私たちは、JC1のためのR. Bartenschlager（ハイデルベルク大学）構築、のHuh7.5細胞用のCMライス（ロックフェラー大学）、J・マクローチラン（医学研究評議会ウイルス学ユニット）JFH1のための構築、T.脇田の（国立研究所に感謝しますHCVccレポーター構築物のための感染症、JFH1日本）、及びB・ウェブスターおよびワック・グリーン（ウイルス学および免疫学のグラッドストーン研究所）。この作業はDFG（HE 6889 / 2-1（EH）、INST 337 / 15-1 2013およびINST 337 / 16-1 2013（HS））からの資金によって支援されました。ハインリック・ペット研究所、実験ウイルス学のためのライプニッツ研究所は無料とハンブルクのハンザ同盟都市と健康の連邦省によってサポートされています。資金提供者は、研究デザイン、データの収集と分析、公表することを決定、または原稿の準備で何の役割を持っていました。

細胞培養物中のアミノ酸と安定同位体標識（SILAC）のためのメディアの調製注記：ここでは、SILACのタンパク質定量キット- 13 C 6 L-アルギニン塩酸をSILAC標識のために使用した50mgのを補充したDMEM。透析ウシ胎児血清（FCS）をSILACタンパク質定量キットを備えています。 <ol><li> DMEM培地の各ボトルから50ミリリットルを除去し、透析FCSを50mLを加えます。 </li><li> 13 C 6 L-リジン二塩酸及び13 C 6 L-アルギニン塩酸培地1mL中の50mgの50mgを溶解します。完全に混合し、DMEM + FCS培地にアミノ酸を追加します。 </li><li> 1×ペニシリン/ストレプトマイシン、および1×L-グルタミン代替を追加します。 0.45μmのフィルターを用いて培地を滅菌フィルター。 「重い」SILAC媒体としてのボトルにラベルを付けます。 </li><li> L-アルギニン塩酸50mgのとL-リジン二塩酸50mgを用いて1.3 - 「光」培地を調製するために、繰り返し1.1ステップ。 」などのボトルにラベルを付けます光」SILAC媒体。 </li></ol> 2. SILAC標識およびアミノ酸取り込みコントロール<ol><li>トリプシン処理細胞（1×トリプシン-EDTA）および「重」SILAC培地及び「光」を有するものでよく、培地2mlを含む6ウェル培養プレートの2つのウェルにいずれかを1×10 5のHuh7.5細胞を分割SILAC媒体。 </li><li>培養少なくとも6継代のために細胞（スプリット比：1：6）。 6回の継代後、「重い」は、アミノ酸の取り込みは95％以上であるべきです。 </li><li>収穫「重い」の1×10 6個の細胞-及び「光」標識細胞集団は、取り込み効率を分析します。 1×PBSで細胞を洗浄し、160×gで、4℃で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li> MS-バッファー（150mMのNaCl、1×プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した50mMトリス-HCl pH7.4、および1mM EDTA）の150μLに細胞ペレットを再懸濁し、氷上で30分間細胞をインキュベートします。溶解C4℃で超音波処理することによりells。 注：以下は、ここで使用する超音波処理の設定です：タイマー、ホールド。出力制御、8。デューティ・サイクル80％; 2×30パルス。 </li><li> 11,000×gで、4℃で10分間の遠心分離により細胞破片を除去します。上清を新しいチューブに移し、洗剤互換タンパク質アッセイを用いてタンパク質濃度を決定します。 </li><li> 95℃で沸騰し、6×試料緩衝液（375 mMトリス - 塩酸、pH6.8の25.8％グリセロール、123 mg / mlとSDS、600 / mlのブロモフェノールブルー、60μL/ mLのβメルカプトエタノール）を用いてタンパク質の75μgのを混ぜますC 5分間、約1時間バッファ180 Vで（3.02グラム/ Lトリス塩基、18.8グラム/ Lグリシン、および1g / L SDS）を実行し、または製造業者によればSDSでSDS-PAGEによってタンパク質を分離指示。 </li><li>コロイド状クーマシー染色溶液中にゲルを移します。各レーンから同じタンパク質バンドを切り出します。トリプシンでタンパク質を消化し、MS analysiで取り込み効果を分析S、22記載の方法。 </li></ol> SILAC標識のHuh7.5細胞の3脂質液滴分離<ol><li> 21記載されているように、37°Cで4時間ウイルスストック（ 例えば、JC1 NS5AB-mKO2-BSD、MOI 1）でインキュベートすることによって（ すなわち 、「光」は、アミノ酸で標識されたもの）HCVレポーターウイルスでの細胞の集団を感染。 注：JC1 NS5AB-mKO2-BSDは 21先に説明し、重複NS5A-NS5B切断部位との間のブラストサイジン耐性遺伝子（BSD）、続いて感染率を監視するための蛍光レポーター（モノマーKusabiraオレンジ2、mKO2）を担持するHCVウイルスです、 23。 HCVとの仕事はBSL2 +（USA）またはS3 **（ドイツ）バイオセーフティーレベルの封じ込めと実践が必要です。代わりにHCVの感染、細胞が異なる病原体に感染させることができます。 </li><li> HCVに感染した「光」細胞と非感染＆＃を展開34;重い」は、細胞培養物の継代時に、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）でアリコートを修正し21記載の蛍光マーカータンパク質（ 例えば、mKO2）のフローサイトメトリーによってHCV感染率を決定し、。 JC1 NS5AB-mKO2-BSDの HCV株を使用する場合、HCV陽性細胞を選択するために、「光」の媒体には10μg/ mLのブラストサイジンSを追加します。感染率は、NOTE脂肪滴の分離のための90％よりも高くなければなりません。 </li><li> 1 D脂質滴分離に先立って、PBS、トリプシン処理で細胞を洗浄し、「軽い」および「重い」培地中で再懸濁し、そしてノイバウアー計数チャンバーを用いて細胞を数えます。シード150cm 2の細胞培養皿中の各集団の7×10 6個の細胞。 「光」と「重い」細胞集団あたり少なくとも5つの料理を準備します。培地/皿O / Nの30ml中の細胞。 </li><li>培地を除去し、1×PBSで細胞を洗浄。 1Xで細胞を剥離細胞スクレーパーを用いてPBS。 </li><li>ノイバウアーカウントチャンバーを使用して、両方の細胞集団をカウントし、50mLの遠心分離管に等しい細胞数をプールします。 160×gで、4℃で5分間の遠心分離によって細胞をペレット化。 </li><li> PBSを除去し、スクロース緩衝液（0.25Mのスクロース、1mMのEDTA、および1mM DTT、プロテアーゼ阻害剤カクテルを補充した）1mLに細胞ペレットを再懸濁します。タイトフィットダウンスホモジナイザーに細胞懸濁液を移し、氷上で200ストロークで細胞を溶解。 注：トリパンブルー染色を使用して、完全な細胞溶解を確認してください。 </li><li> 1.5mLの微量遠心管に溶解物を移す1,000×gで、4℃で10分間、核および細胞破片をスピンダウン。 </li><li>遠心分離後、入力制御として-20℃でポスト核フラクションの25μL（PNS）のアリコートを格納します。 </li><li> 4mLのTOT;脂質滴の洗浄緩衝液（〜3 mLの遠心チューブ（11×60 mm）での底およびオーバーレイにPNS画分の残りを置きAL）（50 mMリン酸カリウム緩衝液（pH7.4）、100mMの塩化カリウム、1mMのEDTA、および1mMフェニルメタンスルホニルフルオリド）。 </li><li> 10万XGと4℃で2時間遠心します。 （ - 脂肪滴の量に応じて500μL、約250）管の上部から屈曲、鈍いカニューレを用いてフローティング脂肪滴画分を回収。遠心チューブ（11×60 mm）の中の脂質滴画分を置き、脂肪滴の洗浄緩衝液（〜3.5 mLを、4mLの合計）とのオーバーレイ、および遠心分離工程を繰り返します。 </li><li>チューブの上部から屈曲、鈍いカニューレを用いてフローティング脂肪滴画分を回収し、新しい1.5mLの微量遠心管に脂肪滴を転送します。 21,000×gで、4℃で20分間の脂肪滴の洗浄バッファーとスピンの500μLを追加します。 注：脂肪滴は、バッファの先頭に浮かぶ白いバンドとして表示されます。 </li><li>ゲルローディングピペットチップを使用して、下にある洗浄緩衝液を除去し、この洗浄工程を3回繰り返します。 </li><li>ゲルローディングピペットチップを使用して洗浄緩衝液の最終除去した後、NP-40溶解緩衝液（50mMトリス-HCl pH7.4、150mMのNaCl、1％NP-40の10μLと脂肪滴画分の5μLを混合、）プロテアーゼ阻害剤カクテルを補いました。感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。洗剤互換タンパク質アッセイとタンパク質レベルを決定します。タンパク質の少なくとも35μgのは、MS分析のために必要とされています。 </li><li> -20℃で脂肪滴の画分を保管してください。 </li><li> 4×ローディング色素と脂質滴画分の対応するボリュームを混ぜます。感染性物質を扱う場合には、ウイルスを不活性化するために氷上で1時間インキュベートします。 95℃で5分間沸騰させます。 </li><li>メーカーのプロトコルに従って、SDS-PAGEを使用してタンパク質を分離。コロイド状クーマシー染色溶液中にゲルを移します。ゲルからのすべてのタンパク質バンドを切り出します。トリプシン後のゲル内消化24 &lt;/ SUP&gt;、サンプルを蒸発させ、0.1％ギ酸でそれらを溶解します。 LC-MS / MSによって分析します。 注：ここで、LC-MS / MS分析四重極飛行時間型質量分析計（Q-TOF）または線形トラップ四重極（LTQ）オービトラップ質量分析計で行いました。両方の機器は、ナノUPLCシステムへESIソースに結合されました。データ分析およびLC-MS / MSは、21、22に記載のように行ったQ-TOF上及びオービトラップ質量分析計で分析します。人間のケラチンでサンプルを汚染しないように細心の注意を払います。常にケラチンフリーピペットチップやチューブを使用しています。ケラチンのない化学物質と層流フードの下でバッファを準備します。使用方法の前に、蒸留水とエタノールとのすべての表面とデバイスを清掃してください。常に手袋と白衣を着用してください。 </li></ol>脂質液滴純度の4分析<ol><li>脂肪滴画分1のアリコートを希釈：2と入力画分をNP-40のLysで1:10（ステップ3.9参照）バッファです。感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。洗剤互換タンパク質アッセイとタンパク質レベルを決定します。 </li><li> 6×サンプルバッファーでタンパク質の等量を混合し、感染性物質を扱う場合、ウイルスを不活性化するために1時間氷上でサンプルをインキュベートします。 SDS-PAGEを続行し、90分間80 Vでタンクブロッティングによってニトロセルロース膜にタンパク質を移します。 注：（TBS-T（10mMのトリス-HCl pH7.6の、150mMのNaCl、および0.05％のTween20）中の5％脱脂粉乳粉末）をブロッキング緩衝液中で膜をブロッキングした後、脂肪滴のマーカーに対する抗体と共にインキュベートする（ 例えば、PLIN1、PLIN2、又はPLIN3）および二次HRP結合抗体によって、続いて他の細胞内区画（ 例えば、CALR、のMnSOD、またはチューブリン）のマーカー。タンパク質の検出のための化学発光を使用してください。 </li></ol>

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著者は、開示することは何もありません。

ここで、我々は、ウイルス感染のような多様な培養条件下で脂質滴、に関連するタンパク質の濃縮および枯渇を比較するために、定量的脂質滴プロテオーム解析のための脂質滴を分離するためのプロトコルを記述しています。別の方法として、プロテオーム解析は、全ピーク強度に基づくラベルフリー定量化を行うことができます。この方法には、ダイナミックレンジの制限がなく、代謝の?...

<html>脂肪滴は、埋め込まれたタンパク質1、リン脂質の単層によって囲まれた中性脂質（トリグリセリド（TG）とコレステロールエステル（CE））のコアからなる細胞小器官高度に動的な細胞質（および核）です。すべての細胞型は、脂肪滴を生成し、彼らはサイズ、脂質組成、およびタンパク質の装飾が異なります。脂質滴はエネルギーおよび膜前駆体リザーバとして、またはタンパク質沈着物として含む、多様な機能を果たします。また、脂質の摂取を介して、それらは脂肪毒性から細胞を保護し、放出脂質シグナル伝達分子として、およびタンパク質分解および小胞体に関与している（ER）ストレス応答2。そのため、タンパク質のホストは、脂肪滴に結合し、他の細胞小器官で自分の世代、劣化、人身売買、との相互作用を支配します。このうち（PLIN1-5） 善意の脂肪滴結合タンパク質のファミリーであるペリリピンF &quot;&gt; 3。 脂肪滴の生合成は、おそらくER常駐酵素は、中性脂質のレンズ、最近酵母4にうまく視覚化されたプロセスを形成し、膜二重層内に蓄積中性脂質の合成を触媒するERで開始します。曲げ膜と上昇ホスファチジン酸およびジアシルグリセロールレベルは、その後、脂肪滴生成5のために必要とされるコア中性脂質および遮蔽リン脂質の同時合成として、リン脂質生合成に関与するタンパク質を誘引すると考えられています。 ERに存在する膜貫通ドメインを保有する酵素は、このプロセスを触媒します。大きな脂肪滴への拡張は、両親媒性ヘリックスを抱い脂質合成酵素の異なるクラスの活動を必要とし、これ脂肪滴にERから移動することができます。脂質小滴からの脂質の動員はtriglyceridの局所活性化を介して起こりますEおよびジアシルグリセロールリパーゼは、脂肪トリグリセリドリパーゼ（ATGL）及びホルモン感受性リパーゼ（HSL）、またはそのようなマクロやmicrolipophagy又は異なるオートファジー経路では、オートファジー6を媒介シャペロン。脂肪滴は、（β酸化および脂質合成のための）、ミトコンドリアおよびERのような他の細胞小器官、（脂質合成及びタンパク質輸送のため）だけでなく、リソソーム、エンドソーム、および細胞内細菌7によって誘導された小胞と相互作用します。確かに細菌、ウイルス、およびさえ寄生虫は複製と持続性のための脂肪滴、それらの間のHCV 8をターゲットにしています。 HCV感染は、毎年9あたり0.5程度万人が死亡を占め、世界的に肝臓に関連する罹患率および死亡率の主要な原因の1つです。 HCV感染の真の数は不明であるが、最近の推定値は130することを示唆している - 1.5億人が慢性的に感染しています。ませんvaccineが存在するが、最近承認された直動抗ウイルス薬は劇的標準のインターフェロンベースの治療に比べて治療応答を高めます。しかし、世界的に、患者の治療は可能性が高いため、新しい治療法の非常に高いコストに制限されます。慢性的にHCVに感染したすべての個人の約半数は、脂肪肝疾患（脂肪症）、肝細胞における脂肪滴の過剰な​​蓄積によって特徴付けられる状態を開発します。興味深いことに、脂肪滴も推定されるウイルスアセンブリサイト10、11として、HCV複製のためなどの重要な細胞小器官を浮上しました。 HCV感染細胞では、ウイルスタンパク質のコアおよびNS5Aはジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ1（DGAT1）の阻害剤として、トリグリセリドの生合成に依存するプロセスにおける脂肪滴に局在する脂肪滴と後続のHCV粒子の産生12へ輸送を損ないます</sup&gt;、13、14、15。また、コアまたはNS5Aのいずれかの脂質小滴結合ドメインにおける変異は、HCVアセンブリ16,17を抑制する。コアおよびNS5Aは次に密接脂質滴16に関連付けられた膜に、他の全てのウイルスタンパク質、ならびにウイルスRNA複製複合体を動員します。すべてのウイルスタンパク質の協調行動は、感染性ウイルスの子孫10、11の成功の生産のために必要とされます。構造タンパク質はウイルス粒子の一部であり、そして非構造タンパク質は、このプロセスに必要なタンパク質 - タンパク質相互作用を促進します。興味深いことに、 真正脂肪滴結合タンパク質PLIN3 / TIP47は、HCV RNA複製およびビリオン18の放出の両方のために必要とされる、19 <suP&gt;、20。これらの最近の進歩にもかかわらず、特にHCV複製の後期段階中のウイルス - 宿主相互作用のメカニズムの詳細については、不明確なままであり、脂肪滴の正確な機能は不明です。 ここで、我々は、関連するタンパク質の定量的質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。この方法を使用して、我々は、HCV感染の間の脂肪滴のプロテオームにおける大きな変化を発見し、脂肪滴で分画さを共同で効率的なHCVの成熟21のために必要とされる宿主タンパク質としてアネキシンA3を特定しました。

<table><tbody><tr><td>SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>89983&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; L-Arginine-HCl 50&amp;nbsp;mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>88210</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1</td><td>Roth GmbH</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Blue 5x Concentrate</td><td>Roth GmbH</td><td>A152.2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS-Tris-Glycine - Buffer</td><td>Geyer Th. GmbH &amp;amp; Co.KG&amp;nbsp;</td><td>A1415,0250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Life Technologies GmbH&amp;nbsp;</td><td>350500038&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P4333-100ml&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x Dulbecco&#039;s Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>T3924-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1149,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultrapure&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1086,5000A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1103,0250</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P8340-5ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Sucrose &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3935,1000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0625</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&amp;nbsp;</td><td>500-0116&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem GmbH</td><td>151339</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4338</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invivogen</td><td>ant-bl-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1039</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl Fluoride&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>221309</td><td></td></tr><tr><td>Dipotassium Hydrogenphosphate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P3786&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem</td><td>A1694</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>Nonfat dried milk powder</td><td>AppliChem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ADFP/ ADRP&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab52355</td><td></td></tr><tr><td>M6PRB1/TIP47 100 &amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>ab47639</td><td></td></tr><tr><td>Calreticulin, pAb 200 &amp;micro;g</td><td>Enzo Life Science GmbH&amp;nbsp;</td><td>ADI-SPA-600-F&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>T6074 200&amp;micro;l &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute (EtOH)</td><td>Geyer Th. GmbH &amp;amp; Co.KG&amp;nbsp;</td><td>A3678,0250 &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MnSOD</td><td>Enzo Life Science GmbH&amp;nbsp;</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse HRP</td><td>Thermo Fisher Pierce</td><td>32430</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit HRP</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp; Pierce</td><td>32460</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906836</td><td></td></tr><tr><td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>12015196001</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>655 180&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Syringe 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>83.1823.100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&amp;nbsp;</td><td>456-9034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>657160&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dishes Nunclon 150/20&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>10098720 - 168381&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>neoLab Migge GmbH&amp;nbsp;</td><td>C-8120&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tube, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>227261&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Tube RNase-free&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>72.706.400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>344062&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suction Needles</td><td>Transcodent</td><td>6482</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 1000&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.762.211&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 200</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.760.211&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 10</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.1130.210&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>11883722</td><td></td></tr><tr><td>Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>10389444</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5355&amp;nbsp;000.127</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>165-8033</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber</td><td>BioRad</td><td>165-4110</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Biorad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>365670</td><td></td></tr><tr><td>SW 60 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M1000 PRO</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis

脂肪滴は、ビリオンの形態形成の推定場所として、さまざまな病原体の様々な、最も顕著にC型肝炎ウイルス（HCV）の複製に不可欠です。定量的脂肪滴のプロテオーム解析は、にローカライズや、ウイルス感染などの条件の下での脂肪滴からずれているタンパク質を同定するために使用することができます。ここでは、我々が正常にHCV感染後脂肪滴プロテオームの変化を特徴づけるために使用されているプロトコルを記述します。私たちは、細胞培養（SILAC）中のアミノ酸と安定同位体標識化を使用するので、質量分析により、タンパク質を定量するために「重い」アミノ酸と細胞の1人の人口の完全なプロテオームにラベルを付けます。脂肪滴の単離のために、2つの細胞集団（ すなわち、HCVに感染/「光」は、アミノ酸及び非感染コントロール/「重」アミノ酸）1に混合される：1と低張性緩衝液中で機械的に溶解しました。核とセルDを除去した後低速遠心分離によってebrisは、脂肪滴関連タンパク質は、等張緩衝液で3回の洗浄工程に続いて二つの連続超遠心分離工程により濃縮されます。脂肪滴画分の純度は、異なる細胞内コンパートメントを認識する抗体を用いたウエスタンブロッティングにより分析されます。脂肪滴関連タンパク質は、次いでクマシー染色に続いてSDSポリアクリルアミドゲル電気泳動（SDS-PAGE）によって分離されています。トリプシン消化後、ペプチドを、液体クロマトグラフィー - エレクトロスプレーイオン化 - タンデム質量分析（LC-ESI-MS / MS）により定量化されます。この方法を使用して、我々はプロまたは抗ウイルスの宿主因子を表すことができ、HCV感染の際に脂肪滴に動員するタンパク質を同定しました。私たちの方法は、このような病原体による感染症、環境ストレス、または薬物治療として、異なる細胞および培養条件の多様に適用することができます。

脂肪滴は、ビリオンアセンブリの推定上のサイトとして、HCV感染に不可欠であるが、ビリオンの形態形成および出口の分子メカニズムは不明な点が多いです。そのプロセスに関与する新規ホスト依存因子を同定するために、我々は、HCV感染細胞21（ 図1A）の定量的な脂質滴プロテオーム解析を行いました。我々は、脂質滴を精製するため...

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Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

lipid-droplet-isolation-for-quantitative-mass-spectrometry-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K ビュー.  Leibniz Institute for Experimental Virology. 脂肪滴は、C型肝炎ウイルス（HCV）を含むいくつかの病原体の複製のための重要な器官です。我々は、関連するタンパク質の定量的な質量分析のための脂質滴を単離する方法を記載します。そのようなウイルス感染、環境ストレス、または薬物治療などの条件の様々な環境下で使用することができます。 

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Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

グラム陰性菌からの単離とリピドAの化学特性評価

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

化学

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

ターゲット安定同位体希釈液体クロマトグラフィー - 質量分析のための細胞の脂質の抽出

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

生物工学

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

細胞の脂質滴の分離：酵母細胞とヒト胎盤から2精製技術

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the majority of exogenous fatty acids are present within host lipoprotein particles. Uncertainty remains as to the reservoirs of host fatty acids and the mechanisms by which bacteria extract fatty acids from the lipoprotein particles. In this work, we describe protocols for enrichment of low-density lipoprotein (LDL) particles from chicken egg yolk and determining whether LDLs serve as fatty acid reservoirs for S. aureus. This method exploits unbiased lipidomic analysis and chicken LDLs, an effective and economical model for the exploration of interactions between LDLs and bacteria. The analysis of S. aureus integration of exogenous fatty acids from LDLs is performed using high-resolution/accurate mass spectrometry and tandem mass spectrometry, enabling the characterization of the fatty acid composition of the bacterial membrane and unbiased identification of novel combinations of fatty acids that arise in bacterial membrane lipids upon exposure to LDLs. These advanced mass spectrometry techniques offer an unparalleled perspective of fatty acid incorporation by revealing the specific exogenous fatty acids incorporated into the phospholipids. The methods outlined here are adaptable to the study of other bacterial pathogens and alternative sources of complex fatty acids.

This method provides a framework for studying incorporation of exogenous fatty acids from complex host sources into bacterial membranes, particularly Staphylococcus aureus. To achieve this, protocols for the enrichment of lipoprotein particles from chicken egg yolk and subsequent fatty acid profiling of bacterial phospholipids utilizing mass spectrometry are described.

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

生化学

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

エレクトロスプレーイオン化質量分析法を用いて酵母Lipidomeの定量評価

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

生物学

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have made lipidomics a powerful analytical tool for monitoring tissue lipidome compositions in homeostatic as well as disease states. This paper presents a step-by-step protocol for a shotgun lipid analysis method that supports the simultaneous detection and quantification of a few hundred molecular lipid species in different tissue and biofluid samples at high throughput. This method leverages automated nano-flow direct injection of a total lipid extract spiked with labeled internal standards without chromatographic separation into a high-resolution mass spectrometry instrument. Starting from sub-microgram amounts of rodent tissue, the MS analysis takes 10 min per sample and covers up to 400 lipids from 14 lipid classes in mouse lung tissue. The method presented here is well suited for studying disease mechanisms and identifying and quantifying biomarkers that indicate early toxicity or beneficial effects within rodent tissues.

Shotgun mass spectrometry-based lipidomics delivers a sensitive quantitative snapshot of a broad spectrum of lipid classes simultaneously in a single measurement from various rodent tissues.

げっ歯類組織のショットガンリピドミクス

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

安定同位体標識を用いた脂質構造のスクリーニング

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

著者スポットライト:安定同位体標識を用いた複雑なリピドームサンプルの定量(英語)

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

定量的質量分析のための脂肪滴の分離

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安定同位体標識 LC-TIMS-TOF MS/MS を用いた de novo 脂質の追跡

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