Name: a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines
Uploaded: 2017-03-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 59 s
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The authors would like to thank Drs. Helene Salmon and Miriam Merad from Icahn School of Medicine at Mount Sinai for providing the B16-F10-YFP cells and for their expert advice on melanoma mouse models. The authors further thank the Animal Imaging Core Facility, the Radiochemistry and Molecular Imaging Probes Core Facility, and the Molecular Cytology Core Facility at Memorial Sloan Kettering Cancer Center (MSK) for their support. This work was supported by National Institutes of Health grants NIH 1 R01 HL125703 (W.J.M.M.), R01CA155432 (W.J.M.M.), K25 EB016673 (T.R.) and P30 CA008748 (MSK Center Grant). The authors also thank the Center for Molecular Imaging and Nanotechnology (CMINT) at MSK for their financial support (T.R.).

手順は、ナノ粒子の二重の放射性及び蛍光標識、in vivoでの PET-CTイメージング、ex vivoでの生体内分布の測定、およびex vivo免疫染色で構成され、フローサイトメトリー分析します。全ての動物実験は、メモリアル・スローンケタリングがんセンターの施設内動物管理使用委員会によって承認されました。 二重標識リポソームの調製注：同系B16メラノーマ腫瘍を2％イソフルラン含有酸素を吸入から麻酔下でC57BL / 6マウスの背面脇腹に30万B16-F10細胞を注射することによって誘導することができます。手術中に滅菌ワークスペースに無菌試薬およびツールを使用してください。手術後、慎重に麻酔からの回復するまで動物を観察します。彼らは完全な意識と機動性を回復する場合にのみ、そのケージに戻って動物を置きます。異種移植された腫瘍を有する動物のための無菌室でそれらを収容します。サイズの腫瘍300ミリメートル3のナノ粒子の蓄積を増加させることができ、その顕著な強化された透過性および保持効果によるナノ粒子のキャラクタリゼーション（EPR）に最適です。詳細なプロトコルを以下に提供します。 <ol><li>丸底フラスコに、1,2- dipalmitoyl- SN -glycero -3- phophocholine（DPPC）、コレステロール、1,2- disearoyl- SN -glycero-を含むクロロホルム2mLに脂質20 mgの混合物を溶解3-ホスホエタノールアミン-ポリ（エチレングリコール）2000（DSPE-PEG2000）、DSPE-デフェロキサミン（DSPE-DFO）8、及び1,1- diododecyl-3,3,3,3-tetramethylindodicarbocyanine -5,5-ジスルホン酸（ DiIC12 [5]は、それぞれ61.3％33.4％、5、0.2％、および0.1％のモル比で）-ds。 注：この脂質組成物は、現在、診療所2で使用したドキソルビシンのリポソーム製剤と非常に類似しています。私たちの手順から得られたリポソームは、密接に臨床nanomedicのin vivo性能を模倣しますINE。 </li><li>有機溶媒を除去し、室温で薄い脂質膜を形成し、ロータリーエバポレーターを使用して。氷上で十分に冷却して、3.8 mmの超音波処理チップと30 Wの振幅を用いて、リポソームナノ粒子を生成するために、20 mlのPBSと30分間超音波処理を追加します。 </li><li> 10分間4000×gで遠心分離リポソーム溶液凝集物を除去し、遠心濾過（分子量カットオフ（MWCO使用してPBSでナノ粒子を洗浄する：自由な脂質および残留有機溶媒を除去するために100キロダルトン）のリポソームを濃縮し、その意志上部チャンバー中に残り、新しいチューブに移す。リポソームは、後続のステップの前に最大1週間、PBS中の冷蔵庫に保存することができます。 </li><li>品質管理のために、動的光散乱（DLS）によりリポソームを特徴付けます。具体的には、PBSの950μLを有するリポソームの50μLを混合し、次にサイジングキュベットに混合物を移します。アナライザにキュベットを置き、粒子を測定サイズは、そのサイズ分布を示します。それぞれ0.2 - 120nmで0.1 - 粒子サイズとそのサイズ分布（多分散性指数（PDI））が90であることが期待されます。 </li><li>放射性標識のために、（1.5 mLチューブに2時間、37℃で1 mCiの89のZr-シュウ酸と6.9と7.1の間のpHで、総体積をPBS中の脂質の2ミリグラムに相当する精製されたリポソームを、ミックス：〜 100μL）。 1.3ステップと同様に、遠心濾過（MWCO = 100キロダルトン）によって自由、未反応の89のZrを削除します。滅菌PBSで保持物を洗浄し、所望の体積に希釈します。 95％ - 放射化学的収率は80でなければなりません。 注意！放射性物質を使って作業することを強く規制されています。機関が認定し、必要な設備、人材育成、および放射能の使用の厳格な監視を提供する必要があります。研究者は、適切な訓練を受け、放射能を取り扱うときは個人用保護具や線量測定リング/バッジを着用する必要があります。 </li><li&gt;一般的に98％を超える10でなければならないサイズ排除ラジオ-HPLCにより放射性標識したリポソームの放射化学的純度を決定します。放射化学は95％未満、ステップ1.5に不十分な洗浄を示すものである純度。 </li><li>放射性標識した後、動的光散乱法によりナノ粒子のサイズを決定します。サイズ及びPDIは、ステップ1.4 10での測定と同じ範囲内であることが期待されます。 注：放射性サンプルをフローサイトメーターまたは蛍光顕微鏡で許可されていない場合は、非放射性のnatのZr-シュウ酸塩は、ステップ1.5でリポソームを標識するために使用することができます。これらの非放射性リポソームは、それらの放射性類似体と同一の特性を有しています。この手順の描写を図2に提供されます。 </li></ol>二重標識リポソームのインビボ PET-CTイメージングと生体内分布2. <ol><li>ワット二重標識リポソームの約100μLを注入i番目の約300の放射能のμCiの抑制メラノーママウス（C57BL / 6、10の女性、 - 16週齢）に、その尾静脈を介して、約10 mCiの89のZr / kg体重で。 </li><li>半減期を決定するために、28-Gのインスリン注射器を使用して、2％イソフルラン含有酸素の下で麻酔した動物からの尾静脈から血液を描画します。 2分、15分、1時間、4時間、8時間、24時間、及び注射後48時間で、予め秤量したチューブ中 - （20μL10）血液を収集します。 、差によって血液を計量ガンマカウンターを用いて放射能量を決定し、グラムあたりの注射用量率（％ID / g）でのパーセンテージとして放射能濃度を計算します。 注：麻酔システム、回復ケージ、加熱、およびバイオハザードフードを装備した部屋の手順を実行します。動物が完全に回復してケージを保持するに回復ケージからそれらを転送する前に、手順の後に通常の移動性を得ることを確認します。ハウスで投与した動物に指定された部屋で、腫瘍を有する動物放射性物質。 </li><li>の注射後24時間または48時間 リポソーム、小動物マイクロPET-CTスキャナ10の画像マウス。その腹に水平に麻酔をかけた動物を配置し、麻酔し、それを維持します。ノーズコーンを介して2％イソフルラン酸素を管理します。乾燥からそれらを防ぐために、スキャンの前に、その眼に眼軟膏を適用します。 </li><li> 15分のおおよその期間で、全身PET静的スキャン記録少なくとも5000万一致イベントを実行します。それぞれ、350から700 keVの6ナノ秒でのエネルギーとの一致タイミングウィンドウを設定します。その後、5分間行う断層撮影（CT）スキャンを計算しました。 80 kVの500μAの電流の電圧にX線管を設定します。 CTスキャンは、フレーム10当たり約145ミリ秒で、220度の合計120回転のステップを使用しています。 </li><li> PET-CTスキャンの後、すぐに二酸化炭素窒息によりマウスを屠殺し、pinchiによって死亡を確認動物の足をngの。確認されると、子宮頸部転位を行います。 </li><li>最初の右心房を切開した後、左心室に20 mLのPBSを注入することによって、マウス組織に血液を除去し、その後、腫瘍、肝臓、脾臓、肺、腎臓、筋肉、その他16などの関連組織を収集します。 </li><li> 、組織を秤量8,9をカウントガンマによるその放射能含量を測定し、1g当たりの注射用量率（％ID / g）での割合などの組織の放射能蓄積を計算します。 </li></ol> 3. エクスビボフローサイトメトリーおよび免疫染色注：体重1kg当たり染料0.5mgの用量で尾静脈を介してメラノーママウスに蛍光リポソームの約100μLを注入。放射性サンプルは、フローサイトメーター、蛍光顕微鏡で許可されていない場合は、非放射性リポソームを使用する必要があります。 <ol><li>ステップ2.5のように、マウス24時間後に注射を生け贄に捧げる、冷PBS中に保存しなければならない腫瘍を収集します。 </li><li>フローサイトメトリーのために、手順17に従います。 <ol><li> 0.5％BSA及び1で（PBSバッファーフローサイトメトリーで精製されたコラゲナーゼIおよびII（4 U / mL）を、ヒアルロニダーゼ（60 U / mL）をDNアーゼI（60 U / mL）を混合物からなる酵素カクテルを調製mMのEDTA）。 </li><li> 1.5 mLチューブに酵素カクテル緩衝液200μLと腫瘍組織100mgを混合し、細かいハサミで小片に組織をダイシング。酵素カクテルの別の1.3 mLのチューブに追加し、6ウェルプレートにその内容を転送します。 </li><li> 60 rpmで60分間、37℃のオーブンの内部に配置され、水平シェーカー上で6ウェルプレートを振ります。 </li><li>単一細胞懸濁液を得るために、フローサイトメトリー緩衝液で3回組織ホモジネートを洗浄します。 </li><li> 、CD45、CD11bの、Ly6C、CD11cのを含むバイオマーカーに特異的な抗体のカクテルで細胞を染色CD64、CD3、MHCII、およびCD31（1：すべての抗体のための200希釈;クローン情報は、材料のスプレッドシートで提供されています）。関連する細胞の種類を識別し、（5）解析ソフトウェアサイトメトリーの適切な流れと各細胞集団に-dS DiIC12のそれらの平均蛍光強度（MFI）を決定します。 </li></ol></li><li>免疫染色のために、次の手順を実行します。 <ol><li>最適な切断媒体（OCT）を充填したカセットに腫瘍を置き、ドライアイス上で凍結します。 </li><li>腫瘍組織から6μmの凍結切片を作成し、組織学的ガラススライド上に置きます。セクションでは、組織上の最も代表的な情報を提供する、腫瘍の最大の断面を、カバーする必要があります。 </li><li>バイオマーカーを染色（ 例えば、内皮細胞に対してCD31）は、対応する抗体（ 例えば、抗CD31、クローンMEC13.3）との利益。パラホルムアルデヒドを持つセクションを修正しました。二次抗体の種起源と一致する血清でそれらをブロックします。 incub4℃で12時間、一次抗体で食べた後、2時間、二次抗体と;そして最後に、PBSで洗浄し、カバースリップでカバーしています。画像ライカ直立共焦点SP5顕微鏡13、16で染色したスライド。 </li></ol></li></ol>

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The authors have no disclosure to make.

プロトコル内の重要なステップ： 二重標識リポソームの高品質を長期間にわたって一貫性のある結果を生成するための鍵です。無料の蛍光色素または89のZrイオンは全く異なるターゲティングパターンを生成することができ、完全に精製工程の間に除去されなければなりません。免疫系が著しく実験的癌ナノメディシンの性能に影響を与える場合に加えて、免疫応?...

ナノメディシンは、癌治療の開発1のパラダイムをシフトしています。このようなリポソームおよびアルブミンベースnanotherapies 2、3のような以前のがんnanomedicines、膨大な臨床的影響に触発され、多くの新規製剤は、過去10年間で生産されています。しかし、これらの癌nanomedicinesの臨床翻訳の成功の最近の分析は、それらのほんの数は、臨床使用4、5のために承認されていることを示しています。新しいがんnanomedicinesの臨床翻訳するための一つの主要な障害は、無料の治療用化合物6の直接投与と比較して、治療指数の彼らの限られた改善です。このように、 インビボでの全身におけるnanomedicinesの性能、組織、および前臨床動物モデルにおける細胞レベルの正確な評価は、identifに不可欠ですyの将来の臨床翻訳のための最適な治療指数を有するもの。 ナノ材料は、すべての臨床イメージング様式7の間で優れた感度と再現性を持っている陽電子放射断層撮影（PET）イメージング、で生きている動物で定量的な特徴づけのために放射性標識することができます。例えば、89のZr標識長期循環nanomedicines癌8、9、10、ならびに他の疾患モデル11マウスモデルにおいて特徴付けられています。また、nanomedicinesの血中半減期および生体内分布が広く、個々の組織8にエクスビボ放射能の測定を用いて評価することができます。したがって、放射性標識は、全身および組織レベルでnanomedicinesを定量的に評価することができます。 重要なことは、radiolabeledはnanomedicinesは、一般的に、単一セルまたは放射性シグナルの限定された空間分解能に起因する細胞内レベルで分析することができません。したがって、蛍光標識は、例えば、フローサイトメトリー、蛍光顕微鏡12のような光イメージング技術を有するナノ粒子の評価のための補完的な様式であることが分かります。この目的のために、放射性同位体、蛍光タグで標識されたナノ粒子は、定量的放射能計数によって核イメージングおよびエクスビボによってインビボで評価することができ、それらはまた、広く光学イメージングにより、細胞レベルで特徴づけることができます。 以前、我々は、高密度リポタンパク質（HDL）11、リポソーム9、10、ポリマーナノ粒子、抗体フラグメント、およびnanoemuを含む様々なナノ粒子に放射性および蛍光標識を組み込むためにモジュール式の手順を開発しましたlsions 10、13。これらの標識されたナノ粒子は、それらの特定の用途のためにこれらのナノ材料の最適化を導いている、さまざまなレベルでの適切な動物モデルで定量的な特徴づけのために許可されています。現在の研究では、目的は、二重標識されたナノ粒子を生成するために、十分古典同系メラノーマB16-F10マウスモデル15でそれを特徴付けるために、包括的な手順を示すための例-asリポソームナノ粒子の最も確立されたナノ医療のプラットフォーム14を使用することです。結果から、我々は、このナノ粒子の特徴付けアプローチは、関連するマウスモデルにおいて他の癌nanomedicinesを評価するように構成することができる確信しています。

<table><tbody><tr><td>DPPC</td><td>Avantilipids</td><td>850355</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-PEG2000</td><td>Avantilipids</td><td>880120P</td><td></td></tr><tr><td>DSPE-DFO</td><td>Home made</td><td>110634</td><td>Perez-Medina &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, JNM, 2014</td></tr><tr><td>DiIC12[5]-DS</td><td>AAT Bioquest</td><td>22051</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugal filter</td><td>Vivaproducts</td><td>VS2061</td><td></td></tr><tr><td>Rotary evaporator</td><td>Buchi</td><td>R-100</td><td></td></tr><tr><td>Radio-HPLC</td><td>Shimadzu HPLC with 2 LC-10AT pumps</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&lt;sup&gt;89&lt;/sup&gt;Zr-oxalate</td><td>MSKCC</td><td>Synthesized in house</td><td>TR19/9 variable beam cyclotron (Ebco Industries Inc.)</td></tr><tr><td>Micro PET-CT</td><td>Siemens</td><td>Inveon Micro-PET/CT</td><td></td></tr><tr><td>Gamma counter</td><td>PerkinElmer</td><td>2470-0150</td><td></td></tr><tr><td>Flow cytometry</td><td>BD Biosciences</td><td>Fortessa</td><td>Any multi-parametric flow cytometry analyzers would suffice</td></tr><tr><td>C57BL/6 mice</td><td>Jackson Laboratories</td><td></td><td></td></tr><tr><td>B16-YFP melanoma cells</td><td>Home made</td><td>N/A</td><td>Salmon &lt;em&gt;et al.&lt;/em&gt;, Immunity, 2016</td></tr><tr><td>Ly6C (clone HK1.4)--APC-Cy7</td><td>128025</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>MHCII (M5/114/152)--APC</td><td>107613</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD45 (30-F11)--BV510</td><td>103137</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD64 (X54-5/7.1)--PE-Cy7</td><td>139313</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11b (M1/70)--BV605</td><td>101237</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD3 (17A2)--BV711</td><td>100241</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3)--PE</td><td>561073</td><td>Biolegend</td><td></td></tr><tr><td>CD11c (M418)--PerCP-Cy5.5</td><td>117327</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr><tr><td>CD31 (13.3) no fluorophore</td><td>550274</td><td>BD Biosciences</td><td></td></tr></tbody></table>

a comprehensive procedure to evaluate the in vivo performance of cancer nanomedicines

クリニック内の前癌nanomedicinesの成功に触発され、研究者は、過去10年間で新規製剤を大量に生成しています。臨床開発中のnanomedicinesの大半は不本意な結果を生み出しているのに対し、しかし、nanomedicinesのほんの数は、臨床使用が承認されています。新しいがんnanomedicinesの成功の臨床翻訳するための一つの主要な障害は、それらのインビボ性能の正確な理解の欠如です。この記事では、陽電子放出断層撮影-コンピュータ断層撮影法（PET-CT）、放射能の定量法の統合を経て全身、組織、単一細胞、および細胞内レベルでの担癌マウスにおけるnanomedicinesのin vivoでの挙動を特徴付けるために厳格な手順を提供しています、フローサイトメトリー、および蛍光顕微鏡。このアプローチを使用して、研究者は、正確にcanceの関連するマウスモデルにおける新規なナノスケールの製剤を評価することができますrを。これらのプロトコルは、高翻訳可能性の最も有望な癌nanomedicinesを識別するか、将来の翻訳のための癌nanomedicinesの最適化を補助する機能を有していてもよいです。

図1は、手順の概要を示しています。 図2は、ステップ1 10に記載の二重標識リポソームの模式的な合成手順を提示します。 図では 、ステップ2で説明したように3ディスプレイ代表PET-CT画像（ 図3a）、PET画像（ 図3b）、血中半減期（ 図3c）、および放...

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A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

評価するための総合的な手順<em&gt;インビボ</em&gt;がんNanomedicinesのパフォーマンス

Inspired by the success of previous cancer nanomedicines in the clinic, researchers have generated a large number of novel formulations in the past ...

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Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Cancer Research

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

8.8K ビュー.  Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The poor understanding of the in vivo performance of nanomedicines stymies their clinical translation. Procedures to evaluate the in vivo behavior of cancer nanomedicines at systemic, tissue, single-cell, and subcellular levels in tumor-bearing immunocompetent mice are described here. This approach may help researchers to identify promising cancer nanomedicines for clinical translation.

ビデオ: A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vivo Performance of Cancer Nanomedicines

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. Photosensitizers selectively accumulate in tumor tissue and lead to tumor cell death in the presence of oxygen and the proper wavelength of light.
To increase the therapeutic effect of PDT, we developed both photosensitizer- and anticancer agent-loaded lung cancer-targeted nanoparticles. Both enhanced permeability and retention (EPR) effect-based passive targeting and hyaluronic-acid-CD44 interaction-based active targeting were applied. CD44 is a well-known hyaluronic acid receptor that is often introduced as a biomarker of non-small cell lung cancer. 
In addition, a combination of PDT and chemotherapy is adopted in the present study. This combination concept may increase anticancer therapeutic effects and reduce adverse reactions. 
We chose hypocrellin B (HB) as a novel photosensitizer in this study. It has been reported that HB causes higher anticancer efficacy of PDT compared to hematoporphyrin derivatives1. Paclitaxel was selected as the anticancer drug since it has proven to be a potential treatment for lung cancer2. 
The antitumor efficacies of photosensitizer (HB) solution, photosensitizer encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-NPs), and both photosensitizer- and anticancer agent (paclitaxel)-encapsulated hyaluronic acid-ceramide nanoparticles (HB-P-NPs) after PDT were compared both in vitro and in vivo. The in vitro phototoxicity in A549 (human lung adenocarcinoma) cells and the in vivo antitumor efficacy in A549 tumor-bearing mice were evaluated.
The HB-P-NP treatment group showed the most effective anticancer effect after PDT. In conclusion, the HB-P-NPs prepared in the present study represent a potential and novel photosensitizer delivery system in treating lung cancer with PDT.

Photodynamic therapy (PDT) is an alternative choice for lung cancer treatment. To increase the therapeutic effect of PDT, lung cancer-targeted nanoparticles combined with chemotherapy were developed. Both in vitro and in vivo anticancer efficacies of PDT with prepared nanoparticles were evaluated.

肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

がん研究

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its therapeutic benefit. Nanoparticle-based drug combination has been shown to mitigate the problems encountered by free drug combination therapy. Our previous studies have shown that the combination of two anticancer drugs, doxorubicin (DOX) and mitomycin C (MMC), produced a synergistic effect against both murine and human breast cancer cells in vitro. DOX and MMC co-loaded polymer-lipid hybrid nanoparticles (DMPLN) bypassed various efflux transporter pumps that confer multidrug resistance and demonstrated enhanced efficacy in breast tumor models. Compared to conventional solution forms, such superior efficacy of DMPLN was attributed to the synchronized pharmacokinetics of DOX and MMC and increased intracellular drug bioavailability within tumor cells enabled by the nanocarrier PLN. 
To evaluate the pharmacokinetics and bio-distribution of co-administered DOX and MMC in both free solution and nanoparticle forms, a simple and efficient multi-drug analysis method using reverse-phase high performance liquid chromatography (HPLC) was developed. In contrast to previously reported methods that analyzed DOX or MMC individually in the plasma, this new HPLC method is able to simultaneously quantitate DOX, MMC and a major cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in various biological matrices (e.g., whole blood, breast tumor, and heart). A dual fluorescent and ultraviolet absorbent probe 4-methylumbelliferone (4-MU) was used as an internal standard (I.S.) for one-step detection of multiple drug analysis with different detection wavelengths. This method was successfully applied to determine the concentrations of DOX and MMC delivered by both nanoparticle and solution approaches in whole blood and various tissues in an orthotopic breast tumor murine model. The analytical method presented is a useful tool for pre-clinical analysis of nanoparticle-based delivery of drug combinations.

This protocol describes an efficient and convenient analytical process of sample extraction and simultaneous determination of multiple drugs, doxorubicin (DOX), mitomycin C (MMC) and a cardio-toxic DOX metabolite, doxorubicinol (DOXol), in the biological samples from a preclinical breast tumor model treated with nanoparticle formulations of synergistic drug combination.

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリー ナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

Evaluation of Nanoparticle Uptake in Tumors in Real Time Using Intravital Imaging

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle uptake in tumors at the microscopic level1,2,3, highlighting the utility of a suitable xenograft model in which to perform detailed uptake analyses. Here, we use high-resolution intravital imaging to evaluate nanoparticle uptake in human tumor xenografts in a modified, shell-less chicken embryo model. The chicken embryo model is particularly well-suited for these in vivo analyses because it supports the growth of human tumors, is relatively inexpensive and does not require anesthetization or surgery 4,5. Tumor cells form fully vascularized xenografts within 7 days when implanted into the chorioallantoic membrane (CAM) 6. The resulting tumors are visualized by non-invasive real-time, high-resolution imaging that can be maintained for up to 72 hours with little impact on either the host or tumor systems. Nanoparticles with a wide range of sizes and formulations administered distal to the tumor can be visualized and quantified as they flow through the bloodstream, extravasate from leaky tumor vasculature, and accumulate at the tumor site. We describe here the analysis of nanoparticles derived from Cowpea mosaic virus (CPMV) decorated with near-infrared fluorescent dyes and/or polyethylene glycol polymers (PEG) 7, 8, 9,10,11. Upon intravenous administration, these viral nanoparticles are rapidly internalized by endothelial cells, resulting in global labeling of the vasculature both outside and within the tumor7,12. PEGylation of the viral nanoparticles increases their plasma half-life, extends their time in the circulation, and ultimately enhances their accumulation in tumors via the enhanced permeability and retention (EPR) effect 7, 10,11. The rate and extent of accumulation of nanoparticles in a tumor is measured over time using image analysis software. This technique provides a method to both visualize and quantify nanoparticle dynamics in human tumors.

We present a novel approach to quantify nanoparticle localization in the vasculature of human xenografted tumors using dynamic, real-time intravital imaging in an avian embryo model.

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

Current technologies for tumor imaging, such as ultrasound, MRI, PET and CT, are unable to yield high-resolution images for the assessment of nanoparticle ...

医学

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being investigated for applications in imaging and therapy. Viral nanoparticles (VNPs) derived from plants can be regarded as self-assembled bionanomaterials with defined sizes and shapes. Plant viruses under investigation in the Steinmetz lab include icosahedral particles formed by Cowpea mosaic virus (CPMV) and Brome mosaic virus (BMV), both of which are 30 nm in diameter. We are also developing rod-shaped and filamentous structures derived from the following plant viruses: Tobacco mosaic virus (TMV), which forms rigid rods with dimensions of 300 nm by 18 nm, and Potato virus X (PVX), which form filamentous particles 515 nm in length and 13 nm in width (the reader is referred to refs. 1 and 2 for further information on VNPs).
From a materials scientist's point of view, VNPs are attractive building blocks for several reasons: the particles are monodisperse, can be produced with ease on large scale in planta, are exceptionally stable, and biocompatible. Also, VNPs are "programmable" units, which can be specifically engineered using genetic modification or chemical bioconjugation methods 3. The structure of VNPs is known to atomic resolution, and modifications can be carried out with spatial precision at the atomic level4, a level of control that cannot be achieved using synthetic nanomaterials with current state-of-the-art technologies.
In this paper, we describe the propagation of CPMV, PVX, TMV, and BMV in Vigna ungiuculata and Nicotiana benthamiana plants. Extraction and purification protocols for each VNP are given. Methods for characterization of purified and chemically-labeled VNPs are described. In this study, we focus on chemical labeling of VNPs with fluorophores (e.g. Alexa Fluor 647) and polyethylene glycol (PEG). The dyes facilitate tracking and detection of the VNPs 5-10, and PEG reduces immunogenicity of the proteinaceous nanoparticles while enhancing their pharmacokinetics 8,11. We demonstrate tumor homing of PEGylated VNPs using a mouse xenograft tumor model. A combination of fluorescence imaging of tissues ex vivo using Maestro Imaging System, fluorescence quantification in homogenized tissues, and confocal microscopy is used to study biodistribution. VNPs are cleared via the reticuloendothelial system (RES); tumor homing is achieved passively via the enhanced permeability and retention (EPR) effect12. The VNP nanotechnology is a powerful plug-and-play technology to image and treat sites of disease in vivo. We are further developing VNPs to carry drug cargos and clinically-relevant imaging moieties, as well as tissue-specific ligands to target molecular receptors overexpressed in cancer and cardiovascular disease.

Viral Nanoparticles for In vivo Tumor Imaging

Plant viral nanoparticles (VNPs) are promising platforms for applications in biomedicine. Here, we describe the procedures for plant VNP propagation, purification, characterization, and bioconjugation. Finally, we show the application of VNPs for tumor homing and imaging using a mouse xenograft model and fluorescence imaging.

のためのウイルス粒子<emインビボ&gt;</em&gt;腫瘍イメージング

The use of nanomaterials has the potential to revolutionize materials science and medicine. Currently, a number of different nanoparticles are being ...

生物工学

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory cytokine interleukin-1 alpha (IL-1&#945;) has been evaluated as an anticancer agent in several preclinical and clinical studies. However, dose-limiting toxicities, including flu-like symptoms and hypotension, have dampened the enthusiasm for this therapeutic strategy. Polyanhydride nanoparticle (NP)-based delivery of IL-1&#945; would represent an effective approach in this context since this may allow for a slow and controlled release of IL-1&#945; systemically while reducing toxic side effects. Here an analysis of the antitumor activity of IL-1&#945;-loaded polyanhydride NPs in a head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) syngeneic mouse model is described. Murine oropharyngeal epithelial cells stably expressing HPV16 E6/E7 together with hRAS and luciferase (mEERL) cells were injected subcutaneously into the right flank of C57BL/6J mice. Once tumors reached 3-4 mm in any direction, a 1.5% IL-1a - loaded 20:80 1,8-bis(p-carboxyphenoxy)-3,6-dioxaoctane:1,6-bis(p-carboxyphenoxy)hexane (CPTEG: CPH) nanoparticle (IL-1&#945;-NP) formulation was administered to mice intraperitoneally. Tumor size and body weight were continuously measured until tumor size or weight loss reached euthanasia criteria. Blood samples were taken to evaluate antitumor immune responses by submandibular venipuncture, and inflammatory cytokines were measured through cytokine multiplex assays. Tumor and inguinal lymph nodes were resected and homogenized into a single-cell suspension to analyze various immune cells through multicolor flow cytometry. These standard methods will allow investigators to study the antitumor immune response and potential mechanism of immunostimulatory NPs and other immunotherapy agents for cancer treatment.

Evaluation of the In vivo Antitumor Activity of Polyanhydride IL-1&#945; Nanoparticles

A standard protocol is described to study the antitumor activity and associated toxicity of IL-1&#945; in a syngeneic mouse model of HNSCC.

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価

Cytokine therapy is a promising immunotherapeutic strategy that can produce robust antitumor immune responses in cancer patients. The proinflammatory ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

がん薬感の有効性を評価<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.
First we describe how to generate subcutaneous tumors in mice, using antigen-negative cell lines as negative controls and antigen-positive cells as positive controls in the same mice for intraindividual comparison. We outline how to administer intravenously near-infrared fluorophore labelled (AlexaFluor680) antigen-specific nanobodies and conventional antibodies. In vivo imaging was performed with a small-animal NIRF-Imaging system. After the in vivo imaging experiments the mice were sacrificed. We then describe how to prepare the tumors for parallel ex vivo analyses by flow cytometry and fluorescence microscopy to validate in vivo imaging results.
The use of the near-infrared fluorophore labelled nanobodies allows for non-invasive same day imaging in vivo. Our protocols describe the ex vivo quantification of the specific labeling efficiency of tumor cells by flow cytometry and analysis of the distribution of the antibody constructs within the tumors by fluorescence microscopy. Using near-infrared fluorophore labelled probes allows for non-invasive, economical in vivo imaging with the unique ability to exploit the same probe without further secondary labelling for ex vivo validation experiments using flow cytometry and fluorescence microscopy.

Validation of Nanobody and Antibody Based In Vivo Tumor Xenograft NIRF-imaging Experiments in Mice Using Ex Vivo Flow Cytometry and Microscopy

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence xenograft imaging experiments in mice using fluorophore labelled nanobodies and conventional antibodies.

ナノボディ及び抗体ベースの検証<em&gt;インビボ</em使用してマウスにおける&gt;腫瘍異種移植NIRFイメージング実験<em&gt;エクスビボ</em&gt;フローサイトメトリーおよび顕微鏡

This protocol outlines the steps required to perform ex vivo validation of in vivo near-infrared fluorescence (NIRF) xenograft imaging experiments in mice ...

<meta charset="utf8"></head><body>転移性乳がん治療のための発がん性miRNA-10bを標的とするナノドラッグ

Monitoring of Nanodrug Accumulation in Murine Breast Cancer Metastases

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have been shown to be associated with the metastatic potential of breast cancer and are implicated in tumor cell migration, invasion, and viability. However, it can be difficult to deliver an inhibitory RNA molecule to the tissue of interest. To overcome this challenge and deliver active antisense oligonucleotides to tumors, we utilized magnetic iron oxide nanoparticles as a delivery platform. These nanoparticles target tissues with increased vascular permeability, such as sites of inflammation or cancer. Delivery of these nanoparticles can be monitored in vivo by magnetic resonance imaging (MRI) due to their magnetic properties. Translation of this therapeutic approach into the clinic will be more accessible because of its compatibility with this relevant imaging modality. They can also be labeled with other imaging reporters such as a Cy5.5 near-infrared optical dye for correlative optical imaging and fluorescence microscopy. Here, we demonstrate that nanoparticles labeled with Cy5.5 and conjugated to therapeutic oligomers targeting oncogenic miRNA-10b (termed MN-anti-miR10b, or &#34;nanodrug&#34;) administered intravenously accumulate in metastatic sites, opening a possibility for therapeutic intervention of metastatic breast cancer.

<meta charset="utf8"></head><body>マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

Here, we describe the protocol for in vivo delivery of magnetic iron oxide nanoparticles carrying RNA oligomers to metastatic breast cancer in animal models, providing a clinically viable approach for the therapeutic silencing of oncogenic nucleic acids.

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

Metastatic breast cancer is a devastating disease with very limited therapeutic options, calling for new therapeutic strategies. Oncogenic miRNAs have ...

評価するための総合的な手順

要約

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肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリーナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

のためのウイルス粒子

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の生体内抗腫瘍活性の評価

がん薬感の有効性を評価

ナノボディ及び抗体ベースの検証

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

評価するための総合的な手順

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肺癌標的化ナノ粒子と光線力学療法の抗がん効能

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリー ナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

生体内イメージングを使ってリアルタイムで腫瘍におけるナノ粒子の取り込みの評価

のためのウイルス粒子

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の 生体内 抗腫瘍活性の評価

がん薬感の有効性を評価

ナノボディ及び抗体ベースの検証

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

マウス乳がん転移におけるナノ薬物蓄積のモニタリング

サンプル抽出、ドキソルビシン、マイトマイシン C 以下の組み合わせへのドラッグデリバリーナノ粒子の担癌マウスの同時のガスクロマトグラフィーによる定量

ポリ無水物IL-1αナノ粒子の生体内抗腫瘍活性の評価