私たちは、優れた技術サポートのためにダニエル・ブカラ、ナタリー・アルトメイヤーとFundaケイに感謝します。私たちは、原稿を編集するためのジョナサン・コットン、グレッグ・ボーデンとポールSoubiranに感謝します。この作品は、CRC 156（プロジェクトC3）を通じてヴェルナーシーメンス財団とエバーハード・カールズ大学テュービンゲン（「」Promotionskolleg「」）の医学部でとDFGによってサポートされていました。

本書に記載されているすべての手順は、実験動物のケアと使用のガイドラインと国際基準に従い、ドイツのテュービンゲン国家委員会の動物福祉倫理委員会によって承認されました。 8〜12週齢のBALB / cおよびC57BL / 6マウスを12時間：12時間明/暗サイクルに保ち、IVCおよび22±1℃の標準環境条件で2〜5の群で水および食べ物は自由にアクセスできます 。 材料準備<ol><li>注射直前にそれぞれのデータシートに従って近赤外蛍光イメージングのためのOI色素を希釈する。 インビボで MMPを測定するための活性化可能なOI色素（680nmでの励起を伴う市販のプローブ）は、1.5mLの1×PBS中で20nmolの濃度で使用する準備ができている。使用する前に、溶液を静かに振り混ぜるかボルテックスする。 OI染料は、光から保護されている場合、最大6ヶ月間2〜8℃で保存することができます。 </li&gt; <li> 静脈内 （IV）注射は、静脈カテーテルを準備します。 0.9％生理食塩水で満たされた20 U（0.5 mL）をインスリンシリンジ（50mLのヘパリンの10個の噴射単位を含有する）、およびポリエチレンカテーテルに取り付けられた30ゲージの針を使用します。 OI染料のマウスあたり2 nmolのの推奨用量を注入します。 </li></ol>関節リウマチや慢性接触過敏反応の2誘導<ol><li> 関節リウマチ： <ol><li> RAを誘導するために1×PBS（200μL）で1：グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（GPI）1に対する抗体（AB）を含む（K / BXNマウス10から得られた）血清の100μLに希釈します。 -80°Cで希釈した血清を保管してください。 RAの誘導のための詳細な手順はMonach らによって記載されています。 8。 </li><li> RAを誘導するために、その尾により穏やかに各マウスを持ち上げ、Tの0日目に希釈した血清を腹腔内（IP）の200μLを注入彼は実験します。注射後、マウスをそのケージに直接戻す。 </li><li>オプションで、AB注射の前に各足首の足首の直径を測定し、「関節炎スコア」を定義する（ 図1A ）。機械的測定装置（マイクロメーター）を用いてGPI血清後6日目まで毎日足首腫脹の測定を継続する。 </li><li> RAマウスの尾静脈に生体内 MMP活性を測定するために、活性化可能なOI色素を注入する（ステップ1.1~1.2） GPI血清注射後5日目およびコントロールマウスの尾静脈に注射した。尾静脈注射の24時間後に光学イメージング実験を行う。 </li></ol></li><li> 接触過敏反応： <ol><li> C57BL / 6マウスの感作のために、アセトン/オイルの4：1混合物に溶解した5％TNCB溶液を調製する。 </li><li> 100％酸素（1.5L /分）で気化した1.5％イソフルランを用いてC57BL / 6マウスを麻酔する。マウスを麻酔したら、それを自己狂犬病<html> （1.5体積％のイソフルランチューブに接続した切断5mLのポリエチレンシリンジ）で麻酔を維持する。麻酔をかけた動物に獣医用軟膏を塗布し、麻酔下で眼の乾燥を防ぎます。 </li><li>小さな動物の毛のトリマーを使用して慎重に（2×2 cm）腹部を剃る。動物の中で非特異的な蛍光シグナルを引き起こし、研究結果に影響を与える可能性があるため、皮膚を傷つけないでください。 </li><li>動物を感作するために100μLピペットを使用して、剃毛した腹部領域で5％TNCB溶液80μLをゆっくりと適用する。角膜の損傷を避けるために、マウスの目が寝具に接触しないように注意しながら、ケージに軽く戻してください。 </li><li>感作の6日後に、1％TNCB溶液（アセトン/オイルの9：1混合物に溶解）を調製し、ピペットを用いて右耳に20μLをかけて急性および慢性CHSRを誘発する。「&gt; 1 <ol><li> 100μLピペットを用いて、1％TNCB溶液20μLと右耳の両側に第1チャレンジで始まり、CHR（ 図1B）を引き出すために5回（感作後15日目）に毎秒日チャレンジを繰り返します。マイクロメータ測定装置を使用して、毎日の耳の厚さを測定します。 </li></ol></li><li> CHRマウスにおいてチャレンジ後12時間のin vivoでの MMPの活性を測定する活性化OI色素（680nmにおける励起を有する市販のプローブ）（ステップ1.1から1.2）を注入します。光学イメージング実験の24時間後に尾静脈注射を行う（IV）。 </li></ol></li></ol>光イメージングのための3動物の準備<ol><li>スイッチマウス固形飼料に使用OI剤の蛍光信号の低または非蛍光飼料（ 例えば 、遊離マンガン）（700nmの周りの）自家蛍光の干渉を回避するために（少なくとも3日間撮影前）。 </li><li>で動物を置きます酸素（1.5L /分）で気化した1.5vol％イソフルラン（酸素は空気で置換することができるが、1回の実験で標準化する必要がある）を用いて麻酔する。 </li><li>マウスが目に見えて麻酔されたら、それを自作ノーズコーン（1.5体積％イソフルランチューブに接続したカット5mLポリエチレンシリンジで構築）に置き、麻酔を維持する。 </li><li>小動物ヘアトリマーを使用して、動物を注意深く標的部位（2cm×2cm）に剃ります。動物の中で非特異的な蛍光シグナルを引き起こし、研究結果に影響を与える可能性があるため、皮膚を傷つけないでください。 注：HIRは、関心領域（ROI）に依存して、OI中に蛍光シグナルを吸収することができる（マウス株に依存し、多かれ少なかれ吸収が観察される）。 </li><li> 静脈内注射のために、暖かい水の中にマウスの尾を置き、血管拡張を誘発し、アルコールで注射部位の皮膚を静かに浄化し、カテーテルを尾の先端サイト。尾静脈に20°の角度で、針の端を「カット」と注射器を再懸濁することによってカテーテルの正確な配置をテスト置きます。 </li><li>カテーテルが正しく配置されている場合は、シリンジを交換し、OIのプローブ（2ナノモル）を注入します。注入後、シリンジを交換し、完全にポリエチレンチューブのデッドボリュームをクリアするために、0.9％の食塩水の25μLを注入。 注： インビボで MMP活性を測定するために使用OI色素（680nmにおける励起を有する市販のプローブ）の組織半減期は72時間です。完全なクリアランスを確保するために、色素の再注入は、以前の7日前に注射後よりも推奨されていません。 </li></ol> 4.光イメージング<ol><li>視野（FOV）の中心でOI-スキャナのブラックボックスに黒いプラスチックまたは紙シートを置きます。 </li><li>測定プロトコルを設定し、右の波長を選択し（励起：680±10 nmおよび電子ミッション：700±10 nm）を、撮像パラメータ。 注：一部のOIシステムでは、複数の画像形成色素の設定が事前に定義されています。 </li><li>蛍光イメージングのために正しいプロトコルを選択するために、（製造業者によって提供された）画像ソフトウェアを開き、システムを初期化します。ほとんどのCCDカメラは、その使用温度まで冷却する必要があり、これは10分かかることがあります。システムの準備ができるまで、信頼性の高い結果を得るために、待ちます。 </li><li> in vivoイメージングシステム取得制御パネルがポップアップ観察し、選択された各フィルタ対は、配列中の1枚の画像を表します。この場合には、を有する市販の染料及びそれぞれ680±10nmから700±10nmでの励起および発光波長のフィルタのペアで一つの画像を取得し、（押し「を取得配列」）の測定を開始します。より詳細な手順については、製造元のマニュアルを参照してください。 </li><li>適切な画像にラベルを付け、「イメージの編集に情報を保存します「ラベル取得」ウインドウが表示され、「取得シーケンス」の後にポップアップ表示されます。 </li><li> OI色素を注射する前に各動物のベースラインスキャンを行うか、またはナイーブコントロール動物を用いてバックグラウンドシグナルを区別する。 </li><li> OI色素の尾静脈注射後、OIシステムにおいて最も高いシグナルを測定する位置で、動物をFOVの中心に置き、測定を開始する。 注記：重要：低体温はイメージング剤の分布に大きな影響を与える可能性があります。動物の低体温を避けるために、ステージが37℃まで加熱されていることを確認してください。イメージングは​​、1〜5匹のマウスの群の動物と同時に行うことができる。同時に測定する動物の数に応じて、FOVのサイズを選択します。各マウスが見えるかどうかを確認するには、明るいフィールド画像を撮ることができます。 </li></ol> 5.データ解析注：次の画像ソフトウェアを使用してデータ分析を実行します製造業者のプロトコル。 <ol><li> RAの測定には、 図2に示すように校正された光子放射の単位を使用しますが、慢性CHSRは信号強度として％（効率）で描かれます。 </li><li> ROIを手動で描画するには、ツールプレートを使用します。 RA画像の分析のために、標準化された円を使用し、各動物のすべての足首および足の中で最も高いシグナルの周りに配置する。 CHSRを分析するには、明視野画像に従って左右の耳全体にROIを配置します。 </li><li>描かれた特定のROIの光子放出またはシグナル強度値を測定するには、「測定」を押します。システムは、描写的な統計解析のために描かれたROIの値を提供する。 </li></ol>

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OIは、前臨床研究インビボ分子イメージングにおける非侵襲性のために非常に有用な迅速かつ安価なツールです。 OIの特定の強さは、炎症応答のような非常に動的なプロセスを監視する能力です。また、OIは、1つの数日から数週間の範囲の、長期間にわたって病気の経過を追跡することを可能にします。 それは非常に時間とコスト効率的であるようにOIは、...

関節リウマチ（RA）または尋常性乾癬などの自己免疫疾患は、遅延型過敏症反応（DTHR）として分類される。 RAは、びらん性滑膜炎および関節破壊によって特徴付けられる一般的な自己免疫疾患である。炎症細胞の浸潤と増殖、炎症細胞の発現の増加がパンヌス形成、軟骨および骨破壊をもたらすことを実証している2。マトリックスメタロプロテイナーゼ（MMPs）によるコラーゲンなどの細胞外マトリックス分子の切断は、組織の変換や血管新生に不可欠であり、組織の破壊を引き起こす。 5、6接触過敏反応（CHR）は、酸化的バーストをもたらす好中球の凝集によって特徴付けられる。 RAと同様に、CHRのMMPはインボルブ慢性炎症を確立するために、組織変換、細胞移動および血管新生に供される。 RAを調べるために、グルコース-6-リン酸イソメラーゼ（GPI） - 血清注入マウスモデルを使用した。 GPIに対する抗体を含有するトランスジェニックK / BxNマウスの血清をナイーブBALB / cマウスに注射した後、GPI血清注入後6日目に最大24時間以内にリウマチ性炎症が発生し始めた（1.1参照）。慢性CHRを分析するために、C57BL / 6マウスを腹部のトリニトロクロロベンゼン（TNCB）で感作した。右耳に感作後1週間目から5回までチャレンジした（1.1および1.2も参照）。 非侵襲的小動物OIは、前臨床研究で主に使用されている蛍光、化学発光および生物発光シグナルの生体内調査に基づく技術である。得られた半定量的データは、分子健康な器官および組織におけるウラル機構ならびに罹患実験動物モデル、及び縦フォローアップ測定値（ 例えば 、インビボでの治療的応答プロファイルを評価するため）を可能にします。縦断的研究の大きな利点は、同じ動物ではなく、時点ごとに異なるマウスを用いて、いくつかの時点でフォローアップ試験で測定することができるように、動物の数が減少することです。 OIの解像度は、臓器の詳細な機能イメージングおよび実験動物におけるさらに小さな組織構造を可能にします。 狭い透過スペクトルを持つ特定の励起および発光フィルタの使用、遮光「暗箱」と-70℃に多くの装置で冷却された敏感な電荷結合素子（CCD）カメラ、によって散乱された光に対する保護、蛍光シグナルの高度に特異的かつ高感度な測定が可能となります。 excitation-と蛍光剤を使用し、近赤外蛍光ウィンドウの発光スペクトル（650から950 nm）は、信号対雑音比を大幅に向上させることができます。近赤外蛍光ウィンドウはヘモグロビン及び水による信号の比較的低い吸収ならびに低バックグラウンド自己蛍光によって特徴付けられます。 9これは、小動物の組織で最大2センチ侵入深さを可能にします。 OI-プローブが直接（蛍光標識抗体による）目標に対処することができるか、（プロテアーゼにより）標的組織中で活性化することができます。活性化OIプローブを伴う別のドメインへの分子内励起エネルギーを伝達消光部分、に蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）にそれらの不活性化形態の光学的にサイレントです。染料は（例えばプロテアーゼによって）切断された場合にエネルギーはもはや分子内に移し、蛍光シグナルがOIによって検出することができるではありません。これは、高specificitとOIプローブの設計を可能に明確な生物学的プロセスと優れた信号対雑音比が得られます。 以下のプロトコルは、動物の調製、in vivoでの MMP-2、-3、-9および-13活性および炎症の2つの実験モデル（RA、CHR）を画像化するための活性化可能OIプローブを用いたOI測定を詳細に説明する。

<table><tbody><tr><td>Cornergel</td><td>Gerhard Mann GmbH</td><td>1224635</td><td>ophthalmic ointment&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Forene</td><td>Abbott GmbH</td><td>4831850</td><td>isoflurane</td></tr><tr><td>U40 insulin syringe</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>324876</td><td></td></tr><tr><td>Heparin</td><td>Sintetica</td><td>6093089</td><td></td></tr><tr><td>High-Med-PE 0.28 x 0.61 mm</td><td>Reichelt Chemietechnik GmbH+Co</td><td>28460</td><td>polyethylene tubing, inner diameter 0.28 mm, outer diameter 0.61&amp;nbsp;mm&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 30 G</td><td>Becton Dickinson &amp;amp; Co. Ltd.</td><td>305106</td><td>30 G injection cannula</td></tr><tr><td>RTA-0011 isoflurane vaporizer</td><td>Vetland Medical Sales and Services LLC</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>Artagain drawing paper</td><td>Strathmore Artist Paper</td><td>446-8</td><td>coal black</td></tr><tr><td>IVIS Spectrum</td><td>Perkin Elmer</td><td>124262</td><td>Optical imaging system</td></tr><tr><td>BD Regular Bevel Needles, 25 G</td><td>Becton Dickinson and Company</td><td>305122</td><td></td></tr><tr><td>2-Chloro-1,3,5-trinitrobenzene</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td>7987456F</td><td>TNCB</td></tr><tr><td>MMPSense 680</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td>NEV10126</td><td>fluorescent imaging dye</td></tr><tr><td>Oditest&amp;nbsp;</td><td>Koreplin GmbH</td><td>C1X018</td><td>mechanical measurment</td></tr><tr><td>Miglyol 812</td><td>SASOL</td><td>-</td><td>Oil</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;BALB/C, C57BL/6</td><td>Charles River Laboratories&amp;nbsp;</td><td>-</td><td>Mice used for experiements</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich GmbH</td><td></td><td>For dilution of the RA serum&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Pipette (100 &amp;micro;L)</td><td>Eppendorf&amp;nbsp;</td><td></td><td>Used for TNCB application&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>shaver&amp;nbsp;</td><td>Wahl&amp;nbsp;</td><td>9962</td><td>Animal hair trimmer</td></tr><tr><td>Living Image&amp;nbsp;</td><td>Perkin Elmer&amp;nbsp;</td><td></td><td>Imaging software to measure OI</td></tr></tbody></table>

non-invasive in vivo fluorescence optical imaging of inflammatory mmp activity using an activatable fluorescent imaging agent

この論文では、炎症の2つの異なるマウスモデル：慢性関節リウマチ（RA）および接触（慢性関節リウマチ） におけるin vivo蛍光イメージング（OI） を介して 、活性化可能な蛍光プローブによるマトリックスメタロプロテイナーゼ（MMP）活性を画像化するための非侵襲的方法を記載する。過敏反応（CHR）モデル。近赤外（NIR）ウィンドウ（650〜950nm）の波長を持つ光は、650nm未満の波長に比べて、より深い組織浸透と最小限の信号吸収を可能にします。蛍光OIを用いることの主な利点は、異なる動物モデルで安価で、迅速かつ容易に実施できることである。 活性化可能な蛍光プローブは、それらの不活性化状態では光学的にサイレントであるが、プロテアーゼによって活性化されると高度に蛍光性になる。活性化されたMMPは、組織破壊をもたらし、遅延型過敏症反応（DTHR）（例えば、RAおよびCHR）における疾患の進行にとって重要な役割を果たす。さらに、MMPは、キー軟骨および骨の分解のためのプロテアーゼおよび炎症性サイトカインに応答して、マクロファージ、線維芽細胞や軟骨細胞によって誘導されます。ここでは、MMP-2のようなキーのMMPによって活性化されたプローブ、-3、-9および-13を使用して、同様に6日間の疾患誘導後RAおよび対照マウスにおけるMMP活性の近赤外蛍光OIのための撮影プロトコルを記述する急性（1Xチャレンジ）と健康の耳に比べ右耳の慢性（5倍の挑戦）CHRを持つマウスのように。

ナイーブBALB / cマウスにおいて関節リウマチ（RA）を誘発するために、0日目にGPIに対する自己抗体（1×PBSで1：1希釈）を腹腔内注射した。このGPI血清における最大炎症（足首腫脹） RAモデルは注入11日後に投与される。したがって、2nmolの活性化可能なOI色素を調製し、5日目に関節炎マウスおよび健常対照動物の尾静脈に静脈注射した。注射の24...

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Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

この論文は、炎症の二つの異なる実験モデルにおいて、キーマトリックスメタロプロテアーゼのインビボ活性を視覚化するために活性化光イメージングプローブを用いた蛍光イメージングの応用について説明します。

非侵襲的<em&gt;インビボ</em&gt;活性化可能な蛍光イメージング剤を用いた炎症性MMP活性の蛍光イメージング

This paper describes a non-invasive method for imaging matrix metalloproteinases (MMP)-activity by an activatable fluorescent probe, via in vivo ...

non-invasive-vivo-fluorescence-optical-imaging-inflammatory-mmp

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Non-invasive In Vivo Fluorescence Optical Imaging of Inflammatory MMP Activity Using an Activatable Fluorescent Imaging Agent

8.7K ビュー.  Eberhard Karls University of Tübingen. この論文は、炎症の二つの異なる実験モデルにおいて、キーマトリックスメタロプロテアーゼのインビボ活性を視覚化するために活性化光イメージングプローブを用いた蛍光イメージングの応用について説明します。 

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Long-term Intravital Immunofluorescence Imaging of Tissue Matrix Components with Epifluorescence and Two-photon Microscopy

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue function during development and organ homeostasis. It does so by acting via biochemical, biomechanical, and biophysical signaling pathways, such as through the release of bioactive ECM protein fragments, regulating tissue tension, and providing pathways for cell migration. The extracellular matrix of the tumor microenvironment undergoes substantial remodeling, characterized by the degradation, deposition and organization of fibrillar and non-fibrillar matrix proteins. Stromal stiffening of the tumor microenvironment can promote tumor growth and invasion, and cause remodeling of blood and lymphatic vessels. Live imaging of matrix proteins, however, to this point is limited to fibrillar collagens that can be detected by second harmonic generation using multi-photon microscopy, leaving the majority of matrix components largely invisible. Here we describe procedures for tumor inoculation in the thin dorsal ear skin, immunolabeling of extracellular matrix proteins and intravital imaging of the exposed tissue in live mice using epifluorescence and two-photon microscopy. Our intravital imaging method allows for the direct detection of both fibrillar and non-fibrillar matrix proteins in the context of a growing dermal tumor. We show examples of vessel remodeling caused by local matrix contraction. We also found that fibrillar matrix of the tumor detected with the second harmonic generation is spatially distinct from newly deposited matrix components such as tenascin C. We also showed long-term (12 hours) imaging of T-cell interaction with tumor cells and tumor cells migration along the collagen IV of basement membrane. Taken together, this method uniquely allows for the simultaneous detection of tumor cells, their physical microenvironment and the endogenous tissue immune response over time, which may provide important insights into the mechanisms underlying tumor progression and ultimate success or resistance to therapy.

The extracellular matrix undergoes substantial remodeling during wound healing, inflammation and tumorigenesis. We present a novel intravital immunofluorescence microscopy approach to visualize the dynamics of fibrillar as well as mesh-like matrix components with high spatial and temporal resolution using epifluorescence or two-photon microscopy.

落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

Besides being a physical scaffold to maintain tissue morphology, the extracellular matrix (ECM) is actively involved in regulating cell and tissue ...

生物工学

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

免疫・感染学

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent marker. Mouse models (brain tumor and arthritis) were used to evaluate the usefulness of this method. Saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles tagged with CellVue Maroon (CVM) fluorophore were administered intravenously. Animals were then placed in the rotational holder (MARS) of the in vivo imaging system. Images were acquired in 10&#176; steps over 380&#176;. A rectangular&#160;region of interest (ROI) was placed across the full image width at the model disease site. Within the ROI, and for every image, mean fluorescence intensity was computed after background subtraction. In the mouse models studied, the labeled nanovesicles were taken up in both the orthotopic and transgenic brain tumors, and in the arthritic sites (toes and ankles). Curve analysis of the multi angle image ROIs determined the angle with the highest signal. Thus, the optimal angle for imaging each disease site was characterized. The MAROI method applied to imaging of fluorescent compounds is a noninvasive, economical, and precise tool for in vivo quantitative analysis of the disease states in the described mouse models.

In Vivo Optical Imaging of Brain Tumors and Arthritis Using Fluorescent SapC-DOPS Nanovesicles

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo quantitation of a fluorescent marker delivered by saposin C (SapC)-dioleoylphosphatidylserine (DOPS) nanovesicles. Employing mouse models of cancer and arthritis, we demonstrate how the MAROI signal curve analysis can be used for the precise mapping and biological characterization of disease processes.

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

We describe a multi-angle rotational optical imaging (MAROI) system for in vivo monitoring of physiopathological processes labeled with a fluorescent ...

医学

In Vivo Two-Color 2-Photon Imaging of Genetically-Tagged Reporter Cells in the Skin

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located in. Although traditional imaging techniques are useful in identifying protein interactions and morphology in fixed tissue, they are not able to give insight as to how quickly cells are able to bind and uptake proteins, and once activated how their morphology changes in vivo. In the present study, we ask 2 major questions: 1) what is the time-course of fibroblast activation via toll-like receptor-4 (TLR4) and lipopolysaccharide (LPS) interaction and 2) how do these cells behave once activated? Using 2-photon imaging, we have developed a novel technique to assess the ability of LPS-FITC to bind to its cognate receptor, TLR4, expressed on peripheral fibroblasts in the genetic reporter mouse line; FSP1cre; tdTomatolox-stop-lox&#160;in vivo. This unique approach allows researchers to create in-depth, time-lapse videos and/or pictures of proteins interacting with live cells that allows one to have an increased level of granularity in understanding how proteins can alter cellular behavior.

Morphological changes occur in immune responsive fibroblast cells following activation and promote alterations in cellular recruitment. Utilizing 2-photon imaging in conjunction with a genetically engineered Fibroblast-specific protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) mouse line and green fluorescently tagged lipopolysaccharide-FITC, we can illustrate highly specific uptake of lipopolysaccharide in dermal fibroblasts and morphological changes in vivo.

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

Fibroblasts are mesenchymal cells that change their morphology upon activation, ultimately influencing the microenvironment of the tissue they are located ...

Bioluminescence and Near-infrared Imaging of Optic Neuritis and Brain Inflammation in the EAE Model of Multiple Sclerosis in Mice

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing motor function deficits are basic readouts of the immune-mediated inflammation of the spinal cord. However, scores and body weight do not allow for an in vivo assessment of brain inflammation and optic neuritis. The latter is an early and frequent manifestation in about 2/3 of MS patients. Here, we show methods for bioluminescence and near-infrared live imaging to assess EAE evoked optic neuritis, brain inflammation, and blood-brain barrier (BBB) disruption in living mice using an in vivo imaging system. A bioluminescent substrate activated by oxidases primarily showed optic neuritis. The signal was specific and allowed the visualization of medication effects and disease time courses, which paralleled the clinical scores. Pegylated fluorescent nanoparticles that remained within the vasculature for extended periods of time were used to assess the BBB integrity. Near-infrared imaging revealed a BBB leak at the peak of the disease. The signal was the strongest around the eyes. A near-infrared substrate for matrix metalloproteinases was used to assess EAE-evoked inflammation. Auto-fluorescence interfered with the signal, requiring spectral unmixing for quantification. Overall, bioluminescence imaging was a reliable method to assess EAE-associated optic neuritis and medication effects and was superior to the near-infrared techniques in terms of signal specificity, robustness, ease of quantification, and cost.

We show a technique for in vivo live bioluminescence and near-infrared imaging of optic neuritis and encephalitis in the experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) model for multiple sclerosis in SJL/J mice.

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in SJL/J mice is a model for relapsing-remitting multiple sclerosis (RRMS). Clinical EAE scores describing ...

Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not routinely employed in animal models. Conventional experimental readouts often rely on post mortem and ex vivo analyses, which prevent intra-individual follow-up examinations and increase the number of study animals needed. Fluorescence-mediated tomography enables the non-invasive, repetitive, quantitative, three-dimensional assessment of fluorescent probes. It is highly sensitive and permits the use of molecular makers, which allows for the specific detection and characterization of distinct molecular targets. In particular, targeted probes represent an innovative tool for analyzing gene activation and protein expression in inflammation, autoimmune disease, infection, vascular disease, cell migration, tumorigenesis, etc. In this article, we provide step-by-step instructions on this sophisticated imaging technology for the in vivo detection and characterization of inflammation (i.e., F4/80-positive macrophage infiltration) in a widely used murine model of intestinal inflammation. This technique might also be used in other research areas, such as immune cell or stem cell tracking.

Target-specific probes represent an innovative tool for analyzing molecular mechanisms, such as protein expression in various types of disease (e.g., inflammation, infection, and tumorigenesis). In this study, we describe a quantitative three-dimensional tomographic assessment of intestinal macrophage infiltration in a murine model of colitis using F4/80-specific fluorescence-mediated tomography.

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

Visualization of Inflammatory Caspases Induced Proximity in Human Monocyte-Derived Macrophages

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct regulation of inflammatory signaling and is activated by proximity-induced dimerization following recruitment to inflammasomes. Caspase-1 is abundant in the monocytic cell lineage and induces maturation of the pro-inflammatory cytokines interleukin (IL)-1&#946; and IL-18 to active secreted molecules. The other inflammatory caspases, caspase-4 and -5 (and their murine homolog caspase-11) promote IL-1&#946; release by inducing pyroptosis. Caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is a tool used to measure inflammatory caspase induced proximity as a readout of caspase activation. The caspase-1, -4, or -5 prodomain, which contains the region that binds to the inflammasome, is fused to non-fluorescent fragments of the yellow fluorescent protein Venus (Venus-N [VN] or Venus-C [VC]) that associate to reform the fluorescent Venus complex when the caspases undergo induced proximity. This protocol describes how to introduce these reporters into primary human monocyte-derived macrophages (MDM) using nucleofection, treat the cells to induce inflammatory caspase activation, and measure caspase activation using fluorescence and confocal microscopy. The advantage of this approach is that it can be used to identify the components, requirements, and localization of the inflammatory caspase activation complex in living cells. However, careful controls need to be considered to avoid compromising cell viability and behavior. This technique is a powerful tool for the analysis of dynamic caspase interactions at the inflammasome level as well as for the interrogation of the inflammatory signaling cascades in living MDM and monocytes derived from human blood samples.

This protocol describes the workflow to obtain monocytes-derived macrophages (MDM) from human blood samples, a simple method to efficiently introduce inflammatory caspase Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) reporters into human MDM without compromising cell viability and behavior, and an imaging-based approach to measure inflammatory caspase activation in living cells.

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

Inflammatory caspases include caspase-1, -4, -5, -11, and -12 and belong to the subgroup of initiator caspases. Caspase-1 is required to ensure correct ...

非侵襲的ACL損傷と手術がマウスのプロテアーゼ活性に及ぼす影響

Non-Invasive Compression-Induced Anterior Cruciate Ligament (ACL) Injury and In Vivo Imaging of Protease Activity in Mice

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within 10-20 years following injury. Understanding the early biological processes initiated by joint injuries (e.g., inflammation, matrix metalloproteinases (MMPs), cathepsin proteases, bone resorption) is crucial for understanding the etiology of PTOA. However, there are few options for in vivo measurement of these biological processes, and the early biological responses may be confounded if invasive surgical techniques or injections are used to initiate OA. In our studies of PTOA, we have used commercially available near-infrared protease activatable probes combined with fluorescence reflectance imaging (FRI) to quantify protease activity in vivo following non-invasive compression-induced ACL injury in mice. This non-invasive ACL injury method closely recapitulates clinically relevant injury conditions and is completely aseptic since it does not involve disrupting the skin or the joint capsule. The combination of these injury and imaging methods allows us to study the time course of protease activity at multiple time points following a traumatic joint injury.

著者スポットライト:変形性関節症の進行に対するACL損傷の初期イベントと長期的影響の調査

Non-invasive ACL injury is a reliable and clinically relevant method for initiating post-traumatic osteoarthritis (PTOA) in mice. This injury method also allows for in vivo quantification of protease activity in the joint at early time points post-injury using protease-activatable near infrared probes and fluorescence reflectance imaging.

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

Traumatic joint injuries such as anterior cruciate ligament (ACL) rupture or meniscus tears commonly lead to post-traumatic osteoarthritis (PTOA) within ...

非侵襲的

要約

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落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

非侵襲的

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落射蛍光による組織マトリックスのコンポーネントと二光子顕微鏡の長期生体内免疫蛍光イメージング

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

蛍光SAPC-DOPSナノベシクルを用いて脳腫瘍、関節炎のin vivo光イメージング中

皮膚における遺伝的にタグ付けされたレポーター細胞の生体内2色2光子イメージング

マウスにおける多発性硬化症のEAEモデルにおける視神経炎と脳炎症の生物発光と近赤外イメージング

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

ヒト単球由来マクロファージにおける炎症性カスパーゼ誘導近接の可視化

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

マウスにおける非侵襲的圧迫誘発性前十字靭帯(ACL)損傷とプロテアーゼ活性の in vivo イメージング

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光