우리의 JFH1 구성, T. 와키 타 (국립 연구소의 JC1 구조에 대한 R. 문헌 [Bartenschlager (하이델베르크 대학)의 Huh7.5 세포에 대한 CM 라이스 (록펠러 대학교), J 맥로치랜 (의학 연구위원회 (Medical Research Council) 바이러스학 단위) 감사합니다 HCVcc 리포터 작 제물에 대한 감염증의 JFH1 일본) 및 B. 웹스터 WC 및 그린 (바이러스학 글래드스턴 연구소 면역학). 이 작업은 DFG 자금 지원 하였다 (HE 6889 / 2-1 (EH), 337 / 15-1 2,013 INST 및 이달 337 / 16-1 2,013 (HS)). 하인리히 Pette 연구소, 실험 바이러스학에 대한 라이프니츠 연구소는 자유와 한자 동맹의 도시인 함부르크와 건강의 연방 교육부에 의해 지원됩니다. 자금 제공자는 연구 설계, 자료 수집 및 분석, 게시하는 결정, 또는 원고의 준비를 전혀 역할을 없었다.

세포 배양에서 아미노산으로 안정 동위 원소 표지 (SILAC) 용 매체 1의 제조 주 : 여기에서, SILAC 단백질 정량 키트 - DMEM이 SILAC 표지에 사용 된 13 C 6 아르기닌 L 염산 50 mg의 보충. 투석 된 소 태아 혈청 (FCS)을 SILAC 단백질 정량 키트가 제공된다. <ol><li> DMEM 배지에서 각각 50 ㎖ 병을 제거하고 투석 된 FCS 50 mL를 첨가. </li><li> 13 C 6 L 라이신 2HCl 50 mg의 배지 1 ㎖의 13 C 6 L 염산 아르기닌 50mg을 녹인다. 철저하게 혼합하고, DMEM + FCS 매체에 아미노산을 추가합니다. </li><li> 1X 펜 / 연쇄상 구균 및 1X L 글루타민 대체를 추가합니다. 멸균 필터 0.45 μm의 필터를 사용하여 기록 매체. &quot;무거운&quot;SILAC 매체로 병 레이블. </li><li> L- 아르기닌 염산 50 mg의 L- 라이신 2HCl-50를 사용하여 1.3 mg의 -은 &quot;광&quot;배지를 제조하기 위해 반복 단계 1.1. &quot;같은 병 레이블광 &quot;SILAC 매체. </li></ol> 2. SILAC 라벨링 및 아미노산 설립 제어 <ol><li> 를 Trypsinize 세포 (1X 트립신 EDTA) 및 스플릿 1 × 배지 2 ㎖, 웰은 &quot;무거운&quot;SILAC 배지 하나는 &quot;광&quot;하나를 포함하는 6 웰 배양 접시에 2 웰에 5 개 Huh7.5 세포 SILAC 매체. </li><li> 문화 적어도 6 통로 용 셀 (분할 비 : 1 : 6); 6 개 통로 후 &quot;무거운&quot;아미노산의 혼입이 95 % 이상이어야한다. </li><li> 수확은 &quot;무거운&quot;1 × 106 세포 - 및 &quot;라이트&quot;라벨이 지정된 세포군 혼입 효능을 분석한다. 1X PBS에서 세포를 세척하고 160 XG에서 5 분, 4 ° C 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> MS 완충액 (150 mM의 염화나트륨, 1X 프로테아제 억제제 칵테일로 보충 된 50 mM 트리스 -HCl pH 7.4, 1 mM의 EDTA)을 150 μL의 세포 펠렛을 재현 탁하고, 30 분간 얼음에 세포를 배양한다. 를 Lyse는 C4 ℃에서 초음파 처리하여 학습 학생. 참고 : 다음 여기에 사용되는 초음파의 설정은 다음과 같습니다 타이머 개최; 출력 제어부, 8; 듀티 사이클이 80 %; 2 X 30 펄스. </li><li> 11,000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리에 의해 세포 파편을 제거한다. 새로운 튜브로 상청액을 옮기고 세제 호환 단백질 분석하여 단백질 농도를 결정한다. </li><li> 95 °에서 6X 샘플 완충액 (375 mM 트리스 - 염산, pH가 6.8, 25.8 % 글리세롤, 123 ㎎ / ㎖ SDS, 청색 600 ㎍ / ㎖의 브로 모 페놀 60 μL / ㎖ β 머 캅토 에탄올), 종기 단백질 75 μg의 믹스 C 5 분, 약 1 시간 동안 완충액 180 V에서 (3.02 g / L 트리스 염기, 18.8 g / L 글리신, 1 g / L SDS)를 실행하거나 제조에 따른 SDS에서 SDS-PAGE에 의해 단백질을 분리 &#39;지시. </li><li> 콜로이드 쿠마시 염색 액으로 겔을 전송. 각 레인에서 같은 단백질 밴드를 절제. 트립신 단백질을 소화하고 MS의 analysi 의해 혼입 효능을 분석S는, 22로 설명했다. </li></ol> SILAC 표지 Huh7.5 세포의 3. 지질 방울 절연 <ol><li> 셀들 중 하나 개 집단 감염 (즉, &quot;빛&quot;아미노산으로 표시된 것) (즉, JC1 NS5AB-mKO2-BSD가 MOI 1) 37 ℃에서 4 시간 동안 21 바와 같이 바이러스 축적량 배양하여 HCV 리포터 바이러스 . 참고 : JC1 NS5AB-mKO2-BSD (21) 이전에 설명, 중복 NS5A-NS5B 분열 사이트 간의 블라스트 저항 유전자 (BSD) 다음 감염률을 모니터링하는 형광 기자 (단량체 Kusabira 오렌지 2, mKO2)를 나르는 HCV 바이러스입니다, (23). HCV과 협력 BSL2 + (USA) 또는 S3 ** (독일) 바이오 안전성 수준 봉쇄과 실천이 필요합니다. 대신 HCV 감염의 세포가 다른 병원균에 감염 될 수있다. </li><li> HCV에 감염된 &quot;빛&quot;세포와 비감염 &amp; #를 확장34]. 무거운 &quot;세포 배양액의 계대 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 분취 량을 수정하고 21 바와 같이, 형광 마커 단백질의 유동 세포 계측법 (예 mKO2)하여 HCV 감염 비율을 결정하며 . JC1 NS5AB-mKO2-BSD의 HCV 균주를 사용하는 경우, HCV 양성 세포에 대해 선택하는 &quot;광&quot;배지에 10 ㎍ / ㎖의에 블라스트의 S를 추가 감염률 지질 방울 분리 주 대 90 % 이상이어야한다. </li><li> 지질 액적 분리에 앞서 1 개 (D)은 PBS,를 Trypsinize &quot;가벼운&quot;및 &quot;무거운&quot;배지에 재현 탁하여 세포를 세척하고, 노이 바 우어 카운팅 챔버를 이용하여 세포 수를 계산. 시드 150 cm2로 세포 배양 접시에 각각의 인구의 7 × 106 세포. &quot;빛&quot;과 &quot;무거운&quot;세포 인구 당 적어도 5 개 요리를 준비합니다. 배양액 / 접시 O / N 30 ㎖의 세포. </li><li> 매체를 제거하고 1X PBS로 세포를 씻어. 1 배에서 세포를 분리PBS는 셀 스크레이퍼를 사용하여. </li><li> 노이 바 우어 카운팅 챔버를 이용하여 두 세포 집단을 카운트하고, 50 mL의 원심 분리 튜브에 동일 셀 번호 풀. 160 XG에서 5 분, 4 ° C 원심 분리하여 세포 펠렛. </li><li> PBS를 제거하고 슈 크로스 완충액 (0.25 M 수 크로스, 1 mM의 EDTA, 1mM의 DTT 및 프로테아제 억제제 칵테일 보충)의 1 mL의 세포 펠렛을 재현 탁. 꽉 끼는 다운스 균질화하여 세포 현탁액을 옮기고 얼음 200 스트로크 용균. 참고 : 트리 판 블루 염색법을 사용하여 완전한 세포 용해를 확인합니다. </li><li> 1.5 mL의 미세 원심 분리 튜브에 이동 해물 1000 XG, 4 ℃에서 10 분 동안 핵 및 세포 파편을 스핀. </li><li> 원심 분리 후, 입력 제어 -20 ℃에서 이후 핵 분획을 25 μL (PNS)의 분취 량을 저장한다. </li><li> 3 mL의 원심 분리 튜브 (11 X 60mm)의 하단에있는 PNS 분획의 나머지를 올려 놓고 ~ 지질 방울 세척 완충액 (오버레이와 4 ML의 TOT를AL) (50mM의 인산 칼륨 완충액 pH 7.4, 100 mM의 염화칼륨, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 페닐 메탄 설 포닐 플루오 라이드). </li><li> 100,000 XG에 2 시간, 4 ° C에 대한 원심 분리기. (- 지질 방울의 양에 따라 500 μL, 250)는 튜브의 상부로부터 절곡 무딘 캐뉼라를 사용하여 부동 지질 방울 분획 수확. 원심 분리 튜브 (11 X 60mm)의 지질 방울 분획 배치 지질 방울 세척 완충액 (~ 3.5 ㎖; 4 ㎖의 합계)를 오버레이하고, 원심 분리 단계를 반복한다. </li><li> 튜브의 상부로부터 절곡 무딘 캐뉼라를 사용하여 부동 지질 방울 분획을 수확하여 새로운 1.5ml의 미세 원심 분리 튜브에 지질 방울 옮긴다. 21,000 XG, 4 ℃에서 20 분 동안 지질 방울 세척 완충액 스핀 500 μL를 추가한다. 참고 : 지질 방울 버퍼의 상단에 떠있는 흰색 밴드로 나타납니다. </li><li> 겔 로딩 피펫 팁을 사용하는 직하 세척 완충액을 제거하고,이 세정 공정을 세 번 반복한다. </li><li>겔 로딩 피펫 팁을 사용하여 세척 완충액의 최종 제거한 후, NP-40 용해 완충액 10 μL (50 mM 트리스 -HCl, pH 7.4, 150 mM의 염화나트륨, 1 % NP-40 5 μL 지질 방울 분획 믹스 ) 프로테아제 억제제 칵테일 보충. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. 세제 호환 단백질 분석으로 단백질 수준을 결정하고; 단백질의 적어도 35 μg의 MS 분석은 필요하다. </li><li> -20 ° C에서 지질 방울 분수를 저장합니다. </li><li> 4X 로딩 염료와 지질 방울 분획의 해당 볼륨을 섞는다. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 품어. 5 분 동안 95 ° C에서 끓인다. </li><li> 제조업체의 프로토콜에 따라 SDS-PAGE를 이용하여 단백질을 분리한다. 콜로이드 쿠마시 염색 액으로 겔을 전송. 겔로부터 모든 단백질 밴드를 절제. 트립신의 겔 소화 24 &lt;후/ SUP&gt; 시료를 증발시켜 0.1 % 포름산 그들을 용해. LC-MS / MS로 분석한다. 주 : 여기에서, LC-MS / MS는 극자 비행 시간 형 질량 분석계 (Q-TOF) 또는 선형 트랩 사중 극자 (LTQ) orbitrap 질량 분광기 분석을 수행 하였다. 두 장비는 나노 UPLC 시스템에 ESI 소스와 결합되었다. 데이터 분석 LC-MS / MS (21), (22)을 기술 된 바와 같이 수행 된 Q-TOF에 orbitrap과 질량 분석기에서 분석한다. 인간의 각질과 함께 샘플을 오염하지 않도록 상당한주의를 기울입니다. 항상 각질없는 피펫 팁 및 튜브를 사용합니다. 각질없는 화학 물질 층류 후드 버퍼를 준비합니다. 사용하기 전에 증류수와 에탄올 모든 표면 및 장치를 청소합니다. 항상 장갑과 실험실 코트를 착용하십시오. </li></ol> 지질 방울 순도 4. 분석 <ol><li> 지질 방울 분획 1 씩 희석 : 2 입력 분획 NP-40과 1시 10분리스 (단계 3.9 참조)버퍼이다. 전염성 물질로 작업하면 바이러스를 불 활성화하기 위해 1 시간 동안 얼음에 샘플을 품어. 세제 호환 단백질 분석과 단백질 수준을 결정합니다. </li><li> 6X 샘플 완충액으로 단백질의 동일한 양을 혼합하고 감염성 물질로 작업하는 경우, 바이러스를 비활성화하는 얼음상에서 1 시간 동안 샘플을 배양한다. SDS-PAGE로 진행하고 90 분 동안 80 V에서 탱크 블 롯팅에 의해 니트로 셀룰로오스 막에 단백질을 옮긴다. 주 : 완충액 (TBS-T (10 mM 트리스 - 염산 pH를 7.6, 150 mM의 염화나트륨, 0.05 % 트윈 -20) 중 5 % 무 지방 건조 우유 분말) 블로킹 막을 차단 한 후, (지질 방울 마커에 대한 항체와 함께 배양 예 , PLIN1, PLIN2 또는 PLIN3)와 다른 세포 내 구획 (마커의 예 이차 HRP 결합 항체이어서 CALR, MnSOD 또는 튜 불린). 단백질의 검출을위한 화학 발광을 사용합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>Thiam, A. R., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+biophysics+and+cell+biology+of+lipid+droplets.">The biophysics and cell biology of lipid droplets.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (12), 775-786 (2013).</li><li>Welte, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanding+roles+for+lipid+droplets.">Expanding roles for lipid droplets.</a> Curr Biol. 25 (11), R470-R481 (2015).</li><li>Brasaemle, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thematic+review+series:+adipocyte+biology.+The+perilipin+family+of+structural+lipid+droplet+proteins:+stabilization+of+lipid+droplets+and+control+of+lipolysis.">Thematic review series: adipocyte biology. The perilipin family of structural lipid droplet proteins: stabilization of lipid droplets and control of lipolysis.</a> J Lipid Res. 48 (12), 2547-2559 (2007).</li><li>Choudhary, V., Ojha, N., Golden, A., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+conserved+family+of+proteins+facilitates+nascent+lipid+droplet+budding+from+the+ER.">A conserved family of proteins facilitates nascent lipid droplet budding from the ER.</a> J Cell Biol. 211 (2), 261-271 (2015).</li><li>Kory, N., Farese, R. V., Walther, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+Fat:+Mechanisms+of+Protein+Localization+to+Lipid+Droplets.">Targeting Fat: Mechanisms of Protein Localization to Lipid Droplets.</a> Trends Cell Biol. 26 (7), 535-546 (2016).</li><li>Hashemi, H. F., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+life+cycle+of+lipid+droplets.">The life cycle of lipid droplets.</a> Curr Opin Cell Biol. 33, 119-124 (2015).</li><li>Gao, Q., Goodman, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet-a+well-connected+organelle.">The lipid droplet-a well-connected organelle.</a> Front Cell Dev Biol. 3, 49 (2015).</li><li>Herker, E., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+role+of+lipid+droplets+in+host/pathogen+interactions.">Emerging role of lipid droplets in host/pathogen interactions.</a> J Biol Chem. 287 (4), 2280-2287 (2012).</li><li>Wedemeyer, H., Dore, G. J., Ward, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimates+on+HCV+disease+burden+worldwide+-+filling+the+gaps.">Estimates on HCV disease burden worldwide - filling the gaps.</a> J Viral Hepat. 22 Suppl 1, 1-5 (2015).</li><li>Paul, D., Madan, V., Bartenschlager, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+RNA+replication+and+assembly:+living+on+the+fat+of+the+land.">Hepatitis C virus RNA replication and assembly: living on the fat of the land.</a> Cell Host Microbe. 16 (5), 569-579 (2014).</li><li>Lindenbach, B. D., Rice, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ins+and+outs+of+hepatitis+C+virus+entry+and+assembly.">The ins and outs of hepatitis C virus entry and assembly.</a> Nat Rev Microbiol. 11 (10), 688-700 (2013).</li><li>Barba, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+core+protein+shows+a+cytoplasmic+localization+and+associates+to+cellular+lipid+storage+droplets.">Hepatitis C virus core protein shows a cytoplasmic localization and associates to cellular lipid storage droplets.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 94 (4), 1200-1205 (1997).</li><li>Shi, S. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hepatitis+C+virus+NS5A+colocalizes+with+the+core+protein+on+lipid+droplets+and+interacts+with+apolipoproteins.">Hepatitis C virus NS5A colocalizes with the core protein on lipid droplets and interacts with apolipoproteins.</a> Virology. 292 (2), 198-210 (2002).</li><li>Herker, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+hepatitis+C+virus+particle+formation+requires+diacylglycerol+acyltransferase-1.">Efficient hepatitis C virus particle formation requires diacylglycerol acyltransferase-1.</a> Nat Med. 16 (11), 1295-1298 (2010).</li><li>Camus, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diacylglycerol+acyltransferase-1+localizes+hepatitis+C+virus+NS5A+protein+to+lipid+droplets+and+enhances+NS5A+interaction+with+the+viral+capsid+core.">Diacylglycerol acyltransferase-1 localizes hepatitis C virus NS5A protein to lipid droplets and enhances NS5A interaction with the viral capsid core.</a> J Biol Chem. 288 (14), 9915-9923 (2013).</li><li>Miyanari, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lipid+droplet+is+an+important+organelle+for+hepatitis+C+virus+production.">The lipid droplet is an important organelle for hepatitis C virus production.</a> Nat Cell Biol. 9 (9), 1089-1097 (2007).</li><li>Boulant, S., Targett-Adams, P., McLauchlan, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Disrupting+the+association+of+hepatitis+C+virus+core+protein+with+lipid+droplets+correlates+with+a+loss+in+production+of+infectious+virus.">Disrupting the association of hepatitis C virus core protein with lipid droplets correlates with a loss in production of infectious virus.</a> J Gen Virol. 88 (Pt 8), 2204-2213 (2007).</li><li>Vogt, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid+droplet-binding+protein+TIP47+regulates+hepatitis+C+Virus+RNA+replication+through+interaction+with+the+viral+NS5A+protein.">Lipid droplet-binding protein TIP47 regulates hepatitis C Virus RNA replication through interaction with the viral NS5A protein.</a> PLoS Pathog. 9 (4), e1003302 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+plays+a+crucial+role+in+the+life+cycle+of+hepatitis+C+virus.">TIP47 plays a crucial role in the life cycle of hepatitis C virus.</a> J Hepatol. 58 (6), 1081-1088 (2013).</li><li>Ploen, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TIP47+is+associated+with+the+hepatitis+C+virus+and+its+interaction+with+Rab9+is+required+for+release+of+viral+particles.">TIP47 is associated with the hepatitis C virus and its interaction with Rab9 is required for release of viral particles.</a> Eur J Cell Biol. 92 (12), 374-382 (2013).</li><li>Rosch, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+Lipid+Droplet+Proteome+Analysis+Identifies+Annexin+A3+as+a+Cofactor+for+HCV+Particle+Production.">Quantitative Lipid Droplet Proteome Analysis Identifies Annexin A3 as a Cofactor for HCV Particle Production.</a> Cell Rep. 16 (12), 3219-3231 (2016).</li><li>Kwiatkowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrafast+extraction+of+proteins+from+tissues+using+desorption+by+impulsive+vibrational+excitation.">Ultrafast extraction of proteins from tissues using desorption by impulsive vibrational excitation.</a> Angew Chem Int Ed Engl. 54 (1), 285-288 (2015).</li><li>Webster, B., Ott, M., Greene, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evasion+of+superinfection+exclusion+and+elimination+of+primary+viral+RNA+by+an+adapted+strain+of+hepatitis+C+virus.">Evasion of superinfection exclusion and elimination of primary viral RNA by an adapted strain of hepatitis C virus.</a> J Virol. 87 (24), 13354-13369 (2013).</li><li>Shevchenko, A., Tomas, H., Havlis, J., Olsen, J. V., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-gel+digestion+for+mass+spectrometric+characterization+of+proteins+and+proteomes.">In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2856-2860 (2006).</li><li>Ting, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Normalization+and+statistical+analysis+of+quantitative+proteomics+data+generated+by+metabolic+labeling.">Normalization and statistical analysis of quantitative proteomics data generated by metabolic labeling.</a> Mol Cell Proteomics. 8 (10), 2227-2242 (2009).</li><li>Brasaemle, D. L., Dolios, G., Shapiro, L., Wang, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+analysis+of+proteins+associated+with+lipid+droplets+of+basal+and+lipolytically+stimulated+3T3-L1+adipocytes.">Proteomic analysis of proteins associated with lipid droplets of basal and lipolytically stimulated 3T3-L1 adipocytes.</a> J Biol Chem. 279 (45), 46835-46842 (2004).</li><li>Tingting, P., Caiyun, F., Zhigang, Y., Pengyuan, Y., Zhenghong, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subproteomic+analysis+of+the+cellular+proteins+associated+with+the+3'+untranslated+region+of+the+hepatitis+C+virus+genome+in+human+liver+cells.">Subproteomic analysis of the cellular proteins associated with the 3' untranslated region of the hepatitis C virus genome in human liver cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 347 (3), 683-691 (2006).</li><li>Ariumi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DDX3+DEAD-box+RNA+helicase+is+required+for+hepatitis+C+virus+RNA+replication.">DDX3 DEAD-box RNA helicase is required for hepatitis C virus RNA replication.</a> J Virol. 81 (24), 13922-13926 (2007).</li><li>Weinlich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IGF2BP1+enhances+HCV+IRES-mediated+translation+initiation+via+the+3'UTR.">IGF2BP1 enhances HCV IRES-mediated translation initiation via the 3'UTR.</a> RNA. 15 (8), 1528-1542 (2009).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

여기서, 우리는 바이러스 감염 등 다양한 배양 조건에서 지질 소적과 연관된 단백질의 농축 및 고갈 비교 정량 지질 방울 프로테옴 분석 지질 방울을 분리하는 프로토콜을 기술한다. 다른 방법으로, 프로테옴 분석 전체 피크 강도에 기초하여 라벨없는 정량화하여 수행 될 수있다. 이 메소드는 동적 범위 제한이 없으며 대사 문제를 피할 수있다. SILAC 접근법의 장점은 샘플 전에 지질 방울 분리를 ?...

<html> 지질 방울 높은 중성 지질 코어 이루어지는 동적 세포질 (핵) 세포 소기관이다 (중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 에스테르 (CE)) 임베디드 단백질 1 인지질 단층에 의해 둘러싸인. 모든 종류의 세포는 지질 방울을 생산하지만, 크기, 지질 성분, 단백질 장식 다양합니다. 지질 소적 에너지와 막 전구체 저수지 또는 단백질 침착 물로서 작용 등 다양한 기능을 수행. 또한, 지질의 흡수를 통해, 그들은 신호 분자로서 세포에서 리포 독성 (lipotoxicity), 박리 보호 지질 및 단백질 분해하고 소포체 (ER) 스트레스 반응에 관여하는 2. 따라서, 단백질의 호스트 지질 방울에 결합하여 다른 세포 소기관과 함께 자신의 생성, 파괴, 인신 매매, 및 상호 작용을 제어합니다. 그 중 (PLIN1-5) 선의의 지질 방울 결합 단백질의 perilipin 가족F &quot;&gt; 3. 지질 생합성 액적 가능성 중성 지질 렌즈 최근 효모 4 좋게 가시화하는 처리를 형성 ER 상주 효소 막 이중층 내에 축적 중성 지질 합성을 촉매 소포체에서 시작한다. 굽힘 막과 높은 포스 폰산 및 디아 실 글리세롤의 수준은 다음 지질 액적 생성 (5)에 필요한 코어 중성 지질 및 인지질 차폐 동시로 합성 인지질 생합성에 관여하는 단백질을 유도하는 것으로 생각된다. 응급실에있는 횡단 도메인을 품고 효소는이 과정을 촉진. 큰 지질 방울에 확장은 양친 매성 나선 항구 따라서 지질 방울에 ER에서 여행 할 수 지질 합성 효소의 다른 클래스의 활동을 필요로한다. 지질 방울로부터 지질의 동원은 triglycerid의 지역의 활성화를 통해 발생E 및 디아 실 글리세롤 리파제는 트리글리세리드 지방 분해 효소 (ATGL) 및 호르몬 민감성 리파아제 (HSL) 또는 다량 및 microlipophagy autophagic 또는 상이한 경로에 의해 자식 작용은 6 매개 샤페론. 지질 방울 및 ER (베타 - 산화 및 지질 합성) 같은 미토콘드리아와 같은 다른 세포 소기관과 상호 작용하지만, (지질 합성과 단백질 밀수)도 리 소솜, 엔도 솜 및 세포 내 박테리아 (7)에 의해 유도 된 액포로. 실제로 박테리아, 바이러스, 심지어 기생충은 그들 HCV (8) 사이에 복제 및 지속성에 대한 지질 방울을 대상. HCV 감염은 9 학년 당 약 50 만 명이 사망를 차지, 전 세계적으로 간 관련 이환율과 사망률의 주요 원인 중 하나입니다. HCV 감염의 진정한 수를 알 수 있지만, 최근의 추정치는 130 것을 제안 - 150,000,000명이 만성적으로 감염된다. 어떤 VACCIN 없습니다전자는 존재하지만, 최근에 승인 된 직동 항 바이러스 극적으로 표준 인터페론 기반 치료에 비해 치료 반응을 증가시킨다. 그러나 전 세계적으로 환자의 치료는 가능성으로 인해 새로운 치료제의 매우 높은 비용으로 제한됩니다. 모든 개인의 약 절반이 만성 지방간 질환 (지방간), 간세포의 지질 방울의 과도한 축적을 특징으로하는 조건을 개발 HCV에 감염. 흥미롭게도, 지질 방울도 추정되는 바이러스 성 조립 사이트 (10), (11)의 역할, HCV 복제 같은 중요한 세포 소기관을 나타났다. HCV에 감염된 세포에서, 바이러스 단백질 코어 및 NS5A는 디아 실 글리세롤 아실 트랜스퍼 라제 1 (DGAT1)의 억제제로서, 중성 생합성에 따라 공정에서 지질 소적에 지역화 지질 방울과 후속 HCV 입자 제조 12 피킹 악영향 </sup&gt; 13, 14, 15. 또한, 코어 또는 NS5A 중의 지질 방울 - 결합 도메인의 돌연변이 HCV 조립체 (16), (17)을 억제. 코어 및 NS5A는 밀접하게 16 방울 지질과 관련된 세포막에, 다른 모든 바이러스 성 단백질뿐만 아니라 바이러스 성 RNA 복제 단지를 모집. 모든 바이러스 단백질의 공동 작업은 전염성 바이러스 자손 (10), (11)의 성공적인 생산을 위해 필요합니다. 구조적 단백질은 비리 온의 일부분이며, 비 구조 단백질은이 과정에 필요한 단백질 - 단백질 상호 작용을 촉진한다. 흥미롭게도, 선의의 지질 방울 - 결합 단백질 PLIN3 / TIP47 모두의 HCV RNA 복제 및 비리 온 (18)의 릴리즈 19에 필요 <sup&gt; 20. 이러한 최근의 발전에도 불구하고, 특히 HCV 복제의 후기 단계 동안 바이러스 - 호스트 상호 작용의 기계적인 세부 사항은, 잘못 정의 된 남아 있고, 지질 방울의 정확한 기능은 알 수 없습니다. 여기서는 연관된 단백질의 정량적 질량 분석을위한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명한다. 이 방법을 사용하여, 우리는 지질 방울-fractionates 공동 효율적인 HCV 성숙 (21)에 요구되는 호스트 단백질로서 HCV 감염 동안 지질 방울 프로테옴의 큰 변화 및 식별 넥신 A3 알았다.

<table><tbody><tr><td>SILAC Protein Quantitation Kit - DMEM</td><td>Thermo Fisher</td><td>89983&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;13&lt;/sup&gt;C&lt;sub&gt;6&lt;/sub&gt; L-Arginine-HCl 50&amp;nbsp;mg</td><td>Thermo Fisher</td><td>88210</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Load 1</td><td>Roth GmbH</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>Roti-Blue 5x Concentrate</td><td>Roth GmbH</td><td>A152.2&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10x SDS-Tris-Glycine - Buffer</td><td>Geyer Th. GmbH &amp;amp; Co.KG&amp;nbsp;</td><td>A1415,0250&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX (100x)</td><td>Life Technologies GmbH&amp;nbsp;</td><td>350500038&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin Solution for Cell Culture</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P4333-100ml&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DPBS 1x Dulbecco&#039;s Phosphate-buffered Saline</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>D8537&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>T3924-100ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1149,1000</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultrapure&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1086,5000A&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>EDTA &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1103,0250</td><td></td></tr><tr><td>Protease Inhibitor Cocktail 5 mL</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P8340-5ML&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-Sucrose &lt;em&gt;BioChemica&lt;/em&gt;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A3935,1000</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid (HCl) 37% pure Ph. Eur., NF</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0625</td><td></td></tr><tr><td>DC Protein Assay&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&amp;nbsp;</td><td>500-0116&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>AppliChem GmbH</td><td>151339</td><td></td></tr><tr><td>SDS Ultrapure</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1112</td><td></td></tr><tr><td>Bromophenol blue</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2331</td><td></td></tr><tr><td>&amp;beta;-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A4338</td><td></td></tr><tr><td>Blasticidin</td><td>Invivogen</td><td>ant-bl-1&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Chloride&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A1039</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl Fluoride&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Potassium Phosphate Monobasic</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>221309</td><td></td></tr><tr><td>Dipotassium Hydrogenphosphate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>P3786&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>AppliChem GmbH</td><td>A2948</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>AppliChem</td><td>A1694</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>AppliChem</td><td>A4974</td><td></td></tr><tr><td>Nonfat dried milk powder</td><td>AppliChem</td><td>A0830</td><td></td></tr><tr><td>Anti-ADFP/ ADRP&amp;nbsp;</td><td>abcam</td><td>ab52355</td><td></td></tr><tr><td>M6PRB1/TIP47 100 &amp;micro;g</td><td>abcam</td><td>ab47639</td><td></td></tr><tr><td>Calreticulin, pAb 200 &amp;micro;g</td><td>Enzo Life Science GmbH&amp;nbsp;</td><td>ADI-SPA-600-F&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-&amp;beta;-Tubulin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>T6074 200&amp;micro;l &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute (EtOH)</td><td>Geyer Th. GmbH &amp;amp; Co.KG&amp;nbsp;</td><td>A3678,0250 &amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anti-MnSOD</td><td>Enzo Life Science GmbH&amp;nbsp;</td><td>ADI-SOD-110-F</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse HRP</td><td>Thermo Fisher Pierce</td><td>32430</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit HRP</td><td>Thermo Fisher&amp;nbsp; Pierce</td><td>32460</td><td></td></tr><tr><td>Amersham Hyperfilm ECL</td><td>GE Healthcare</td><td>28906836</td><td></td></tr><tr><td>Lumi-Light Western Blotting Substrate</td><td>Sigma-Aldrich Chemie GmbH&amp;nbsp;</td><td>12015196001</td><td></td></tr><tr><td>96-Well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>655 180&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Terumo Syringe 1 mL</td><td>Terumo</td><td>SS-01T</td><td></td></tr><tr><td>Filtropur BT 50, 500 mL, 0.45 &amp;micro;m&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>83.1823.100&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN TGX Precast Gels, Any kD resolving gel</td><td>Bio-Rad Laboratoris GmbH&amp;nbsp;</td><td>456-9034&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>6-Well Cell Culture Plate</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>657160&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dishes Nunclon 150/20&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>10098720 - 168381&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cell Scraper</td><td>neoLab Migge GmbH&amp;nbsp;</td><td>C-8120&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tube, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One GmbH&amp;nbsp;</td><td>227261&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Tube RNase-free&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>72.706.400&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ultra Clear Centrifuge Tubes 11 x 60 mm</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>344062&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Suction Needles</td><td>Transcodent</td><td>6482</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 1000&amp;nbsp;</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.762.211&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 200</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.760.211&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Biosphere Fil. Tip 10</td><td>SARSTEDT&amp;nbsp;</td><td>70.1130.210&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dounce Tissue Grinder</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>11883722</td><td></td></tr><tr><td>Pestles For Dounce All-Glass Tissue Grinders</td><td>Fisher Scientific GmbH&amp;nbsp;</td><td>10389444</td><td></td></tr><tr><td>Orbitrap Fusion</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Branson Sonifier 450</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer comfort, with Thermoblock 1.5 mL</td><td>Eppendorf</td><td>5355&amp;nbsp;000.127</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Cell, Mini Trans-Blot Module, and PowerPac Basic Power Supply,&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>165-8033</td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN 3 Multi-Casting Chamber</td><td>BioRad</td><td>165-4110</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac HC Power Supply</td><td>Biorad</td><td>164-5052</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td></td></tr><tr><td>Optima L-90K</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>365670</td><td></td></tr><tr><td>SW 60 Ti Rotor</td><td>Beckman Coulter GmbH&amp;nbsp;</td><td>335649</td><td></td></tr><tr><td>Infinite M1000 PRO</td><td>Tecan</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

lipid droplet isolation for quantitative mass spectrometry analysis

지질 방울은 비리의 형태 형성의 추정되는 사이트로, 다른 병원균의 다양한 가장 눈에 띄게 C 형 간염 바이러스 (HCV)의 복제에 중요합니다. 양적 지질 방울 프로테옴 분석에 지역화 또는 바이러스 감염과 같은 조건에서 지질 방울에서 변위 단백질을 식별 할 수 있습니다. 여기, 우리는 성공적으로 HCV 감염 다음과 같은 지질 방울 프로테옴의 변화를 특징 짓는 데 사용 된 프로토콜을 설명합니다. 우리는 세포 배양 (SILAC)에서 아미노산과 안정 동위 원소 라벨 사용하여 질량 분석에 의해 단백질을 정량하는 &quot;무거운&quot;아미노산 셀 중 하나 명 인구의 전체 프로테옴 레이블을 붙입니다. 도 1 및 저장성 완충액에 용해 기계적 : 지질 방울 분리를위한 두 개의 세포 집단 (즉, HCV 감염 / &quot;광&quot;아미노산 및 비감염 제어 / &quot;무거운&quot;아미노산 1) 혼합한다. 핵 및 세포 D를 제거한 후저속 원심 분리에 의해 ebris은 지질 방울 - 관련 단백질은 등장 완충액 세 세척 단계 다음에 두 단계 이후의 초 원심 분리에 의해 농축된다. 지질 방울 분획의 순도는 상이한 세포 내 구획을 인식하는 항체로 웨스턴 블 롯팅하여 분석한다. 지질 방울 - 관련 단백질 후 쿠마시 염색 하였다 SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 전기 영동 (SDS-PAGE)에 의해 분리된다. 트립신 소화 후에, 펩티드는 액체 크로마토 그래피 - 전기 분무 이온화 텐덤 질량 분석법 (LC-ESI-MS / MS)에 의해 정량화된다. 이 방법을 사용하여, 우리는 프로 또는 바이러스 호스트 요소를 나타낼 수 HCV 감염시 지질 방울에 모집 단백질을 확인했다. 우리의 방법은 병원체 감염, 환경 스트레스, 약물 치료와 같은 다른 세포 및 배양 조건의 종류에 적용될 수있다.

지질 방울 비리 어셈블리의 추정 ​​사이트와 같은 HCV 감염에 매우 중요하지만, 형태 형성과 비리의 출구의 분자 메커니즘은 거의 알려져 있지 않다. 이 과정에 관여하는 신규 한 호스트 종속 요소를 식별하기 위해 HCV에 감염된 세포를 21 (도 1a)의 양적 지질 방울 프로테옴 분석을 수행 하였다. 우리는 지질 소적의 정제를위한 프로토콜을 확...

Watch this Scientific Journal Video about Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis at JoVE.com

Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다.

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

Lipid droplets are vital to the replication of a variety of different pathogens, most prominently the Hepatitis C Virus (HCV), as the putative site of ...

lipid-droplet-isolation-for-quantitative-mass-spectrometry-analysis

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Biochemistry

10.0K 조회수.  Leibniz Institute for Experimental Virology.  지질 방울은 C 형 간염 바이러스 (HCV) 등 여러 가지 병원균의 복제에 중요한 소기관이다. 우리는 관련 단백질의 양적 질량 분석에 대한 지질 방울을 분리하는 방법을 설명; 그것은 바이러스 감염, 환경 스트레스, 또는 약물 치료와 같은 조건의 다양한에서 사용할 수 있습니다. 

비디오: Lipid Droplet Isolation for Quantitative Mass Spectrometry Analysis

Isolation and Chemical Characterization of Lipid A from Gram-negative Bacteria

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS can be subdivided into three domains: the distal O-polysaccharide, a core oligosaccharide, and the lipid A domain consisting of a lipid A molecular species and 3-deoxy-D-manno-oct-2-ulosonic acid residues (Kdo). The lipid A domain is the only component essential for bacterial cell survival. Following its synthesis, lipid A is chemically modified in response to environmental stresses such as pH or temperature, to promote resistance to antibiotic compounds, and to evade recognition by mediators of the host innate immune response. The following protocol details the small- and large-scale isolation of lipid A from gram-negative bacteria. Isolated material is then chemically characterized by thin layer chromatography (TLC) or mass-spectrometry (MS). In addition to matrix-assisted laser desorption/ionization-time of flight (MALDI-TOF) MS, we also describe tandem MS protocols for analyzing lipid A molecular species using electrospray ionization (ESI) coupled to collision induced dissociation (CID) and newly employed ultraviolet photodissociation (UVPD) methods. Our MS protocols allow for unequivocal determination of chemical structure, paramount to characterization of lipid A molecules that contain unique or novel chemical modifications. We also describe the radioisotopic labeling, and subsequent isolation, of lipid A from bacterial cells for analysis by TLC. Relative to MS-based protocols, TLC provides a more economical and rapid characterization method, but cannot be used to unambiguously assign lipid A chemical structures without the use of standards of known chemical structure. Over the last two decades isolation and characterization of lipid A has led to numerous exciting discoveries that have improved our understanding of the physiology of gram-negative bacteria, mechanisms of antibiotic resistance, the human innate immune response, and have provided many new targets in the development of antibacterial compounds.

Isolation and characterization of the lipid A domain of lipopolysaccharide (LPS) from gram-negative bacteria provides insight into cell surface based mechanisms of antibiotic resistance, bacterial survival and fitness, and how chemically diverse lipid A molecular species differentially modulate host innate immune responses.

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

Lipopolysaccharide (LPS) is the major cell surface molecule of gram-negative bacteria, deposited on the outer leaflet of the outer membrane bilayer. LPS ...

연구

화학

Cellular Lipid Extraction for Targeted Stable Isotope Dilution Liquid Chromatography-Mass Spectrometry Analysis

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including numerous stereoisomers1,2. These metabolites can be formed from free or esterified fatty acids. Many of these oxidized metabolites have biological activity and have been implicated in various diseases including cardiovascular and neurodegenerative diseases, asthma, and cancer3-7. Oxidized bioactive lipids can be formed enzymatically or by reactive oxygen species (ROS). Enzymes that metabolize fatty acids include cyclooxygenase (COX), lipoxygenase (LO), and cytochromes P450 (CYPs)1,8. Enzymatic metabolism results in enantioselective formation whereas ROS oxidation results in the racemic formation of products.
While this protocol focuses primarily on the analysis of AA- and some LA-derived bioactive metabolites; it could be easily applied to metabolites of other fatty acids. Bioactive lipids are extracted from cell lysate or media using liquid-liquid (l-l) extraction. At the beginning of the l-l extraction process, stable isotope internal standards are added to account for errors during sample preparation. Stable isotope dilution (SID) also accounts for any differences, such as ion suppression, that metabolites may experience during the mass spectrometry (MS) analysis9. After the extraction, derivatization with an electron capture (EC) reagent, pentafluorylbenzyl bromide (PFB) is employed to increase detection sensitivity10,11. Multiple reaction monitoring (MRM) is used to increase the selectivity of the MS analysis. Before MS analysis, lipids are separated using chiral normal phase high performance liquid chromatography (HPLC). The HPLC conditions are optimized to separate the enantiomers and various stereoisomers of the monitored lipids12. This specific LC-MS method monitors prostaglandins (PGs), isoprostanes (isoPs), hydroxyeicosatetraenoic acids (HETEs), hydroxyoctadecadienoic acids (HODEs), oxoeicosatetraenoic acids (oxoETEs) and oxooctadecadienoic acids (oxoODEs); however, the HPLC and MS parameters can be optimized to include any fatty acid metabolites13.
Most of the currently available bioanalytical methods do not take into account the separate quantification of enantiomers. This is extremely important when trying to deduce whether or not the metabolites were formed enzymatically or by ROS. Additionally, the ratios of the enantiomers may provide evidence for a specific enzymatic pathway of formation. The use of SID allows for accurate quantification of metabolites and accounts for any sample loss during preparation as well as the differences experienced during ionization. Using the PFB electron capture reagent increases the sensitivity of detection by two orders of magnitude over conventional APCI methods. Overall, this method, SID-LC-EC-atmospheric pressure chemical ionization APCI-MRM/MS, is one of the most sensitive, selective, and accurate methods of quantification for bioactive lipids.

This protocol will demonstrate the extraction and analysis of free and esterified bioactive fatty acids from cells. Fatty acids are accurately quantified using stable isotope dilution, chiral liquid chromatography, electron capture atmospheric chemical ionization multiple reaction monitoring mass spectrometry (SID-LC-ECAPCI-MRM/MS).

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

The metabolism of fatty acids, such as arachidonic acid (AA) and linoleic acid (LA), results in the formation of oxidized bioactive lipids, including ...

생체공학

Isolation of Cellular Lipid Droplets: Two Purification Techniques Starting from Yeast Cells and Human Placentas

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of neutral lipids surrounded by a phospholipid monolayer. One of the most useful techniques in determining the cellular roles of droplets has been proteomic identification of bound proteins, which can be isolated along with the droplets. Here, two methods are described to isolate lipid droplets and their bound proteins from two wide-ranging eukaryotes: fission yeast and human placental villous cells. Although both techniques have differences, the main method - density gradient centrifugation -&#160;is shared by both preparations. This shows the wide applicability of the presented droplet isolation techniques.

In the first protocol, yeast cells are converted into spheroplasts by enzymatic digestion of their cell walls. The resulting spheroplasts are then gently lysed in a loose-fitting homogenizer. Ficoll is added to the lysate to provide a density gradient, and the mixture is centrifuged three times. After the first spin, the lipid droplets are localized to the white-colored floating layer of the centrifuge tubes along with the endoplasmic reticulum (ER), the plasma membrane, and vacuoles. Two subsequent spins are used to remove these other three organelles. The result is a layer that has only droplets and bound proteins.

In the second protocol, placental villous cells are isolated from human term placentas by enzymatic digestion with trypsin and DNase I. The cells are homogenized in a loose-fitting homogenizer. Low-speed and medium-speed centrifugation steps are used to remove unbroken cells, cellular debris, nuclei, and mitochondria. Sucrose is added to the homogenate to provide a density gradient and the mixture is centrifuged to separate the lipid droplets from the other cellular fractions.

The purity of the lipid droplets in both protocols is confirmed by Western Blot analysis. The droplet fractions from both preps are suitable for subsequent proteomic and lipidomic analysis.

Two techniques for isolating cellular lipid droplets from 1) yeast cells and 2) human placentas are presented. The centerpiece of both procedures is density gradient centrifugation, where the resulting floating layer containing the droplets can be readily visualized by eye, extracted, and quantified by Western Blot analysis for purity.

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

Lipid droplets are dynamic organelles that can be found in most eukaryotic and certain prokaryotic cells. Structurally, the droplets consist of a core of ...

Isolation of Lipoprotein Particles from Chicken Egg Yolk for the Study of Bacterial Pathogen Fatty Acid Incorporation into Membrane Phospholipids

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the majority of exogenous fatty acids are present within host lipoprotein particles. Uncertainty remains as to the reservoirs of host fatty acids and the mechanisms by which bacteria extract fatty acids from the lipoprotein particles. In this work, we describe protocols for enrichment of low-density lipoprotein (LDL) particles from chicken egg yolk and determining whether LDLs serve as fatty acid reservoirs for S. aureus. This method exploits unbiased lipidomic analysis and chicken LDLs, an effective and economical model for the exploration of interactions between LDLs and bacteria. The analysis of S. aureus integration of exogenous fatty acids from LDLs is performed using high-resolution/accurate mass spectrometry and tandem mass spectrometry, enabling the characterization of the fatty acid composition of the bacterial membrane and unbiased identification of novel combinations of fatty acids that arise in bacterial membrane lipids upon exposure to LDLs. These advanced mass spectrometry techniques offer an unparalleled perspective of fatty acid incorporation by revealing the specific exogenous fatty acids incorporated into the phospholipids. The methods outlined here are adaptable to the study of other bacterial pathogens and alternative sources of complex fatty acids.

This method provides a framework for studying incorporation of exogenous fatty acids from complex host sources into bacterial membranes, particularly Staphylococcus aureus. To achieve this, protocols for the enrichment of lipoprotein particles from chicken egg yolk and subsequent fatty acid profiling of bacterial phospholipids utilizing mass spectrometry are described.

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

Staphylococcus aureus and other Gram-positive pathogens incorporate fatty acids from the environment into membrane phospholipids. During infection, the ...

생화학

A Quantitative Assessment of The Yeast Lipidome using Electrospray Ionization Mass Spectrometry

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a genetically and biochemically manipulable unicellular eukaryote with annotated genome and very simple lipidome, is a valuable model for studying biological functions of various lipid species in multicellular eukaryotes2,3,5. S. cerevisiae has 10 major classes of lipids with chain lengths mainly of 16 or 18 carbon atoms and either zero or one degree of unsaturation6,7. Existing methods for lipid identification and quantification - such as high performance liquid chromatography, thin-layer chromatography, fluorescence microscopy, and gas chromatography followed by MS - are well established but have low sensitivity, insufficiently separate various molecular forms of lipids, require lipid derivitization prior to analysis, or can be quite time consuming. Here we present a detailed description of our experimental approach to solve these inherent limitations by using survey-scan ESI/MS for the identification and quantification of the entire complement of lipids in yeast cells. The described method does not require chromatographic separation of complex lipid mixtures recovered from yeast cells, thereby greatly accelerating the process of data acquisition. This method enables lipid identification and quantification at the concentrations as low as g/ml and has been successfully applied to assessing lipidomes of whole yeast cells and their purified organelles. Lipids extraction from whole yeast cells for using this method of lipid analysis takes two to three hours. It takes only five to ten minutes to run each sample of extracted and dried lipids on a Q-TOF mass spectrometer equipped with a nano-electrospray source.

We describe a new quantitative lipidomics method for identifying numerous lipid species in yeast using survey-scan electrospray ionization mass spectrometry (ESI/MS). This method exceeds currently available methods for lipid identification and quantification in the ability to resolve various molecular forms of lipids, sensitivity, and speed.

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

Lipids are one of the major classes of biomolecules and play important roles membrane dynamics, energy storage, and signalling1-4. The budding yeast ...

생물학

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity results in the hydrolysis of the membrane lipid phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate [PI(4,5)P2] leading ultimately to the activation of transient receptor potential (TRP) and TRP like (TRPL) channels. The activity of PLC&#946; also leads subsequently to the generation of many lipid species several of which have been proposed to play a role in TRP and TRPL activation. In addition, several classes of lipids have been proposed to play key roles in organizing the cell biology of photoreceptors to optimize signaling reactions for optimal sensory transduction. Historically, these discoveries have been driven by the ability to isolate Drosophila mutants for enzymes that control the levels of specific lipids and perform analysis of photoreceptor physiology in these mutants. More recently, powerful mass spectrometry methods for isolation and quantitative analysis of lipids with high sensitivity and specificity have been developed. These are particularly suited for use in Drosophila where lipid analysis is now possible from photoreceptors without the need for radionuclide labeling. In this article, the conceptual and practical considerations in the use of lipid mass spectrometry for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of various signaling lipids in Drosophila photoreceptors are covered. Along with existing methods in molecular genetics and physiological analysis such lipid is likely to enhance the power of photoreceptors as a model system for discoveries in biology.

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

The manuscript presents versatile, robust, and sensitive mass spectrometry protocols to identify and quantify several classes of lipids from Drosophila photoreceptors.

The activation of phospholipase C&#946; (PLC&#946;) is an essential step during sensory transduction in Drosophila photoreceptors. PLC&#946; activity ...

Shotgun Lipidomics of Rodent Tissues

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have made lipidomics a powerful analytical tool for monitoring tissue lipidome compositions in homeostatic as well as disease states. This paper presents a step-by-step protocol for a shotgun lipid analysis method that supports the simultaneous detection and quantification of a few hundred molecular lipid species in different tissue and biofluid samples at high throughput. This method leverages automated nano-flow direct injection of a total lipid extract spiked with labeled internal standards without chromatographic separation into a high-resolution mass spectrometry instrument. Starting from sub-microgram amounts of rodent tissue, the MS analysis takes 10 min per sample and covers up to 400 lipids from 14 lipid classes in mouse lung tissue. The method presented here is well suited for studying disease mechanisms and identifying and quantifying biomarkers that indicate early toxicity or beneficial effects within rodent tissues.

Shotgun mass spectrometry-based lipidomics delivers a sensitive quantitative snapshot of a broad spectrum of lipid classes simultaneously in a single measurement from various rodent tissues.

설치류 조직의 산탄총 지질체

Lipids play a vital role as essential components of all prokaryotic and eukaryotic cells. Constant technological improvements in mass spectrometry have ...

안정 동위원소 라벨링을 사용한 지질 구조 스크리닝

Tracing de novo Lipids using Stable Isotope Labeling LC-TIMS-TOF MS/MS

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable isotope labeling (SIL) offers several advantages for the study of lipid distribution, mobilization, and metabolism, as well as de novo lipid synthesis. The successful implementation of the SIL technique requires the removal of interferences from endogenous molecules. In the present work, we describe a high-throughput analytical protocol for the screening of SIL lipids from biological samples; examples will be shown of lipid de novo identification during mosquito ovary development. The use of complementary liquid chromatography trapped ion mobility spectrometry and mass spectrometry allows for the separation and lipids assignment from a single sample in a single scan (&lt;1 h). The described approach takes advantage of recent developments in data-dependent acquisition and data-independent acquisition, using parallel accumulation in the mobility trap followed by sequential fragmentation and collision-induced dissociation. The measurement of SIL at the fatty acid chain level reveals changes in lipid dynamics during the ovary development of mosquitoes. The lipids de novo structures are confidently assigned based on their retention time, mobility, and fragmentation pattern.

저자 스포트라이트: Quantification of Complex Lipidomic Samples Using Stable Isotope Labeling (안정 동위원소 라벨링을 사용한 복잡한 지질도미 시료의 정량화)

Presented here is a method for screening lipid structures through stable isotope labeling by using their retention time, mobility, and fragmentation.

안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적

Lipids are highly diverse, and small changes in lipid structures and composition can have profound effects on critical biological functions. Stable ...

양적 질량 분광법 분석을위한 지질 물방울 절연

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

그람 음성 박테리아에서 분리 및 지질의 화학 특성

타겟 안정 동위 원소 희석 액체 크로마 토그래피 - 질량 분광법 분석을위한 세포 지질 추출

세포 지질 방울의 분리 : 효모 세포와 인간의 태반에서 시작 두 정화 기술

세균성 병원체 지방산 을 막 인지질로 통합하는 연구를 위해 닭 계란 노른자에서 지단백질 입자의 분리

전기 분무 이온화 질량 분광법을 사용하여 효모 Lipidome의 양적 평가

Analysis of Lipid Signaling in Drosophila Photoreceptors using Mass Spectrometry

설치류 조직의 산탄총 지질체

안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적

안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적

안정 동위원소 라벨링 LC-TIMS-TOF MS/MS를 사용한 새로운 지질 추적