Name: using primary neurosphere cultures to study primary cilia
Uploaded: 2017-04-14T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
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Work in S.M.'s laboratory is funded by recruitment grants from CPRIT (R1220) and NIH (1R01GM113023-01).

成体マウス脳からのニューロスフェアの単離<ol><li>イソフルランの過剰投与により（約2ヶ月）成体マウスを安楽死させます。マウスが呼吸を停止し、死の直後に解剖したことをダブルチェック。 </li><li>はさみを使用して、頭蓋骨を開くために正中切開を行います。脳を削除します。 </li><li>氷の上で10cmディッシュに冷たいPBSで脳を置きます。側脳室48からSVZを得るために全体のマウント解剖の方法に従ってください。 </li><li> 、1.5mlチューブに側脳室を配置し、0.05％トリプシン-EDTAをPBS中の500μLを添加し、水浴中で37℃で15分間チューブをインキュベートします。 </li><li> 15分後、停止中の500μLを加え、穏やかに20ピペット - 1mLの先端と30回。ピペット操作中に気泡を形成することは避けてください。 注：この手順は、細胞の生存に重要です。 </li><li> 8分間、500×gで細胞をスピンダウン。 、上清を捨て、PBS 1 mLを加え、再懸濁さt穏やかに1 mLの先端で5回ピペッティングすることにより彼の細胞。 </li><li> 8分間500×gでスピンダウン。 1mLのチップを使用して上清を捨て、基礎培地1mLを加えます。 </li><li> （オプション）細胞破片が認められた場合、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞を渡します。 </li><li>血球計数器を用いた細胞の数を数えます。一般的には、約30,000 - 60,000細胞/ SVZが得られます。 </li><li>プレートを5％CO 2、37℃でNSC培地及び培養の10mlで10cmディッシュに1つのSVZからの細胞。 </li><li>球体49との間の融合を回避するために（オプション）、5％CO 2、37℃でNSC培地及び培養1.5mLの予め充填されている超低結合、6ウェルプレートの1ウェルに1,000細胞を置きます。 注：5-7日後、神経球を観察することができる（ 図2A）。培養期間は、マウスの年齢や遺伝的背景と異なる場合があります。 </li><li>文化を維持するために、3〜4日ごとにNSC培地2mlを追加（既存のメディアを削除しないでください）。 </li></ol>ニューロスフェアの分化能と繊毛形成試験の2分析<ol><li>分化能を分析するために、分化培地中の付着条件の下での神経球を分析します。 </li><li>オートクレーブまたは使用前にUV照射で12ミリメートルラウンドカバースリップを滅菌します。接着細胞培養のために、無菌条件下で24ウェルプレートのウェルに滅菌12ミリメートル丸いカバーガラスを置きます。 </li><li> 0.002％ポリ-L-リシン（PLL）の500μLで10秒間コートカバーガラス。ソリューションを吸引し、10〜15分間、それを乾燥させます。 </li><li>ラミニン溶液500μL（5μgの/μL）を追加します。 37℃で1時間、カバーガラスをインキュベートします。 </li><li>ラミニンを吸引し、分化培地またはNSC培地（未分化対照）500μLを加えます。 </li><li>顕微鏡下で200μLチップで200ミクロン球 - 分化アッセイのために、100を拾います。加えます分化培地で7〜10日間、24ウェルプレート培養の各ウェルに5-10神経球。 </li><li>未分化神経球を分析するために、NSC培地中で1〜2日間、24ウェルプレート培養の各ウェルに5-10ニューロスフィアを加えます。添付の神経球を広げ、単層（ 図2B）として成長します。 </li><li>注意深く培地を除去した後、室温で15分間、PBS中の4％パラホルムアルデヒド（PFA）を用いて細胞を固定し、その後、室温で5分間、PBSで二回洗浄します。プレートを1~2ヶ月間4℃で保存することができます。 注：（神経幹/前駆細胞マーカー）ネスチンに対して免疫染色を行い、NSC培地中で神経幹/前駆細胞と分化培地中で分化した細胞を可視化するために、βチューブリンIII（TUJ1モノクローナル、ニューロンマーカー）、GFAP（グリア線維酸性タンパク質、星状細胞のマーカー）、及びO4（オリゴデンドロサイトマーカー）（ 図2B-E）。 （Arl13bに対する一次CIを免疫染色を行い、繊毛を分析するためにリア・マーカー）とGpr161（毛様体GPCR）（ 図3）。 </li><li>スライドガラス上に溶液を取り付けるとカバーガラスをマウントします。過剰の溶液を除去するためのスライドガラスを傾けます。 </li></ol>ニューロスフェアにおける繊毛形成の3分析<ol><li>免疫染色によって、無傷のニューロスフェア中の細胞を分析するために、培養培地の転送1mLを1.5mlチューブに複数のニューロスフェアを含有し、8分間、500×gでスピンダウン。 15分間、培地を除去した後、4％（PFA）で球体を固定し、PBSで洗浄します。 、8分間、500×gで球をスピンダウンし、上清を除去し、そして4℃で30％スクロースと球O / Nインキュベートします。 </li><li> 1mLのチップを使用して上清を捨て、カット1mLのチップを用いたOCT溶液の500μLを加えます。 10月が粘性であるように、開口部を広くする先端の縁を切りました。 </li><li>使い捨てプラスチック凍結モールド（10ミリメートル×10ミリメートル×5ミリメートル）にニューロスフェアを含有するのOCT溶液を移します。 </li><li>メートルをフリーズ少なくとも15分間ドライアイス上の古いです。 </li><li> （オプション）実験を停止し、最大1年間-80℃の冷凍庫内の金型を格納します。 </li><li>クライオスタットを持つセクションをカット。セクションの厚さは15〜30ミクロンでなければなりません。 </li><li>ニューロスフェア中の一次繊毛を視覚化するために、Arl13bに対する免疫染色（ 図4）を実行します。 </li></ol> 4.文化とニューロスフェアと接着NSCのパッセージ<ol><li>パッセージの神経球球のサイズは100〜200μmの間にありながら、ニューロスフェアは、（300ミクロン以上）大きすぎるとき、彼らは実験のための理想的ではありません。 </li><li> 1mLのチップを使用して、50mLのチューブに神経球を移し、8分間、500×gでスピンダウン。 </li><li>アスピレータを用いて上清を捨て、PBS中の0.05％トリプシンEDTAの500μLを添加し、37℃で5分間インキュベートします。トリプシンの量は、球の数によって異なります。 </li><li>血清中の500μLを加え、穏やかにパイプ1mLの先端とT 20回。 </li><li> 8分間500×gでスピンダウン。 1mLのチップを使用して上清を捨て、基礎培地1mLを加えます。 </li><li> （オプション）細胞残屑や非解離神経球が見られる場合、70μmの細胞ストレーナーを通して細胞を渡します。 </li><li>通路NSC培地中10,000細胞/ cm 2の密度で10cmディッシュ中の細胞。細胞は、一週間後の次の通過のための準備が整います。 </li><li> （任意）50万1,000,000細胞/ mL懸濁液を生成するために、凍結培地追加、細胞を凍結します。クライオ冷凍容器を用いて細胞を凍結します。解離していないの神経球はまた、凍結することができます。 </li><li>接着培養のために、1~2日間NSC培地、および培養とPLL-ラミニン被覆カバースリップ上に50,000細胞/ cm 2に細胞をdillute。 </li></ol> 5.飢餓と繊毛の分析<ol><li>飢餓培地（ 表1）を調製。 </li><li> 1~2日、最初のPL後別のウェル（実験）で解離、1つのウェル（対照）におけるNSC培地に変更し、飢餓培地後の接着細胞のating。 </li><li>文化24時間接着細胞。 </li><li> RTで15分間、PBS中の4％PFAで細胞を固定し、室温で5分間ずつPBSで2回洗浄します。 </li><li> （オプション）実験を停止し、1~2ヶ月間、4℃でPBSでカバーガラスを含む24ウェルプレートを格納します。 </li><li> 7、50を染色するための免疫プロトコルを実行します。 </li><li>マウントソリューションを使用してカバースリップをマウントします。暗所でRTでスライドガラスO / Nを乾燥させます。 </li><li>必要な倍率の複合顕微鏡で画像を取得します。同行のソフトウェアを使用して制御顕微鏡、カメラ、および目的（40X / 1.3油および63X / 1.4油）を、使用してください。 0.5〜0.8μmの間隔（ 図5）において十分なZ-セクションを取ります。 </li><li>で毛様体局在の定量分析のために接着細胞を、DAPIチャネルに調べることによってコンフルエント細胞と3-8の連続するフィールドからの画像スタックを取得します。 ImageJの/フィジーを使用して、プライマリ繊毛の数を定量化します。一般的に、ImageJのプラグインで「セルカウンタ」ツールを使用する&gt; GPCR陽性繊毛で細胞をカウントするためのダイアログボックスを分析します。画像のスタックからの最大突出はまた、目的をカウントし、エクスポートするための同一の実験からのすべての画像のためのImageJ / Fiji.Use同様の画像輝度及びコントラストパラメータからエクスポートすることができます。 </li></ol>ニューロスフェアの6トランスフェクション<ol><li> 24時間カバーガラスに解離細胞を接着。 24ウェルプレートの単一のウェルに500μLNSCの培地中で、典型的には75,000との間の150,000細胞の細胞密度を使用します。 </li><li> 5秒間ボルテックスすることにより低減血清培地および0.5 mLのマイクロチューブにトランスフェクション試薬の1.5μLの25μLを混合します。 </li><li>別個0.5mLのmicrotubにエンドトキシンフリープラスミドDNA2.5μgのを追加eは減少血清培地の25μLを含有し、5秒間ボルテックスして混合します。 </li><li> DNAを含む第二のマイクロチューブにトランスフェクション試薬の1μLを添加し、5秒間ボルテックスすることにより混合します。 </li><li> DNAを含有するチューブから最初のマイクロチューブに混合物を添加し、ピペッティングにより混合します。 </li><li> RTで10〜15分間混合物をインキュベートします。インキュベーション後、穏やかNSC媒体の上面（500μL/ウェル）でウェルにトランスフェクション混合物を滴下して加えます。 </li><li>培地（NSC培地）又は飢餓培地（500μL/ウェル）を制御するために媒体24時間後、トランスフェクションを変更します。 </li><li> 24時間後に4％PFAに培地を交換することによって細胞を固定し、免疫染色を行います。典型的には、10％のトランスフェクション効率までこのプロトコルを使用して得られます。 </li></ol>

The authors declare no competing financial interests.

ここでは、成体マウスのSVZからニューロスフェア培養を生成し、維持するための方法について説明します。次のように文化に関するいくつかの適切なポイントがあります。 200ミクロン - まず、球の大きさは、通常50の間です。ニューロスフェアは、直径がより大きく300μm以下を取得し、私たちの経験では、継代のための最適な時間が見逃されています。これらの大きな球は、コア内の死細胞?...

一次繊毛は、成体神経機能3における胚神経発達1、2、及び区画細胞内シグナル伝達の間ソニックヘッジホッグ（Shhの）経路を含む細胞シグナル伝達経路の調整における感覚アンテナとして機能する微小管ベースの動的細胞内区画である4 。このような5にパッチを当てShhの受容体として、これらの経路のシグナル伝達成分、。経路アクチベーターあるSmoothened（SMO）6。そしてGpr161 7、負のShh経路を調節するオーファンGタンパク質共役型受容体（GPCR）は、動的に繊毛に局在します。複数のGPCRは、10脳7、8、9で神経細胞に繊毛に局在することが報告されています</SUP&gt;、11、12、13、14、15、16。繊毛および繊毛で生成シグナル伝達経路における欠陥は、複数の組織に影響を与えると総称ciliopathies 17、18、19として知られています。繊毛病の疾患スペクトルはしばしば、頭蓋顔面異常20、21、22のような神経発達の欠陥を含みます。加えて、視床下部ニューロンにおける主要繊毛は、中央満腹経路を調節し、欠陥は、バルデーBiedel症候群24として症候群ciliopathiesにおける肥満をミラーリング、中心性肥満23をもたらします。また、繊毛シグナリング神経ペプチド受容体はCENTRを調節しますアル満腹14、11経路。毛様体アデニリルシクラーゼIII（ACIII）の局在化および海馬ニューロンにおけるそのようなソマトスタチン受容体3としてGPCRは、新規物体認識欠陥および記憶欠損25をもたらし26と毛様体の整合27の欠如に匹敵します。繊毛が生成したシグナルの発達的側面は密接に組織恒常性に結びついています。特に、繊毛は小脳28、29における顆粒前駆細胞から生じるのShhサブタイプの髄芽腫の進行に重要です。このように、主繊毛は、胚、出生後、および成人の神経細胞の発達と機能の間に重要な役割を果たしています。 神経幹細胞（NSCは）、側脳室の脳室下帯（SVZ）に存在する海馬の歯状回の顆粒下ゾーン、及び哺乳類30、31、32における視床下部における第三脳室の脳室帯。 NSCは、多能ある自己複製能を有し、かつ脳の発達と再生医療30のために重要です。 SVZのほとんどのNSCは、静止していると、多くの場合、側脳室33に張り出し孤独主要繊毛を持っています。特にShhは、TGFβ、および受容体チロシンキナーゼ経路2、34、35、36に関連して、下流の細胞応答を誘導する様々な受容体の局在化を介して、一次繊毛信号。一次繊毛は、側脳室中に延びているので、一次繊毛は、脳脊髄液（CSF）のNSC 37を活性化するためにサイトカインを検出すると仮定されます</s&gt;アップ。最近の研究では、Shhのシグナル伝達経路と主な繊毛が嗅上皮、肺、腎臓および38を含む複数の組織の修復および再生における幹細胞の活性化のために重要であることを示唆している39、40、41。しかしながら、CSFは、NSCを用いて一次繊毛が関与しているかどうかを通信するメカニズムは知られていません。文化の中で付着NSCは繊毛されています。このような繊毛でのSmoとGpr161としてのShh経路成分を、ローカライズ。そして42応答のShhです。このように、NSCは、Shhの経路を研究するための重要なモデル系、毛様体人身売買、および神経分化経路としての役割を果たすことができます。また、NSCをから分化したニューロンはまた、繊毛輸送アッセイのために使用することができます。 ニューロスフェアはneuraの増殖から生じる浮遊細胞のクラスターで構成されています特定の増殖因子と非接着面43、44の存在下で増殖L幹/前駆細胞。ニューロスフェアは、正常な発達と病気31、45、46、47の神経幹/前駆細胞を研究するためにin vitro培養モデルのように重要な役割を果たす。ここでは、神経幹/前駆細胞を培養するためにニューロン/グリアへの分化のためのニューロスフェアベースのアッセイを説明します。我々は、特に神経幹/前駆細胞および分化したニューロン（ 図1）の繊毛へのコンポーネントのシグナリングの輸送を強調する。一次ニューロンの培養とは対照的に、一次ニューロスフェアは、培養するのが比較的容易である複数の継代および凍結 - 融解のサイクルに適している、およびニューロン/グリアへの分化を受けることができます。重要なのは、我々はそのニューロスフェア由来神経を決定しました幹/前駆細胞と分化したニューロンは、培養中の繊毛およびこれらの区画における繊毛機能に関連するシグナル伝達分子局在化しています。ニューロスフェアベースの培養方法は、NSCの分化及びニューロンにおいて繊毛形成と繊毛輸送を研究するための理想的なモデル系として役立つことができます。

<table><tbody><tr><td>12 mm round cover glass</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>24-well plate</td><td>Falcon</td><td>353047</td><td></td></tr><tr><td>4% paraformaldehyde (PFA)</td><td>Affymetrix</td><td>19943</td><td></td></tr><tr><td>50 mL tube</td><td>Falcon</td><td>352098</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm petri dish, slippable lid</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td>10 cm dish</td></tr><tr><td>70 &amp;micro;m cell strainer</td><td>Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Affinipure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>711-545-152</td><td>Donkey anti Rabbit, Alexa 488 secondary antibody</td></tr><tr><td>Arl13B, Clone N295B/66</td><td>Neuromab</td><td>AB_11000053</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Supplement (50X), serum free</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17504001</td><td>B27</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo scientific</td><td>ST 40R</td><td></td></tr><tr><td>Cryogenic vial</td><td>Corning</td><td>430488</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma</td><td>D9542-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Deoxyribonuclease I from bovine pancrease</td><td>Sigma</td><td>D5025-15KU</td><td>Dnase I</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide</td><td>Sigma</td><td>D8418-100ML</td><td>DMSO</td></tr><tr><td>Disposable Vinyl Specimen Molds</td><td>Sakura Tissue-Tek Cryomold</td><td>4565</td><td>10 mm x 10 mm x 5 mm</td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate-buffered Saline 10X, Modified, without calcium chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture</td><td>Sigma</td><td>D1408-500ML</td><td>DPBS</td></tr><tr><td>Dumont #5 Forceps</td><td>Fine science tools</td><td>11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Sigma</td><td>F9026-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount-G solution</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>mounting solution</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>DAKO</td><td>Z0334</td><td></td></tr><tr><td>Goat anti Mouse IgG1 Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21127</td><td>Goat anti Mouse IgG1, Alexa 555 secondary antibody</td></tr><tr><td>Goat anti Mouse IgG2a Secondary Antibody, Alexa Fluor 555 conjugate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A-21137</td><td>Goat anti Mouse IgG2a, Alexa 555 secondary antibody</td></tr><tr><td>Gpr161</td><td>home made</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>human bFGF</td><td>Sigma</td><td>F0291</td><td>FGF</td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>0.100 mm deep</td><td>improved neubauer</td></tr><tr><td>Isothesia</td><td>Henry Schein</td><td>NDC 11695-0500-2</td><td>Isofluorane</td></tr><tr><td>Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm Sarcoma basement membrane</td><td>Sigma</td><td>L2020</td><td>Laminin</td></tr><tr><td>L-Glutamine (200 mM)</td><td>Sigma</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000 Transfection Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L3000</td><td></td></tr><tr><td>Mr. Frosty</td><td>Nalgene&amp;nbsp;</td><td>5100-0036</td><td></td></tr><tr><td>N-2 supplement (100X)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>17502001</td><td>N2</td></tr><tr><td>Neurobasal medium</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Normal Donkey Serum</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>OCT compound</td><td>Sakura Tissue-Tek</td><td>4583</td><td>OCT</td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Sigma</td><td>P4333-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine (PLL)</td><td>Sigma</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>Recombinant human EGF protein, CF</td><td>R and D systems</td><td>236-EG-200</td><td>EGF</td></tr><tr><td>Scissor</td><td>Fine science tools</td><td>14060-10</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost plus microscope slide</td><td>Fisher scientific</td><td>12-550-15</td><td>slides</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0407</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA solution (10X)</td><td>Sigma</td><td>T4174-100</td><td>Trypsin</td></tr><tr><td>COSTAR 6-Well Plate, With Lid Flat Bottom Ultra-Low Attachment Surface Polystyrene, Sterile</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>ultra-low binding 6-well plate</td></tr><tr><td>&amp;beta;-tubulin III</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td>TUJ1</td></tr></tbody></table>

using primary neurosphere cultures to study primary cilia

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, postnatal, and adult life. In addition, most differentiated neurons possess primary cilia that house signaling receptors, such as G-protein-coupled receptors, and signaling molecules, such as adenylyl cyclases. The primary cilium determines the activity of multiple developmental pathways, including the sonic hedgehog pathway during embryonic neuronal development, and also functions in promoting compartmentalized subcellular signaling during adult neuronal function. Unsurprisingly, defects in primary cilium biogenesis and function have been linked to developmental anomalies of the brain, central obesity, and learning and memory deficits. Thus, it is imperative to study primary cilium biogenesis and ciliary trafficking in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. However, culturing methods for primary neurons require considerable expertise and are not amenable to freeze-thaw cycles. In this protocol, we discuss culturing methods for mixed populations of neural stem/progenitor cells using primary neurospheres. The neurosphere-based culturing methods provide the combined benefits of studying primary neural stem/progenitor cells: amenability to multiple passages and freeze-thaw cycles, differentiation potential into neurons/glia, and transfectability. Importantly, we determined that neurosphere-derived neural stem/progenitor cells and differentiated neurons are ciliated in culture and localize signaling molecules relevant to ciliary function in these compartments. Utilizing these cultures, we further describe methods to study ciliogenesis and ciliary trafficking in neural stem/progenitor cells and differentiated neurons. These neurosphere-based methods allow us to study cilia-regulated cellular pathways, including G-protein-coupled receptor and sonic hedgehog signaling, in the context of neural stem/progenitor cells and differentiated neurons.

週間NSC培地中のSVZからの細胞をプレーティングした後、浮遊ニューロスフェアは、（ 図2A）が観察されました。球のサイズは、50と200μmの間で変化しました。球が神経幹/前駆細胞に由来するものであったかどうかを調べるために、ニューロスフェアは、2日間PLL-とNSC培地中のラミニンでコーティングしたカバーガラス上にプレーティングしました。これら...

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Using Primary Neurosphere Cultures to Study Primary Cilia

主な繊毛は、神経前駆細胞の増殖、ニューロン分化、および成人の神経機能における基本的に重要です。ここでは、繊毛形成とプライマリニューロスフェア培養を用いて神経幹/前駆細胞および分化したニューロンにおける繊毛へのシグナル伝達タンパク質の輸送を研究するための方法について説明します。

一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

The primary cilium is fundamentally important for the proliferation of neural stem/progenitor cells and for neuronal differentiation during embryonic, ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

9.3K ビュー.  University of Texas Southwestern Medical Center. 主な繊毛は、神経前駆細胞の増殖、ニューロン分化、および成人の神経機能における基本的に重要です。ここでは、繊毛形成とプライマリニューロスフェア培養を用いて神経幹/前駆細胞および分化したニューロンにおける繊毛へのシグナル伝達タンパク質の輸送を研究するための方法について説明します。 

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Establishing Embryonic Mouse Neural Stem Cell Culture Using the Neurosphere Assay

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life span of the animal. They can potentially replace cells that are lost in the aging process or in the process of injury and disease. The existence of neural stem cells (NSCs) was first described by Reynolds and Weiss (1992) in the adult mammalian central nervous system (CNS) using a novel serum&#8208;free culture system, the neurosphere assay (NSA). Using this assay, it is also feasible to isolate and expand NSCs from different regions of the embryonic CNS. These in vitro expanded NSCs are multipotent and can give rise to the three major cell types of the CNS. While the NSA seems relatively simple to perform, attention to the procedures demonstrated here is required in order to achieve reliable and consistent results. This video practically demonstrates NSA to generate and expand NSCs from embryonic day 14-mouse brain tissue and provides technical details so one can achieve reproducible neurosphere cultures. The procedure includes harvesting E14 mouse embryos, brain microdissection to harvest the ganglionic eminences, dissociation of the harvested tissue in NSC medium to gain a single cell suspension, and finally plating cells in NSA culture. After 5-7 days in culture, the resulting primary neurospheres are passaged to further expand the number of the NSCs for future experiments.

This video protocol demonstrates the application of the neurosphere assay for the isolation and expansion of neural stem cells from the ganglionic eminences of embryonic day 14-mouse brain.

ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

In mammalians, stem cells acts as a source of undifferentiated cells to maintain cell genesis and renewal in different tissues and organs during the life ...

神経科学

One Mouse, Two Cultures: Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Two Neurogenic Zones of Individual Mice

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult neural stem cells in vitro. These assays can be used to compare the precursor potential of cells isolated from genetically different or differentially treated animals&#160;to determine the effects of exogenous factors on neural precursor cell proliferation and differentiation and to generate neural precursor cell lines that can be assayed over continuous passages. The neurosphere assay is traditionally used for the post-hoc identification of stem cells, primarily due to the lack of definitive markers with which they can be isolated from primary tissue&#160;and has the major advantage of giving a quick estimate of precursor cell numbers in brain tissue derived from individual animals. Adherent monolayer cultures, in contrast, are not traditionally used to compare proliferation between individual animals, as each culture is generally initiated from the combined tissue of between 5-8 animals. However, they have the major advantage that, unlike neurospheres, they consist of a mostly homogeneous population of precursor cells and are useful for following the differentiation process in single cells. Here, we describe, in detail, the generation of neurosphere cultures and, for the first time, adherent cultures from individual animals. This has many important implications including paired analysis of proliferation and/or differentiation potential in both the subventricular zone (SVZ) and dentate gyrus (DG) of treated or genetically different mouse lines, as well as a significant reduction in animal usage.

Here we describe a detailed protocol for the simultaneous generation of neural precursor cell cultures, as either adherent monolayers or neurospheres, from the subventricular zone and dentate gyrus of individual adult mice.

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

The neurosphere assay and the adherent monolayer culture system are valuable tools to determine the potential (proliferation or differentiation) of adult ...

2D and 3D Human Induced Pluripotent Stem Cell-Based Models to Dissect Primary Cilium Involvement during Neocortical Development

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older centriole during the G1/G0 phase of the cell cycle, while they disassemble as the cells re-enter the cell cycle at the G2/M phase boundary. They function as signal hubs, by detecting and transducing extracellular signals crucial for many cell processes. Similar to most cell types, all neocortical neural stem and progenitor cells (NSPCs) have been shown harboring a PC allowing them to sense and transduce specific signals required for the normal cerebral cortical development. Here, we provide detailed protocols to generate and characterize two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) cell-based models from human induced pluripotent stem cells (hIPSCs) to further dissect the involvement of PC during neocortical development. In particular, we present protocols to study the PC biogenesis and function in 2D neural rosette-derived NSPCs including the transduction of the Sonic Hedgehog (SHH) pathway. To take advantage of the three-dimensional (3D) organization of cerebral organoids, we describe a simple method for 3D imaging of in toto immunostained cerebral organoids. After optical clearing, rapid acquisition of entire organoids allows detection of both centrosomes and PC on neocortical progenitors and neurons of the whole organoid. Finally, we detail the procedure for immunostaining and clearing of thick free-floating organoid sections preserving a significant degree of 3D spatial information and allowing for the high-resolution acquisition required for the detailed qualitative and quantitative analysis of PC biogenesis and function.

We present detailed protocols for the generation and characterization of 2D and 3D human induced pluripotent stem cell (hIPSC)-based models of neocortical development as well as complementary methodologies enabling qualitative and quantitative analysis of primary cilium (PC) biogenesis and function.

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

Primary cilia (PC) are non-motile dynamic microtubule-based organelles that protrude from the surface of most mammalian cells. They emerge from the older ...

発生生物学

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Isolation and Expansion of Neurospheres from Postnatal (P1&#8722;3) Mouse Neurogenic Niches

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including proliferation, self-renewal and multipotency. In the postnatal and adult brain, NSPCs are mainly present in two neurogenic niches: the subventricular zone (SVZ) lining the lateral ventricles and the subgranular zone of the hippocampal dentate gyrus (DG). The isolation of the neurogenic niches from postnatal brain allows obtaining a higher amount of NSPCs in culture with a consequent advantage of higher yields. The close contact between cells within each neurosphere creates a microenvironment that may resemble neurogenic niches. Here, we describe, in detail, how to generate SVZ- and DG-derived neurosphere cultures from 1&#8722;3-day-old (P1&#8722;3) mice, as well as passaging, for neurosphere expansion. This is an advantageous approach since the neurosphere assay allows a fast generation of NSPC clones (6&#8722;12 days) and contributes to a significant reduction in the number of animal usage. By plating neurospheres in differentiative conditions, we can obtain a pseudomonolayer of cells composed of NSPCs and differentiated cells of different neural lineages (neurons, astrocytes and oligodendrocytes) allowing the study of the actions of intrinsic or extrinsic factors on NSPC proliferation, differentiation, cell survival and neuritogenesis.

In this article, we describe, in detail, a protocol for the generation of neurosphere cultures from postnatal mouse neural stem cells derived from the main mouse neurogenic niches. Neurospheres are used to identify neural stem cells from brain tissue allowing the estimation of precursor cell numbers. Moreover, these 3D structures can be plated in differentiative conditions, giving rise to neurons, oligodendrocytes and astrocytes, allowing the study of cell fate.

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

The neurosphere assay is an extremely useful in vitro technique for studying the inherent properties of neural stem/progenitor cells (NSPCs) including ...

Efficient and Cost Effective Electroporation Method to Study Primary Cilium-Dependent Signaling Pathways in the Granule Cell Precursor

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In the granule cell precursor (GCP), the primary cilium acts as a pivotal signaling center that orchestrates precursor cell proliferation by modulating the Hh signaling pathway. The investigation of primary cilium-dependent Hh signaling machinery is facilitated by in vitro genetic manipulation of the pathway components to visualize their dynamic localization to the primary cilium. However, transfection of transgenes in the primary cultures of GCPs using the currently known electroporation methods is generally costly and often results in low cell viability and undesirable transfection efficiency. This paper introduces an efficient, cost-effective, and simple electroporation protocol that demonstrates a high transfection efficiency of ~80-90% and optimal cell viability. This is a simple, reproducible, and efficient genetic modification method that is applicable to the study of the primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathway in primary GCP cultures.

Here, we present a reproducible in vitro electroporation protocol for genetic manipulation of primary cerebellar granule cell precursors (GCPs) that is cost-effective, efficient, and viable. Moreover, this protocol also demonstrates a straightforward method for the molecular study of primary cilium-dependent Hedgehog signaling pathways in primary GCP cells.

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

The primary cilium is a critical signaling organelle found on nearly every cell that transduces Hedgehog (Hh) signaling stimuli from the cell surface. In ...

<meta charset="utf8"></head><body>マウス脳室内領域から単離されたNSCの効率的なヌクレオフェクション

Isolation, Expansion, and Nucleofection of Neural Stem Cells from Adult Murine Subventricular Zone

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented with basic fibroblast growth factor (bFGF) and epidermal growth factor (EGF) as mitogens, producing clonal aggregates known as neurospheres. This in vitro system is a valuable tool for studying NSC potential. Transfection of siRNAs or genes carried in plasmids can be used to induce perturbations to gene expression and study NSC biology. However, the exogenous nucleic acid delivery to NSC cultures is challenging due to the low efficiency of central nervous system (CNS) cells transfection. Here, we present an improved nucleofection system that achieves high efficiency of gene delivery in expanded NSCs from adult murine SVZ. We demonstrate that this relatively simple method enhances gene perturbation in adult NSCs, surpassing traditional transfection protocols with survival rates exceeding 80%. Moreover, this method can also be applied in primary isolated NSCs, providing a crucial advancement in gene function studies through gene expression manipulation via knockdown or overexpression in neurosphere cultures.

<meta charset="utf8"></head><body>著者スポットライト:マウス脳室下ゾーン由来神経幹細胞培養における高効率遺伝子導入のためのヌクレオフェクションの改善

Here, we describe a nucleofection system designed to enhance gene delivery efficiency in expanded neural stem cells (NSCs) isolated from the adult murine subventricular zone. The findings demonstrate that this method significantly improves gene perturbation in NSCs, surpassing the effectiveness of traditional transfection protocols and enhancing cell survival rate.

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

Isolation and expansion of neural stem cells (NSCs) from the subventricular zone (SVZ) of the adult mouse brain can be achieved in a medium supplemented ...

Simple Detection of Primary Cilia by Immunofluorescence

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to mitosis. Primary cilia can be visualized with highly sophisticated methods, including transmission electron microscopy, 3D imaging, or using software for the automatic detection of primary cilia. However, immunofluorescent staining of primary cilia is needed to perform these methods. This publication describes a protocol for the easy detection of primary cilia in vitro by staining acetylated alpha tubulin (axoneme) and gamma tubulin (basal body). This immunofluorescent staining protocol is relatively simple and results in high-quality images. The present protocol describes how four cell lines (C2C12, MEF, NHLF, and skin fibroblasts) expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged with a fluorescent or confocal microscope.

Primary cilia are extracellular structures associated with the centriole. Primary cilia detection by immunofluorescent staining is a relatively simple procedure that results in extremely high-quality images. In this protocol, fibroblasts expressing primary cilia were fixed, immunostained, and imaged in a fluorescent or confocal microscope.

免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出

Primary cilia are dynamically regulated during cell cycle progression, specifically during the G0/G1 phases of the cell cycle, being resorbed prior to ...

一次繊毛を研究するために一次ニューロスフェア培養物を使用して

要約

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ニューロスフェアのアッセイを使用してマウス胎児神経幹細胞培養の確立

マウスを一回、二つの文化：個々のマウスの二つの神経原性のゾーンから成体神経幹細胞の単離および培養

2Dおよび3Dヒト人工多能性幹細胞ベースのモデルにより、新皮質発生中の原発性繊毛の関与を解剖

E14-E16スプラーグドーリーラット胚から分離された混合原発海馬および皮質ニューロンからの神経球の生成

出生後(P1-3)マウス神経起源ニッチからの神経球の分離と拡大

顆粒細胞前駆体における原発性シリウム依存シグナル伝達経路を研究するための効率的で費用対効果の高いエレクトロポレーション法

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

成体マウス脳室下領域からの神経幹細胞の単離、増殖、およびヌクレオフェクション

免疫蛍光による原発性繊毛の簡易検出