この研究はテキサス州ヒューストンのテキサス大学MDアンダーソンがんセンター（スタートアップファンド、BB）の支援を受けていました。

1.ソリューションの準備<ol><li> 実験ごとに以下の解決策を用意してください。 <ol><li> 固定溶液は37％ホルムアルデヒドを調製し、室温で保存します。 1.42％の最終濃度になるように1倍リン酸緩衝生理食塩水（PBS）で希釈する。 注意：ホルムアルデヒドは刺激性、腐食性、突然変異誘発性、催奇性、発癌性に分類されます。摂取しないでください。ガス/フューム/蒸気/スプレーを吸入してはならない。換気が不十分な場合は、適切な呼吸器を着用する。皮膚や眼との接触を避ける。酸化剤、還元剤、酸、アルカリ、水分などの不適合物を避けてください。 </li><li>グリシン停止 - 固定溶液については、1×PBS溶液中に0.125Mグリシンを調製し、室温で保存する。 </li><li>細胞掻爬溶液のために、dH 2 O中の1 × PBS溶液を調製し、氷上に保存する。使用直前に、プロテイナーゼ阻害剤フェニルメチルスルホニルフルオライド（PMSF）t0.5mMの最終濃度。 注意：PMSFは腐食性および有毒性に分類されています。保護服を着用し、換気の良い場所で使用すること。 </li><li>細胞溶解バッファー（20 mM Tris-HCl; pH 8.0,85 mM KClおよび0.5％NP40）を使用する直前に、1Xプロテアーゼインヒビターカクテル（PIC;ジメチルスルホキシド（DMSO）中100Xストック溶液：104 mM 4- （AEBSF）、80μMアプロチニン、4mMベスタチン、1.4mM E-64,2mMロイペプチン、および1.5mMペプスタチンA）および0.5mM PMSFを添加した。 </li><li>核溶解緩衝液（50mM Tris-Cl; pH8.0,10mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、および1％SDS）を使用する直前に、1X PICおよび0.5mM PMSFを加える。 </li></ol></li></ol> 2.細胞固定およびせん断<ol><li> 10cmの組織培養プレート上で細胞を70〜80％のコンフルエンスまで増殖させる。実験目的ごとに細胞を刺激する。 </li><li>組織培養培地を除去し、固定液5mLを添加し、インキュベートする細胞を振盪プラットフォーム上で室温で10分間インキュベートした。 </li><li>固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 1x PBSを除去し、5mLのグリシン停止固定溶液を添加し、振盪プラットフォーム上でRTで5分間細胞をインキュベートする。 </li><li>グリシン停止固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。 </li><li> 1×PBSを除去し、2mLの細胞掻き取り溶液を加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収する。採取した細胞を氷上のコニカルチューブに移す。 </li><li> 600 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>上清を除去し、ペレットを1×細胞溶解緩衝液1mLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。あるいは、液体窒素中でペレットをスナップフリーズし、-80℃で保存します。 </li><li>ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷ダウンスホモジナイザーに移し、タイプBのペストル細胞破壊のためのe。 </li><li>細胞懸濁液をマイクロ遠心チューブに移し、2,400 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離します。 </li><li>上清を捨て、ペレットを350μLの核消化バッファーに再懸濁し、37℃で5分間サンプルをインキュベートする。 </li><li>マイクロコッカルヌクレアーゼ（1U /μL）を添加し、ボルテックスで混合する。サンプルを37℃で5〜20分間インキュベートする。 2分ごとにサンプルを反転させる。 注：時間と酵素濃度は細胞株間で異なり、最適以下の酵素的剪断の場合に最適化が必要な場合があります。 </li><li> あるいは、市販の超音波処理器を用いた超音波処理によるクロマチン剪断を達成する。 注：超音波条件は最適化が必要です。 300μLのサンプル容量と25％のサンプル処理能力を用いて最適化の例のプロトコルを以下に示す。 <ol><li>ステップ2.10の後、上清を捨て、nを再懸濁する1.0mLの商業的剪断緩衝液中に溶解した。 </li><li> 300μLの再懸濁した核ペレットを3つの1.7mLマイクロ遠心チューブに分注する。それらを氷上に置きます。 </li><li>最適な超音波処理条件を決定するために、3つの異なる条件を使用して25％出力で固定クロマチンの3つのアリコートをせん断する： それぞれ20秒の5パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。 それぞれ20秒の10パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。 それぞれ20秒の20回のパルス、各パルスの間の氷上での30秒の休息。 </li><li>以下に説明するように、ステップ2.15に進みます。 </li></ol></li><li>マイクロコッカルヌクレアーゼでインキュベートした後、反応を停止させるために7μLの氷冷0.5M EDTAを加える。 </li><li>剪断したDNAで16,200 xgおよび4℃で10分間サンプルを遠心分離する。 </li><li>剪断したDNA含有上清を新鮮な微量遠心管に移す。 50μLを別のマイクロ遠心チューブに分注してsuを確認する。DNAの厳しい剪断（セクション3）。免疫沈降（セクション4）のために残りの容量をすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。 </li></ol> 3.せん断効率の確認<ol><li>ステップ2.16のせん断された染色質の50μLアリコートに150μLのヌクレアーゼフリーdH 2 Oおよび10μLの5M NaClを加える。 </li><li>サンプルを65℃で4時間インキュベートし、クロスリンクを逆にする。 </li><li> 2μLのRNase A（10μg/μL）を添加し、サンプルを37℃で15分間インキュベートする。 </li><li>プロテイナーゼK（0.5μg/μL）10μLを添加し、サンプルを42℃で90分間インキュベートする。 </li><li> DNAの精製のために、フェノール/クロロホルム抽出を行う12 。 <ol><li>ヌクレアーゼフリーの水を200μLの最終容量に加えます。 200μLのフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：1）を試料に添加し、20秒間ボルテックスする。 </li><li>室温で遠心する16000×gで5分間の穿孔。慎重に上部の水相を取り出し、新しいチューブに移す。ピペッティング中にフェノールを持ち込まないように注意してください。 </li><li> 0.1M容の3M酢酸ナトリウム（NH 4 OAc）（pH4.2）を加え、チューブを指で数回フリックすることによって混合する。 2.5容量の氷冷した100％エタノールを加え、ボルテックスで5秒間混合する。サンプルO / Nを-20℃でインキュベートするか、-80℃で少なくとも1時間インキュベートする。 </li><li> 4℃、16,000 xgで30分間サンプルを遠心分離し、cDNAをペレットにします。 </li><li>ペレットを破壊することなく上清を注意深く除去する。 1mLのRT、70％エタノールを添加し、チューブを数回反転させる。 </li><li> 4℃、16,000×gで2分間サンプルを遠心分離する。慎重に上清を除去する。 </li><li>ペレットを室温で5〜10分間乾燥する。ペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。 </li></ol></li><li> 1％TAEを用いたゲル電気泳動のために、精製されたDNAの5および10μLアリコートを使用するアガロースゲル。 注：成功したクロマチン剪断は、200-1,500 bpのDNAパターンをもたらす。せん断がうまくいかない場合、せん断工程（ステップ2.12）のインキュベーション時間を5分、10分および15分に変更することによって、特定の細胞の最適なせん断条件を決定する。 </li><li>残りのサンプルを使用して、サンプルのDNA濃度を分析します。剪断したクロマチンサンプル中のDNA濃度を逆算する（ステップ2.16）。免疫沈降のための各処置群について同じDNA量を用いる（セクション4）。 </li></ol>免疫沈降<ol><li> 25μLのChIPグレードプロテインG磁気ビーズ、10μLの免疫沈降希釈緩衝液（ストック溶液：0.01％SDS、1.1％Triton X-100,16.7mM）と10-25μgの剪断架橋クロマチン（ステップ2.16）トリス-HCl; pH8.0,1.2mM EDTA、および167mM NaCl）、および1μLのPICを含む。 </li><li> 4時間のインキュベーションの後、1〜10μgの抗体（抗体濃縮物抗体の親和性に基づいて変化する;製造業者の推奨に従って最初に使用し、必要に応じて実験的に最適化する）を1.5mLマイクロ遠心チューブに加え、dH 2 Oを最終容量100μLに加える。 注：上記の直接免疫沈降法の代わりに、間接免疫沈降法を、最初にクロマチンを抗体と組み合わせ、続いてプロテインG磁気ビーズを添加することにより使用することができる。 </li><li>サンプルを4〜12時間4℃でエンドツーエンド回転子にインキュベートする。 </li></ol>溶出<ol><li>磁気スタンドにチューブを置きます。磁性ビーズがチューブの側面に集まったら、慎重に上清を除去して捨てる。 </li><li>洗浄緩衝液1（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA pH8,20mM Tris-HCl; pH8,150mM NaCl）800μLでビーズを3回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドに磁気ビーズがチューブの側面で凝集すると、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。 </li><li> 800μLの洗浄緩衝液2（0.1％SDS、1％Triton X-100,2mM EDTA; pH8,20mM Tris-HCl pH8および500mM NaCl）でビーズを1回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドの上に置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まったら、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。 </li><li>ビーズを50μLの溶出バッファー（1％SDSおよび100mM NaHCO 3 ）に再懸濁し、サンプルをRTで15分間エンドツーエンド回転子にインキュベートする。 </li><li>チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まると、上清を新しいチューブに移す。 </li><li> 6μLの5M NaClを添加して架橋を逆転させ、2μLのプロテイナーゼK（0.5μg/μL）を加える。サンプルを混合した後、サンプルを65℃で2時間インキュベートする。 </li><li> DNAの精製のために、phenol /クロロホルム抽出12 （ステップ3.5）、続いてペレットを30μLのdH 2 Oに再懸濁する。 注：サンプルはタンパク質結合部位（セクション5）について直接解析することも、-20℃で保存することもできます。 </li></ol> 6.結合部位分析<ol><li> PCRまたはqRT-PCRを使用して、既知の核酸配列内の特異的結合部位の分析を行います。プライマー設計については、従来のPCRまたはqRT-PCRプロトコールに従う。目的のタンパク質結合部位を架橋する150〜400 bpのアンプリコンを合成するためのプライマーを設計します （ 図1 ）。 </li><li>目的の抗体で免疫沈降したChIP由来のDNA、非特異的なIgG抗体で免疫沈降させたChIP由来のDNA、iii）入力DNA、およびiv）H 2 Oとしての特異性を保証するために、4つの異なるDNA鋳型を用いてPCRをセットアップする。汚染を排除するためのPCRの陰性対照。経路刺激の場合免疫沈降したタンパク質の既知の結合部位に特異的な異なるプライマーセットを用いて第5の鋳型を選択する。 注：c-KITリガンドプロモーター分析の場合、従来のPCRを使用して、c-KITリガンドプロモーター領域内のSBEでのTGF-β誘導SMAD結合を実証する。陽性対照として、TGF-β誘導性SMAD結合の既知の標的としてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1（PAI-1）でPCRを行う。 </li></ol>

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著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。

この報告では、我々は、c-KITリガンドプロモーター内のSBEへのSMAD2のTGF-β1誘導性結合およびTGF-β1リガンド遺伝子内のその認識配列へのSTAT3のTGF-β1誘導結合を実証する。本発明者らは、クロマチン免疫沈降を用いて、両方の転写因子のサイトカイン誘導性結合を実証する。 クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質がDNAに直接結合することを実証し、タンパク質のDNA結合?...

真核生物の核において、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。生理学的、病態生理学的および細胞生物学的状況において、細胞機能は、クロマチン配位遺伝子発現によって空間的および一時的に制御される。 DNA-タンパク質相互作用は、DNA複製、組換え、および修復、ならびにタンパク質発現などの細胞プロセスの調節において必須の役割を果たす。したがって、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子発現および細胞機能の評価において不可欠なツールである。 電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリンティング1,2など、インビトロでのDNA-タンパク質相互作用を評価するいくつかの技術が存在する。しかしながら、これらの技術は、クロマチンおよび細胞の状況におけるタンパク質-DNA相互作用を分析しない。チップI特定のDNA結合部位に結合したタンパク質を捕捉し、それによってクロマチンの状況におけるDNA-タンパク質相互作用の同定を容易にする技術である。この技術は、もともとGimourとLisによって、 Escherichia coliおよびDrosophila melanogaster 3,4 における特定の遺伝子へのRNAポリメラーゼII結合の評価のために開発されました。これは、DNA-タンパク質複合体の固定化、その後のクロマチン抽出および約200塩基対（bp）断片へのDNAの切断によって行われる。続いて、目的のDNA結合タンパク質を免疫沈降によって単離する。 DNA-タンパク質架橋の逆転後、DNAを精製し、分析する。タンパク質結合部位の分析にはいくつかの方法を用いることができ、標的遺伝子5内のタンパク質結合部位の核酸配列に依存する5 。 DNA配列が既知である場合、標準的なPol既知の結合部位に隣接する特定のプライマー対を用いて、イメラーゼ連鎖反応（PCR）を適用することができる。定量的リアルタイムPCR（qRT-PCR）も使用できます6 。配列が未知である場合、ChIPはDNAマイクロアレイ（ChIP-on-chip）、DNA配列決定（ChIP-seq）、またはクローニング技術7,8,9と組み合わせることができる。 TGF-β経路は強力な腫瘍抑制機能を有し、細胞分化の鍵となる経路である。それはTGF-β1リガンドの同族受容体複合体への結合によって活性化され、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらす。共通のメディエーターであるSMAD4との会合後、SMAD複合体は核に移行し、標的遺伝子のプロモーター領域内のSBEに結合し、細胞周期、アポトーシスおよび細胞の区別を制御する遺伝子を制御するに。 TGF-β刺激に対する転写応答は、細胞型および状況特異的である10 。最近、我々は、TGF-βとc-KIT経路11との間の正のフィードバックループを記載した。このモデルでは、TGF-β1活性化SMAD2はc-KITリガンドプロモーターに結合し、その発現および分泌を誘導する。続いて、c-KITリガンドは、c-KIT受容体を自己および準クリニック様式で活性化する。 c-KIT受容体活性化は、JAK1 / 2を介したSTAT3 Tyr705リン酸化をもたらす。 STAT3活性化および核移行後、STAT3はTGF-β1リガンド遺伝子に結合し、その発現を調節する。 ここでは、我々は、c-KIT受容体リガンドプロモーターへのSMAD2結合の同定、およびシグナルトランスデューサー（および）転写3（TGF-β1-遺伝子）。

<table><tbody><tr><td>HepG2 cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Hep3B cells</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&amp;beta;1</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>101-B1</td><td>Used at a concentration of 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Anti-SMAD2 antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>5339</td><td>Amount used/IP: 3 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>Anti-STAT3 antibody</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4904</td><td>Amount used/IP: 3 &amp;micro;g</td></tr><tr><td>ChIP-IT Protein G Magnetic Beads</td><td>Active Motif</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Active Motif</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Micrococcal Nuclease</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>PCR forward primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: SCF</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3&amp;rsquo;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR forward primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCR reverse primer: TGF-&amp;beta;1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sequence: 5&amp;rsquo;-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3&amp;rsquo;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td></tr></tbody></table>

analysis of the c-kit ligand promoter using chromatin immunoprecipitation

DNA複製および修復、DNA組換えおよび遺伝子発現を含む複数の細胞プロセスは、タンパク質とDNAとの相互作用を必要とする。したがって、DNA-タンパク質相互作用は、細胞分化、細胞増殖、細胞周期制御、染色体安定性、エピジェネティックな遺伝子調節、および細胞形質転換などの複数の生理学的、病態生理学的および生物学的機能を調節する。真核細胞では、DNAはヒストンタンパク質および非ヒストンタンパク質と相互作用し、クロマチンに凝縮する。電気泳動（ゲル）移動度シフトアッセイ（EMSA）およびDNase Iフットプリントなど、いくつかの技術的ツールを用いてDNA-タンパク質相互作用を分析することができる。しかし、これらの技術は、細胞内ではなく、インビトロでタンパク質-DNA相互作用を分析する。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、特定のDNA結合部位でタンパク質を捕捉し、それによってDNA-タンパク質相互作用の同定を可能にする技術であるそれらのクロマチンの文脈内にある。これは、DNA-タンパク質相互作用の固定化、続いて目的のタンパク質の免疫沈降によって行われる。続いて、タンパク質が結合したゲノム部位が特徴付けられる。ここで、我々はChIPを記載し、議論し、チロシンキナーゼのプロモーター領域内のSMAD結合要素（SBE）への転写因子SMAD2の形質転換成長因子-β（TGF-β）誘導結合の同定のための分析値を示す。プロテインキナーゼキット（c-KIT）受容体リガンド幹細胞因子（SCF）。

TGF-β1リガンドのその同族受容体複合体への結合は、SMAD2 / 3転写因子のセリンリン酸化をもたらし、次いで共通メディエーター、SMAD4とのそれらの会合をもたらす。 SMAD複合体は核に移行する。 TGF-βは、標的遺伝子の調節領域内のSBEへのSMAD結合を介して、または関心対象の遺伝子の発現を引き続き制御する転写活性化因子またはリプレッサーのSMAD調節発現を介して間?...

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Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Genetics

7.7K ビュー.  The University of Texas MD Anderson Cancer Center.  DNA-タンパク質相互作用は、複数の生物学的プロセスにとって必須である。細胞機能の評価の間、DNA-タンパク質相互作用の分析は、遺伝子調節を理解するために不可欠である。クロマチン免疫沈降（ChIP）は、 インビボでそのような相互作用を分析するための強力なツールである。 

ビデオ: Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) in Mouse T-cell Lines

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational modifications (PTMs) of histone tails, the exchange of canonical histones with histone variants, and nucleosome eviction. Such regulation requires the binding of signal-sensitive transcription factors (TFs) that recruit chromatin-modifying enzymes at regulatory elements defined as enhancers. Understanding how signaling cascades regulate enhancer activity requires a comprehensive analysis of the binding of TFs, chromatin modifying enzymes, and the occupancy of specific histone marks and histone variants. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) assays utilize highly specific antibodies to immunoprecipitate specific protein/DNA complexes. The subsequent analysis of the purified DNA allows for the identification the region occupied by the protein recognized by the antibody. This work describes a protocol to efficiently perform ChIP of histone proteins in a mature mouse T-cell line. The presented protocol allows for the performance of ChIP assays in a reasonable timeframe and with high reproducibility.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP in Mouse T-cell Lines

This work describes a protocol for chromatin immunoprecipitation (ChIP) using a mature mouse T-cell line. This protocol is suitable to investigate the distribution of specific histone marks at specific promoter sites or genome-wide.

マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

Signaling pathways regulate gene expression programs via the modulation of the chromatin structure at different levels, such as by post-translational ...

遺伝学

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for example, during cellular differentiation, morphogenesis, and functional stimulation (such as activation of immune cells), or after exposure to drugs and other factors from the local environment. Depending on the stimulus and cell type, these changes occur rapidly and at any possible level of gene regulation. Displaying all molecular processes of a responding cell to a certain type of stimulus/drug is one of the hardest tasks in molecular biology. Here, we describe a protocol that enables the simultaneous analysis of multiple layers of gene regulation. We compare, in particular, transcription factor binding (Chromatin-immunoprecipitation-sequencing (ChIP-seq)), de novo transcription (4-thiouridine-sequencing (4sU-seq)), mRNA processing, and turnover as well as translation (ribosome profiling). By combining these methods, it is possible to display a detailed and genome-wide course of action.
Sequencing newly transcribed RNA is especially recommended when analyzing rapidly adapting or changing systems, since this depicts the transcriptional activity of all genes during the time of 4sU exposure (irrespective of whether they are up- or downregulated). The combinatorial use of total RNA-seq and ribosome profiling additionally allows the calculation of RNA turnover and translation rates. Bioinformatic analysis of high-throughput sequencing results allows for many means for analysis and interpretation of the data. The generated data also enables tracking co-transcriptional and alternative splicing, just to mention a few possible outcomes.
The combined approach described here can be applied for different model organisms or cell types, including primary cells. Furthermore, we provide detailed protocols for each method used, including quality controls, and discuss potential problems and pitfalls.

This protocol describes the combinatorial use of ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq, and ribosome profiling for cell lines and primary cells. It enables tracking changes in transcription-factor binding, de novo transcription, RNA processing, turnover and translation over time, and displaying the overall course of events in activated and/or rapidly changing cells.

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

Promoter Capture Hi-C: High-resolution, Genome-wide Profiling of Promoter Interactions

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the spatio-temporal expression of their target genes through physical contact, often bridging considerable (in some cases hundreds of kilobases) genomic distances and bypassing nearby genes. The human genome harbors an estimated one million enhancers, the vast majority of which have unknown gene targets. Assigning distal regulatory regions to their target genes is thus crucial to understand gene expression control. We developed Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) to enable the genome-wide detection of distal promoter-interacting regions (PIRs), for all promoters in a single experiment. In PCHi-C, highly complex Hi-C libraries are specifically enriched for promoter sequences through in-solution hybrid selection with thousands of biotinylated RNA baits complementary to the ends of all promoter-containing restriction fragments. The aim is to then pull-down promoter sequences and their frequent interaction partners such as enhancers and other potential regulatory elements. After high-throughput paired-end sequencing, a statistical test is applied to each promoter-ligated restriction fragment to identify significant PIRs at the restriction fragment level. We have used PCHi-C to generate an atlas of long-range promoter interactions in dozens of human and mouse cell types. These promoter interactome maps have contributed to a greater understanding of mammalian gene expression control by assigning putative regulatory regions to their target genes and revealing preferential spatial promoter-promoter interaction networks. This information also has high relevance to understanding human genetic disease and the identification of potential disease genes, by linking non-coding disease-associated sequence variants in or near control sequences to their target genes.

DNA regulatory elements, such as enhancers, control gene expression by physically contacting target gene promoters, often through long-range chromosomal interactions spanning large genomic distances. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identifies significant interactions between promoters and distal regions, enabling the assignment of potential regulatory sequences to their target genes.

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

The three-dimensional organization of the genome is linked to its function. For example, regulatory elements such as transcriptional enhancers control the ...

A Chromatin Immunoprecipitation Assay to Identify Novel NFAT2 Target Genes in Chronic Lymphocytic Leukemia

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western countries. The majority of CLL patients show an indolent course of the disease as well as an anergic phenotype of their leukemia cells, referring to a B cell receptor unresponsive to external stimulation. We have recently shown that the transcription factor NFAT2 is a crucial regulator of anergy in CLL. A major challenge in the analysis of the role of a transcription factor in different diseases is the identification of its specific target genes. This is of&#160;great significance for the elucidation of pathogenetic mechanisms and potential therapeutic interventions. Chromatin immunoprecipitation (ChIP) is a classic technique to demonstrate protein-DNA interactions and can, therefore, be used to identify direct target genes of transcription factors in mammalian cells. Here, ChIP was used to identify LCK as a direct target gene of NFAT2 in human CLL cells. DNA and associated proteins are crosslinked using formaldehyde and subsequently sheared by sonication into DNA fragments of approximately 200-500 base pairs (bp). Cross-linked DNA fragments associated with NFAT2 are then selectively immunoprecipitated from cell debris using an &#945;NFAT2 antibody. After purification, associated DNA fragments are detected via quantitative real-time PCR (qRT-PCR). DNA sequences with evident enrichment represent regions of the genome which are targeted by NFAT2 in vivo. Appropriate shearing of the DNA and the selection of the required antibody are particularly crucial for the successful application of this method. This protocol is ideal for the demonstration of direct interactions of NFAT2 with target genes. Its major limitation is the difficulty to employ ChIP in large-scale assays analyzing the target genes of multiple transcription factors in intact organisms.

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common leukemia in the western world. NFAT transcription factors are important regulators of development and activation in numerous cell types. Here, we present a protocol for the use of chromatin immunoprecipitation (ChIP) in human CLL cells to identify novel target genes of NFAT2.

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is characterized by the expansion of malignant B cell clones and represents the most common leukemia in western ...

がん研究

Assays for Validating Histone Acetyltransferase Inhibitors

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene expression. KATs, such as CBP/p300, are under intense investigation as therapeutic targets due to their critical role in tumorigenesis of diverse cancers. The development of novel small molecule inhibitors targeting the histone acetyltransferase (HAT) function of KATs is challenging and requires robust assays that can validate the specificity and potency of potential inhibitors.
This article outlines a pipeline of three methods that provide rigorous in vitro validation for novel HAT inhibitors (HATi). These methods include a test tube HAT assay, Chromatin Hyperacetylation Inhibition (ChHAI) assay, and Chromatin Immunoprecipitation-quantitative PCR (ChIP-qPCR). In the HAT assay, recombinant HATs are incubated with histones in a test tube reaction, allowing for acetylation of specific lysine residues on the histone tails. This reaction can be blocked by a HATi and the relative levels of site-specific histone acetylation can be measured via immunoblotting. Inhibitors identified in the HAT assay need to be confirmed in the cellular environment.
The ChHAI assay uses immunoblotting to screen for novel HATi that attenuate the robust hyperacetylation of histones induced by a histone deacetylase inhibitor (HDACi). The addition of an HDACi is helpful because basal levels of histone acetylation can be difficult to detect via immunoblotting.
The HAT and ChHAI assays measure global changes in histone acetylation, but do not provide information regarding acetylation at specific genomic regions. Therefore, ChIP-qPCR is used to investigate the effects of HATi on histone acetylation levels at gene regulatory elements. This is accomplished through selective immunoprecipitation of histone-DNA complexes and analysis of the purified DNA through qPCR. Together, these three assays allow for the careful validation of the specificity, potency, and mechanism of action of novel HATi.

Inhibitors of histone acetyltransferases (HATs, also known as lysine acetyltransferases), such as CBP/p300, are potential therapeutics for treating cancer. However, rigorous methods for validating these inhibitors are needed. Three in vitro methods for validation include HAT assays with recombinant acetyltransferases, immunoblotting for histone acetylation in cell culture, and ChIP-qPCR.

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

Lysine acetyltransferases (KATs) catalyze acetylation of lysine residues on histones and other proteins to regulate chromatin dynamics and gene ...

希少細胞におけるプロモーターインタラクトームの研究に対する包括的なアプローチ

An Integrated Workflow to Study the Promoter-Centric Spatio-Temporal Genome Architecture in Scarce Cell Populations

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity with their target gene promoters to control transcription. Although these regulatory elements are easy to identify, their target genes are difficult to predict, since most of them are cell-type specific and may be separated by hundreds of kilobases in the linear genome sequence, skipping over other non-target genes. For several years, Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) has been the gold standard for the association of distal regulatory elements to their target genes. However, PCHi-C relies on the availability of millions of cells, prohibiting the study of rare cell populations such as those commonly obtained from primary tissues. To overcome this limitation, low input Capture Hi-C (liCHi-C), a cost-effective and customizable method to identify the repertoire of distal regulatory elements controlling each gene of the genome, has been developed. liCHi-C relies on a similar experimental and computational framework as PCHi-C, but by employing minimal tube changes, modifying&#160;the reagent concentration and volumes, and swapping or eliminating steps, it accounts&#160;for minimal material loss during library construction. Collectively, liCHi-C enables the study of gene regulation and spatiotemporal genome organization in the context of developmental biology and cellular function.

著者スポットライト:希少な細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー  

Gene expression is regulated by interactions of gene promoters with distal regulatory elements. Here, we descirbe how low input Capture Hi-C (liCHi-C) allows the identification of these interactions in rare cell types, which were previously unmeasurable.

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

Spatiotemporal gene transcription is tightly regulated by distal regulatory elements, such as enhancers and silencers, which rely on physical proximity ...

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited from their latent state in the cytoplasm to cell surface receptors where they are activated by phosphorylation at a single tyrosine residue1. They then dimerize and translocate to the nucleus to drive the transcription of target genes, affecting growth, differentiation, homeostasis and the immune response. Not surprisingly, given their widespread involvement in normal cell processes, dysregulation of STAT function contributes to human disease, particularly to cancers2 and autoimmune diseases3. It is well established that transcription is regulated by alterations to the chromatin template4,5. These alterations include the activities of ATP-dependent complexes, as well as covalent histone modifications and DNA methylation6. Because STAT activation of gene expression is both rapid and transient, it requires specific mechanisms for modulating the chromatin template at STAT-dependent gene loci. To define these mechanisms, we characterize the histone modifications and the enzymatic activities that generate them at gene loci that respond to STAT signaling. This protocol describes chromatin immunoprecipitation, a method that is valuable for the study of STAT signaling to chromatin in activated gene expression.

Chromatin Immunoprecipitation ChIP to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

This protocol describes how chromatin immunoprecipitation (ChIP) is used to study the dynamic alterations to the chromatin template that regulate transcription induced by a signal transduction pathway.

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

In response to a variety of extracellular ligands, the STAT (signal transducer and activator of transcription) transcription factors are rapidly recruited ...

生物学

Genome-wide Analysis using ChIP to Identify Isoform-specific Gene Targets

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the protein domains that bind to specific histone modifications. One such domain is the plant homeodomain (PHD), found in several chromatin-binding proteins. The epigenetic factor RBP2 has multiple PHD domains, however, they have different functions (Figure 4). In particular, the C-terminal PHD domain, found in a RBP2 oncogenic fusion in human leukemia, binds to trimethylated lysine 4 in histone H3 (H3K4me3)1. The transcript corresponding to the RBP2 isoform containing the C-terminal PHD accumulates during differentiation of promonocytic, lymphoma-derived, U937 cells into monocytes2. Consistent with both sets of data, genome-wide analysis showed that in differentiated U937 cells, the RBP2 protein gets localized to genomic regions highly enriched for H3K4me33. Localization of RBP2 to its targets correlates with a decrease in H3K4me3 due to RBP2 histone demethylase activity and a decrease in transcriptional activity. In contrast, two other PHDs of RBP2 are unable to bind H3K4me3. Notably, the C-terminal domain PHD of RBP2 is absent in the smaller RBP2 isoform4. It is conceivable that the small isoform of RBP2, which lacks interaction with H3K4me3, differs from the larger isoform in genomic location. The difference in genomic location of RBP2 isoforms may account for the observed diversity in RBP2 function. Specifically, RBP2 is a critical player in cellular differentiation mediated by the retinoblastoma protein (pRB). Consistent with these data, previous genome-wide analysis, without distinction between isoforms, identified two distinct groups of RBP2 target genes: 1) genes bound by RBP2 in a manner that is independent of differentiation; 2) genes bound by RBP2 in a differentiation-dependent manner.
To identify differences in localization between the isoforms we performed genome-wide location analysis by ChIP-Seq. Using antibodies that detect both RBP2 isoforms we have located all RBP2 targets. Additionally we have antibodies that only bind large, and not small RBP2 isoform (Figure 4). After identifying the large isoform targets, one can then subtract them from all RBP2 targets to reveal the targets of small isoform. These data show the contribution of chromatin-interacting domain in protein recruitment to its binding sites in the genome.

Here we are presenting a chromatin immunoprecipitation (ChIP) procedure for genome-wide location analysis of protein isoforms that differ in a histone-binding domain. We are applying it to ChIP-Seq analysis to identify the targets of the KDM5A/JARID1A/RBP2 histone demethylase.

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

Recruitment of transcriptional and epigenetic factors to their targets is a key step in their regulation. Prominently featured in recruitment are the ...

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

要約

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マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

プロモーターキャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノムプロモーターの相互作用のプロファイリング

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

クロマチン免疫沈降法を用いたc-KITリガンドプロモーターの解析

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マウスT細胞株におけるクロマチン免疫沈降（ChIP）

転写因子の結合、細胞活性中に事象を表示する転写、翻訳、回転率のリアルタイム解析

プロモーター キャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノム プロモーターの相互作用のプロファイリング

慢性リンパ性白血病の新規 NFAT2 ターゲット遺伝子を識別するクロマチン免疫沈降法

ヒストンアセチルトランスビセラーゼ阻害剤の検証のためのアッセイ

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

希少細胞集団におけるプロモーター中心の時空間ゲノム構造を研究するための統合ワークフロー

ヒト細胞において活性化遺伝子発現のアッセイのダイナミックヒストン修飾のクロマチン免疫沈降（ChIP）

アイソフォーム特異的遺伝子標的を同定するためのチップを使用してゲノムワイド解析

プロモーターキャプチャこんにちは-c: 高解像度, ゲノムプロモーターの相互作用のプロファイリング