotypische und phänotypische Assays für einen umfassenderen Ansatz zur Charakterisierung von V. Cholerae biotypen Darüber hinaus haben wir die genotypischen und phänotypischen Unterscheidungen der bekannten V beschrieben. Cholerae El Tor-Varianten (MQ1795 und BAA-2163) im Vergleich zu den üblicherweise verwendeten Biotyp-Referenzstämmen (WT-Klassik O395, WT El Tor C6706 und WT El Tor N16961, Tabelle 1 ). Die Entstehung von El Tor-Varianten hat Herausforderungen für die Zuverlässigkeit von zuvor eingesetzten Single-Assay-Biotyp-Charakterisierungsprotokollen herausgestellt; Dieses Mehrfach-Assay-Identifizierungssystem wird jedoch eine zuverlässigere Charakterisierung von klinischen und ökologischen V ermöglichen. Cholerae isoliert.

<table><tbody><tr><td>1 kb DNA Ladder</td><td>New England Biolabs</td><td>N3232S</td><td>https://www.neb.com/products/n3232-1-kb-dna-ladder</td></tr><tr><td>60% Glycerol</td><td>Calbiochem</td><td>356352</td><td>http://www.emdmillipore.com/US/en/product/Glycerol%2C-Molecular-Biology-Grade---CAS-56-81-5---Calbiochem,EMD_BIO-356352</td></tr><tr><td>Agar</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>214030</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=214030&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D214030%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agar with brain-heart infusion</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>237500</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=237500&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D237500%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Peqlab</td><td>732-2789</td><td>https://de.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=732-2789&amp;amp;_DARGS=/store/cms/de.vwr.com/de_DE/header_2016111711383215.jsp_AF&amp;amp;_dynSessConf=1766917479792147141&amp;amp;targetURL=/store/catalog/product.jsp%3Fcatalog_number%3D732-2789&amp;amp;lastLanguage=en&amp;amp;/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=&amp;amp;_D%3AcurrentLanguage=+&amp;amp;currentLanguage=en&amp;amp;_D%3AlastLanguage=+&amp;amp;_D%3A/vwr/userprofiling/EditPersonalInfoFormHandler.updateLocale=+</td></tr><tr><td>Anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-dibasic-anhydrous-crystalline-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/p288500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P288500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Blood Agar Plates</td><td>Remel</td><td>R01200</td><td>Store at 4 &amp;deg;C;&amp;nbsp; http://www.remel.com/Catalog/Item.aspx?name=Blood+Agar</td></tr><tr><td>Boric Acid</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/boric-acid-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/a73500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A73500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Bromothymol Blue</td><td>Fisher Scientific</td><td>B388-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/bromothymol-blue-certified-acs-fisher-chemical/b38810?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=B38810&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Cirtric acid &amp;middot;H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S72836-3</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/citric-acid-monohydrate-4/s728363#?keyword=s728363</td></tr><tr><td>Deoxynucleotide (dNTP) Solution Kit</td><td>New England Biolabs</td><td>N0446S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/n0446-deoxynucleotide-solutionset</td></tr><tr><td>Disodium EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>S311-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/ethylenediaminetetraacetic-acid-disodium-salt-dihydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-7/s311500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S311500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>DNA Clean &amp;amp; Concentrator&amp;trade; -25 Kit</td><td>Zymo Research</td><td>D4007</td><td>http://www.zymoresearch.com/dna/dna-clean-up/zymoclean-gel-dna-recovery-kit</td></tr><tr><td>GelGreen Nucleic Acid Stain</td><td>Biotium</td><td>41005</td><td>https://biotium.com/product/gelgreentm-nucleic-acid-gel-stain-10,000x-in-water/</td></tr><tr><td>Genesys 10SUV-VIS Spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>840-208100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/840-208100?ICID=search-840-208100</td></tr><tr><td>Gentra Puregene Yeast/Bact. Kit</td><td>Qiagen</td><td>158567</td><td>https://www.qiagen.com/us/shop/sample-technologies/dna/dna-preparation/gentra-puregene-yeastbact-kit/#orderinginformation</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144-212</td><td>Corrosive;&amp;nbsp; https://www.fishersci.com/shop/products/hydrochloric-acid-certified-acs-plus-fisher-chemical-10/a144212?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=A144212&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-4/p217500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P217500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-phosphate-monobasic-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-5/p285500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P285500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/potassium-hydroxide-pellets-certified-acs-fisher-chemical-5/p250500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=P250500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Le Loop</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP190-25</td><td>http://deconlabs.com/products/leloop/</td></tr><tr><td>Le Stab</td><td>Decon Labs Inc.</td><td>MP186-5</td><td>http://deconlabs.com/products/lestab/</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>M63-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/magnesium-sulfate-heptahydrate-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-3/m63500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=M63500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Mini-Sub Cell GT Horizontal Electrophoresis System</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1704406</td><td>http://www.bio-rad.com/en-us/product/mini-sub-cell-gt-cell?WT.srch=1&amp;amp;WT.mc_id=aw-cbb-NA-sub_cell_systems_brand_gold&amp;amp;WT.knsh_id=7eb1981f-a011-42a3-aece-1236ff453373</td></tr><tr><td>MR-VP Broth</td><td>Difco</td><td>216300</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=216300&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3Dmr-vp%2Bmedium%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S374-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-phosphate-dibasic-anhydrous-granular-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s374500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S374500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-chloride-crystalline-certified-acs-fisher-chemical-6/s27110?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S27110&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-bicarbonate-powder-certified-acs-fisher-chemical-5/s233500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S233500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NaNH&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;middot;4H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>S218-500</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/sodium-ammonium-phosphate-tetrahydrate-crystalline-certified-fisher-chemical/s218500?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=S218500&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophtometer</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/ND-LITE-PR?ICID=search-ND-LITE-PR</td></tr><tr><td>Nonfat dry milk</td><td>Nestle Carnation</td><td>N/A</td><td>N/A</td></tr><tr><td>Peptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211677</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211677&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211677%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Petri Dishes (100 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875712</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875712#?keyword=FB0875712</td></tr><tr><td>Petri Dishes (150 mm x 15 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875714</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/fisherbrand-petri-dishes-clear-lid-12/fb0875714?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=FB0875714&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Polymyxin B sulfate salt</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1004-10MU</td><td>Store at 2-4 &amp;deg;C; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/p1004?lang=en&amp;amp;region=US</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Taq&lt;/em&gt; Reaction Buffer</td><td>New England Biolabs</td><td>M0273S</td><td>Store at -20 &amp;deg;C;&amp;nbsp; https://www.neb.com/products/m0273-taq-dna-polymerase-with-standard-taq-buffer</td></tr><tr><td>Thermal Cycler Bio-Rad C1000 Touch&amp;trade;&amp;nbsp;</td><td>Bio Rad Labs</td><td>1840148</td><td>http://www.bio-rad.com/evportal/evolutionPortal.portal?_nfpb=true&amp;amp;_pageLabel=search_page&amp;amp;sfMode=search&amp;amp;sfStartNumber=1&amp;amp;clearQR=true&amp;amp;js=1&amp;amp;searchString=1840148&amp;amp;database=productskus+productcategories+productdetails+abdProductDetails+msds+literatures+inserts+faqs+downloads+webpages+assays+genes+pathways+plates+promotions&amp;amp;tabName=DIVISIONNAME</td></tr><tr><td>Triphenyltetrazolium chloride</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10870</td><td>https://www.alfa.com/en/catalog/A10870/</td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>https://www.fishersci.com/shop/products/tris-base-white-crystals-crystalline-powder-molecular-biology-fisher-bioreagents-7/bp1521?searchHijack=true&amp;amp;searchTerm=BP1521&amp;amp;searchType=RAPID</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>211705</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=211705&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D211705%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>Yeast Extract</td><td>Becto, Dickinson and Co.</td><td>212750</td><td>http://catalog.bd.com/nexus-ecat/getProductDetail?productId=212750&amp;amp;parentCategory=&amp;amp;parentCategoryName=&amp;amp;categoryId=&amp;amp;categoryName=&amp;amp;searchUrl=%2FsearchResults%3Fkeyword%3D212750%26typeOfSearch%3DproductSearch</td></tr><tr><td>&amp;alpha;-napthol</td><td>MP Biomedicals</td><td>204189</td><td>http://www.mpbio.com/product.php?pid=05204189</td></tr></tbody></table>

laboratory techniques used to maintain and differentiate biotypes of vibrio cholerae clinical and environmental isolates

Das aquatische Gram-negative Bakterium Vibrio cholerae ist der ätiologische Wirkstoff der infektiösen Magen-Darm-Cholera. Wegen der globalen Prävalenz und Schwere dieser Krankheit, V. Cholerae wurde sowohl im Umwelt- als auch im Laborbereich umfassend untersucht und erfordert eine ordnungsgemäße Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken. Klassik und El Tor sind zwei Hauptbiotypen, die das V bilden . Cholerae O1 Serogruppe, die jeweils einzigartige genotypische und phänotypische Eigenschaften aufweisen, die zuverlässige Mechanismen für die Biotypcharakterisierung liefern und unterschiedliche Virulenz induzierende Kultivierungsbedingungen erfordern. Unabhängig von der Biotype des ursächlichen Stammes für jede gegebene Infektion oder Ausbruch, die Standard-Behandlung für die Krankheit beinhaltet Rehydratationstherapie ergänzt mit einem Regime von Antibiotika. Allerdings kann eine Biotyp-Klassifikation für Laboruntersuchungen erforderlich sein und kann im biomedizinischen Bereich breitere Auswirkungen haben.In den frühen 2000er Jahren wurden klinische Isolate identifiziert, die genotypische und phänotypische Merkmale sowohl von klassischen als auch von El Tor Biotypen aufweisen. Die neu identifizierten Hybriden, die als El Tor-Varianten bezeichnet wurden, haben dazu geführt, dass die klinische und ökologisch isolierte Biotypidentifikation komplexer wird als die bisherigen traditionellen Einzelassay-Identifikationsprotokolle. Neben der Beschreibung von V. Cholerae-Instandhaltungs- und Kultivierungstechniken beschreibt dieses Manuskript eine Reihe von gen- spezifischen ( ctxB- und tcpA ) PCR-basierten genetischen Bildschirmen und phänotypischen Assays (Polymyxin B-Resistenz, Citrat-Metabolismus, proteolytische Aktivität, hämolytische Aktivität, Motilität und Glukosestoffwechsel über Voges- Proskauer-Assay), der gemeinsam zur Charakterisierung und / oder Unterscheidung zwischen klassischen und El-Tor-Biotypen verwendet wird. Gemeinsam bieten diese Assays einen effizienten systematischen Ansatz als Alternative oder zusätzlich zu kostspieligen, arbeitsintensiven Experimenten in der CharakteristikVon V. Cholerae klinische (und umwelt-) isolate.

Für die ordnungsgemäße Instandhaltung und Verwendung von Bakterienstämmen empfiehlt es sich, die Verdopplungszeit der betreffenden Stämme zu kennen. Hierbei sind die unterschiedlichen Wachstumsraten der üblichen V Cholerae-Stämme wurden durch eine Wachstumskurve nachgewiesen, und ungefähre Verdopplungszeiten wurden unter Verwendung einer linearen Regression berechnet. WT El Tor N16961 und El Tor Variante MQ1795 zeigten kürzere Verdopplungszeiten (~ 1 h bzw. ~ 1 h) als W...

Watch this Scientific Journal Video about Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates at JoVE.com

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich.

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; Klinische und umweltliche Isolate

The aquatic Gram-negative bacterium Vibrio cholerae is the etiological agent of the infectious gastrointestinal disease cholera. Due to the global ...

laboratory-techniques-used-to-maintain-differentiate-biotypes-vibrio

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

10.8K Aufrufe.  Plymouth State University.  Dieses Manuskript beschreibt die richtigen Vibrio Cholerae-Instandhaltungstechniken zusätzlich zu einer Reihe von biochemischen Assays, die gemeinsam für eine schnelle und zuverlässige Differenzierung zwischen klinischen und ökologischen V verwendet werden. Cholerae-Biotypen im Laborbereich. 

Serie: Laboratory Techniques Used to Maintain and Differentiate Biotypes of Vibrio cholerae Clinical and Environmental Isolates

Vibrio cholerae: Model Organism to Study Bacterial Pathogenesis - Interview

I am Es.In MindUP, we study biology of human pathogens in non hosts environments. Many human pathogens after exiting their human host have to survive in the environment before infecting another host. So our goal is to better understand processes that control survival of human pathogens in the environment.And our goal is to then better understand transmission dynamics of infectious agents. So we are using Vibrio cholera, the cost of agent of diarrhea, disease, cholera as a model organism. Vibrio cholera is a facultative human pathogen and it has an aquatic lifecycle.Therefore, it provides us great opportunity to study the survival of human pathogen in a natural environment. There are many tools to study this organism. Its genome is completely sequenced and there are micro array representing every gene in the genome.And furthermore, there are many tools that we can manipulate the genome of this organism. My research program takes advantage of these tools and integrates them to study aquatic lifecycle of cholera. So in our experiments, we try to simulate the aquatic environments that organism lives in.And then we would like to know how does this organism so senses fluctuations in its environment with respect to nutrient load, temperature, salinity, or other biological stressors such as pages and tzo? So in aquatic environment, RIA cholera is found either in a free living form or in a surface attached form. And the surface attached forms are known as biofilms, which are simply composed of microorganisms and their extra polymeric substances, which can be exo polysaccharide and proteins and sometimes DNA.And this matrix acts as a glue and hold the organism together. And when grown in biofilm mode, these organisms are actually resistant to fluctuating parameters of their environments and they can be better protected from, for example, phage and proteasome probations. And these are factors that are controlling abundance of microorganisms in the environment.Some of the recent techno technological advance that helped us in our studies are the completion of the genome sequence of the organism and development of microray technology. Using these technologies, we can determine at the whole genome level how this organism responds to major fluctuations in its environment such as nutrient deprivation or changes in temperature. Or one of our major goal is to integrate our whole genome expression studies to a network analysis.So we would like to identify genetic regulatory network that controls response of to fluctuating environmental parameters. We would like to be able to model behavior of organism in the environment. And also we still do not know when in the environment with whom Vibra Cide interacts with.We do not know much about ecology of this organism, and we also do not know relevance of the genes and processes we identified to be important for survival of this organism in the laboratory to the real world. No are the genes that we identified express when Ria cholera is present in natural environment. We also would like to be able to identify and culture organisms that Vibrio Cora interacts with because in the environment, Vibrio Cora is a part of the complex microbial community.So I think understanding biology of Vibrio Cora in natural environment would be a, it's a challenging and it's critical for us to understand biology of the organism. Within the next five years, I hope that we would be able to better characterize op polysaccharide components of biofilms. For example, in Vibrio cholera, we still do not know structure of the op polysaccharide that is holding the cells together.We also do not know all the components of biofilm metrics. Eventually I think it be great to be able to quantify components of the biofilm metrics in natural biofilms of these organisms. I think another major challenge is to study, be OC in natural environment.And I hope that we would be able to take advantage of comparative genomic studies and combine whole genomic expression profiling comparative genomics to better understand evolution of IBR cholera as a pathogen.

Vibrio cholerae: Model Organism, um bakterielle Pathogenese Study - Interview

Forschung

Biologie

Using a Pan-Viral Microarray Assay (Virochip) to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence of novel viral pathogens, such as SARS coronavirus and 2009 pandemic H1N1 influenza virus, that are not detectable by traditional methods. To address these challenges, we have previously developed and validated a pan-viral microarray platform called the Virochip with the capacity to detect all known viruses as well as novel variants on the basis of conserved sequence homology1. Using the Virochip, we have identified the full spectrum of viruses associated with respiratory infections, including cases of unexplained critical illness in hospitalized patients, with a sensitivity equivalent to or superior to conventional clinical testing2-5. The Virochip has also been used to identify novel viruses, including the SARS coronavirus6,7, a novel rhinovirus clade5, XMRV (a retrovirus linked to prostate cancer)8, avian bornavirus (the cause of a wasting disease in parrots)9, and a novel cardiovirus in children with respiratory and diarrheal illness10. The current version of the Virochip has been ported to an Agilent microarray platform and consists of ~36,000 probes derived from over ~1,500 viruses in GenBank as of December of 2009. Here we demonstrate the steps involved in processing a Virochip assay from start to finish (~24 hour turnaround time), including sample nucleic acid extraction, PCR amplification using random primers, fluorescent dye incorporation, and microarray hybridization, scanning, and analysis.

Using a Pan-Viral Microarray Assay Virochip to Screen Clinical Samples for Viral Pathogens

The Virochip is a pan-viral microarray designed to simultaneously detect all known viruses as well as novel viruses on the basis of conserved sequence homology. Here we demonstrate how to run a Virochip assay to analyze clinical samples for the presence of both known and unknown viruses.

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

The diagnosis of viral causes of many infectious diseases is difficult due to the inherent sequence diversity of viruses as well as the ongoing emergence ...

Immunologie und Infektion

TransFLP &#x2014; A Method to Genetically Modify Vibrio cholerae Based on Natural Transformation and FLP-recombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids (e.g. harboring pir-dependent or temperature-sensitive replicons1,2). These plasmids are integrated into bacterial chromosomes based on homology-mediated recombination. Such insertional mutants are often directly used in experimental settings. Alternatively, selection for plasmid excision followed by its loss can be performed, which for Gram-negative bacteria often relies on the counter-selectable levan sucrase enzyme encoded by the sacB gene4. The excision can either restore the pre-insertion genotype or result in an exchange between the chromosome and the plasmid-encoded copy of the modified gene. A disadvantage of this technique is that it is time-consuming. The plasmid has to be cloned first; it requires horizontal transfer into V. cholerae (most notably by mating with an E. coli donor strain) or artificial transformation of the latter; and the excision of the plasmid is random and can either restore the initial genotype or create the desired modification if no positive selection is exerted. Here, we present a method for rapid manipulation of the V. cholerae chromosome(s)5 (Figure 1). This TransFLP method is based on the recently discovered chitin-mediated induction of natural competence in this organism6 and other representative of the genus Vibrio such as V. fischeri7. Natural competence allows the uptake of free DNA including PCR-generated DNA fragments. Once taken up, the DNA recombines with the chromosome given the presence of a minimum of 250-500 bp of flanking homologous region8. Including a selection marker in-between these flanking regions allows easy detection of frequently occurring transformants.
This method can be used for different genetic manipulations of V. cholerae and potentially also other naturally competent bacteria. We provide three novel examples on what can be accomplished by this method in addition to our previously published study on single gene deletions and the addition of affinity-tag sequences5. Several optimization steps concerning the initial protocol of chitin-induced natural transformation6 are incorporated in this TransFLP protocol. These include among others the replacement of crab shell fragments by commercially available chitin flakes8, the donation of PCR-derived DNA as transforming material9, and the addition of FLP-recombination target sites (FRT)5. FRT sites allow site-directed excision of the selection marker mediated by the Flp recombinase10.

A quick method to modify the genome of V. cholerae is described. These modifications include the deletion of single genes, gene clusters and genomic islands as well as the integration of short sequences (e.g. promoter elements or affinity-tag sequences). The method is based on the natural transformation and FLP-recombination.

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung<em&gt; Vibrio cholerae</em&gt; On Natural Transformation und FLP-Rekombination

Several methods are available to manipulate bacterial chromosomes1-3. Most of these protocols rely on the insertion of conditionally replicative plasmids ...

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

Kultivierung und Pflege<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In einer anaeroben Umgebung

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the majority of Vibrio-associated infections. Thus, accurate differentiation among Vibrio spp. and detection of V. parahaemolyticus is critically important to ensure the safety of our food supply. Although molecular techniques are increasingly common, culture-depending methods are still routinely done and they are considered standard methods in certain circumstances. Hence, a novel chromogenic agar medium was tested with the goal of providing a better method for isolation and differentiation of clinically relevant Vibrio spp. The protocol compared the sensitivity, specificity and detection limit for the detection of V. parahaemolyticus between the new chromogenic medium and a conventional medium. Various V. parahaemolyticus strains (n=22) representing diverse serotypes and source of origins were used. They were previously identified by Food and Drug Administration (FDA) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), and further verified in our laboratory by tlh-PCR. In at least four separate trials, these strains were inoculated on the chromogenic agar and thiosulfate-citrate-bile salts-sucrose (TCBS) agar, which is the recommended medium for culturing this species, followed by incubation at 35-37 &#176;C for 24-96 hr. Three V. parahaemolyticus strains (13.6%) did not grow optimally on TCBS, nonetheless exhibited green colonies if there was growth. Two strains (9.1%) did not yield the expected cyan colonies on the chromogenic agar. Non-V. parahaemolyticus strains (n=32) were also tested to determine the specificity of the chromogenic agar. Among these strains, 31 did not grow or exhibited other colony morphologies. The mean recovery of V. parahaemolyticus on the chromogenic agar was ~96.4% relative to tryptic soy agar supplemented with 2% NaCl. In conclusion, the new chromogenic agar is an effective medium to detect V. parahaemolyticus and to differentiate it from other vibrios.

Development of a More Sensitive and Specific Chromogenic Agar Medium for the Detection of Vibrio parahaemolyticus and Other Vibrio Species

Detection and isolation of clinically relevant Vibrio species require selective and differential culture media. This study evaluated the ability of a new chromogenic medium to detect and identify V. parahaemolyticus and other related species. The new medium was found to have better sensitivity and specificity than the conventional medium.

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Und andere<em&gt; Vibrio</em&gt; Arten

Foodborne infections in the US caused by Vibrio species have shown an upward trend. In the genus Vibrio, V. parahaemolyticus is responsible for the ...

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ability to obtain single cells for fluorescence microscopy, which can be particularly challenging when imaging cells that exist within bacterial communities. For example, the human pathogen Vibrio parahaemolyticus exists as short rod-shaped swimmer cells in liquid conditions that upon surface contact differentiate into a subpopulation of highly elongated swarmer cells specialized for growth on solid surfaces. This paper presents a method to perform single cell fluorescence microscopy analysis of V. parahaemolyticus in its two differential states. This protocol very reproducibly induces differentiation of V. parahaemolyticus into a swarmer cell life-cycle and facilitates their proliferation over solid surfaces. The method produces flares of differentiated swarmer cells extending from the edge of the swarm-colony. Notably, at the very tip of the swarm-flares, swarmer cells exist in a single layer of cells, which allows for their easy transfer to a microscope slide and subsequent fluorescence microscopy imaging of single cells. Additionally, the workflow of image analysis for demographic representation of bacterial societies is presented. As a proof of principle, the analysis of the intracellular localization of chemotaxis signaling arrays in swimmer and swarmer cells of V. parahaemolyticus is described.

Induction of Cellular Differentiation and Single Cell Imaging of Vibrio parahaemolyticus Swimmer and Swarmer Cells

This protocol enables single cell microscopy of the differentially distinct Vibrio parahaemolyticus swimmer and swarmer cells. The method produces a population of swarmer cells easily available for single cell analysis and covers preparation of cell cultures, induction of swarmer differentiation, sample preparation, and image analysis.

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von<em&gt; Vibrio parahaemolyticus</em&gt; Schwimmer und Swarmer Cells

The ability to study the intracellular localization of proteins is essential for the understanding of many cellular processes. In turn, this requires the ...

Bile Salt-induced Biofilm Formation in Enteric Pathogens: Techniques for Identification and Quantification

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, a significant stress response is induced during gastrointestinal transit and upon bile exposure, a normal component of human digestion. To overcome the bactericidal effects of bile, many enteric pathogens form a biofilm hypothesized to permit survival when transiting through the small intestine. Here we present methodologies to define biofilm formation through solid-phase adherence assays as well as extracellular polymeric substance (EPS) matrix detection and visualization. Furthermore, biofilm dispersion assessment is presented to mimic the analysis of events triggering release of bacteria during the infection process. Crystal violet staining is used to detect adherent bacteria in a high-throughput 96-well plate adherence assay. EPS production assessment is determined by two assays, namely microscopy staining of the EPS matrix and semi-quantitative analysis with a fluorescently-conjugated polysaccharide binding lectin. Finally, biofilm dispersion is measured through colony counts and plating. Positive data from multiple assays support the characterization of biofilms and can be utilized to identify bile salt-induced biofilm formation in other bacterial strains.

This protocol enables the reader to analyze bile salt-induced biofilm formation in enteric pathogens using a multifaceted approach to capture the dynamic nature of bacterial biofilms by assessing adherence, extracellular polymeric substance matrix formation, and dispersion.

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Biofilm formation is a dynamic, multistage process that occurs in bacteria under harsh environmental conditions or times of stress. For enteric pathogens, ...

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the aquatic environment, where it interacts with a variety of higher aquatic species. Vertebrate fish are known to be an environmental host and are a potential V. cholerae reservoir in nature. Both V. cholerae and the teleost fish species Danio rerio, commonly known as zebrafish, originate from the Indian subcontinent, suggesting a long-standing interaction in aquatic environments. Zebrafish are an ideal model organism for studying many aspects of biology, including infectious diseases. Zebrafish can be easily and rapidly colonized by V. cholerae after exposure in water. Intestinal colonization by V. cholerae leads to the production of diarrhea and the excretion of replicated V. cholerae. These excreted bacteria can then go on to colonize new fish hosts. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae-intestinal colonization in zebrafish and how to quantify V. cholerae-induced zebrafish diarrhea. The colonization model should be useful to researchers who are studying whether genes of interest may be important for host colonization and/or for environmental survival. The quantification of zebrafish diarrhea should be useful to researchers studying any intestinal pathogen who are interested in exploring zebrafish as a model system.

Quantifying Vibrio cholerae Colonization and Diarrhea in the Adult Zebrafish Model

Zebrafish are a natural Vibrio cholerae host and can be used to recapitulate and study the entire infectious cycle from colonization to transmission. Here, we demonstrate how to assess V. cholerae colonization levels and quantify diarrhea in zebrafish.

Quantifizierung von Vibrio Cholerae Kolonisation und Durchfall bei Erwachsenen Zebrafisch-Modell

Vibrio cholerae is best known as the infectious agent that causes the human disease cholera. Outside the human host, V. cholerae primarily exists in the ...

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. This method employs stable plasmids that allow each population to be differentially tagged with distinct antibiotic resistance capabilities and fluorescent proteins for selection and visual discrimination of each population, respectively. Here, we describe the preparation and coincubation of competing Vibrio fischeri strains, fluorescence microscopy imaging, and quantitative data analysis. This approach is simple, yields quick results, and can be used to determine whether one population kills or inhibits the growth of another population, and whether competition is mediated through a diffusible molecule or requires direct cell-cell contact. Because each bacterial population expresses a different fluorescent protein, the assay permits the spatial discrimination of competing populations within a mixed colony. Although the described methods are performed with the symbiotic bacterium V. fischeri using conditions optimized for this species, the protocol can be adapted for most culturable bacterial isolates.

Coincubation Assay for Quantifying Competitive Interactions between Vibrio fischeri Isolates

Bacteria encode diverse mechanisms for engaging in interbacterial competition. Here, we present a culture-based protocol for characterizing competitive interactions between bacterial isolates and how they impact the spatial structure of a mixed population.

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

This manuscript describes a culture-based, coincubation assay for detecting and characterizing competitive interactions between two bacterial populations. ...

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has become the method of choice for introducing DNA into prokaryotes that are not naturally competent. Electroporation is a rapid, efficient, and streamlined transformation method that, in addition to purified DNA and competent bacteria, requires commercially available gene pulse controller and cuvettes. In contrast to the pulsing step, preparation of electrocompetent cells is time consuming and labor intensive involving repeated rounds of centrifugation and washes in decreasing volumes of sterile, cold water, or non-ionic buffers of large volumes of cultures grown to mid-logarithmic phase of growth. Time and effort can be saved by purchasing electrocompetent cells from commercial sources, but the selection is limited to commonly employed E. coli laboratory strains. We are hereby disseminating a rapid and efficient method for preparing electrocompetent E. coli, which has been in use by bacteriology laboratories for some time, can be adapted to V. cholerae and other prokaryotes. While we cannot ascertain whom to credit for developing the original technique, we are hereby making it available to the scientific community.

Rapid Protocol for Preparation of Electrocompetent Escherichia coli and Vibrio cholerae

Electroporation is a commonly employed method for introducing DNA into bacteria in a process known as transformation. Traditional protocols for the preparation of electrocompetent cells are time consuming and labor intensive. This article describes an alternate, rapid, and efficient method for the preparation of electrocompetent cells presently employed by some laboratories.

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Und<em&gt; Vibrio cholerae</em

Electroporation has become a widely used method for rapidly and efficiently introducing foreign DNA into a wide range of cells. Electrotransformation has ...

Labortechniken zur Aufrechterhaltung und Differenzierung von Biotypen von

Zusammenfassung

Weitere Videos entdecken

Kapitel in diesem Video

Vibrio cholerae: Model Organism, um bakterielle Pathogenese Study - Interview

Mit einem Pan-Viral Microarray-Assay (Virochip) zur klinischen Proben, die für virale Erreger Bildschirm

TransFLP - Eine Methode zur genetischen Veränderung

Kultivierung und Pflege

Entwicklung eines sensitiven und spezifischen chromogenen Agar Medium zum Nachweis von

Induktion der zellulären Differenzierung und Einzelzell - Bildgebung von

Galle-Salz-induzierte Biofilmbildung im enterischen Krankheitserregern: Techniken für die Identifizierung und Quantifizierung

Quantifizierung von Vibrio Cholerae Kolonisation und Durchfall bei Erwachsenen Zebrafisch-Modell

Coincubation Assay zur Quantifizierung von Wettbewerbsinteraktionen zwischen Vibrio fischeri Isolaten

Rapid-Protokoll für die Herstellung von Elektrokompetente