優れたテクニカル サポート、さんソニア Dufentester、さんエルケ ・ ウェーバーと夫人クローディア Niepagenkämper に感謝します。

すべての動物実験は、Landesamt für Natur、ドイツ動物保護法 (Tierschutzgesetz) によると環 und Verbraucherschutz (LANUV) ノルトライン ・ ヴェストファーレン州によって承認されました。
1. 材料と実験のセットアップ
<ol>
	<li>動物の世話。
	<ol>
		<li>20-25 g の体重で (例えばC57BL/6) に任意の DSS 感受性系統の性別と年齢をマッチさせたマウスを使用します。</li>
		<li>ローカル動物のケアのガイドラインに従ってマウス実験群とハウスあたり少なくとも 5 つ以上のマウスを計画します。</li>
		<li>ダイエットとオートクレーブ飲料水広告自由標準的な齧歯動物の食事を提供します。</li>
		<li>標準的な食事を削除し、腔内自動蛍光を減らすためにスキャンする前に、少なくとも 3 日間無料のアルファルファの食事でそれを置き換えます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>急性 DSS 誘発大腸炎の誘導。
	<ol>
		<li>DSS の 2 g を溶解 (分子量 40,000 〜 ダ) 2% (w/v ソリューション) を取得するオートクレーブ飲料水 100 ml。</li>
		<li>DSS ソリューション専用のマウスの酒の電源を記入し、推定 5 mL 1 日あたりマウスごとの液体の。コントロール マウス10DSS せず同じ飲料水を提供します。 注: は、実験の終わりまで毎日マウスを監視します。初期体重の 20% 以上を失うことまたはそれが瀕死になるマウスを安楽死させる (すなわち、永続的に減少の動き、姿勢を猫背、コートを建てる不自然な呼吸法、著しく) 動物に該当するローカルのガイドラインによると福祉。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光を介した断層レントゲン写真撮影の準備。
	<ol>
		<li>目的とする抗体 (例えばラット抗マウス F4/80) 蛍光色素をラベル (例えばCyanine7、λ励起: 750 nm、λ放出: 776 nm) 製造元のプロトコルで説明したよう。適切な透析膜で浄化された抗体の dialyze (細孔サイズ &#60; 50 100 kDa) 少なくとも 2 時間または一晩の 0.15 M 塩化ナトリウムの 1 L に対して。<ol>
			<li>0.1 M NaHCO3の 1 L に抗体を転送し、少なくとも 2 時間の dialyze。</li>
			<li>ジメチルスルホキシド (DMSO) で蛍光染料の必要な量を解散 (抗体の 10.8 mg μ L/) 抗体溶液を加えると。20 モル過剰色素とタンパク質比は 1:3 を達成するために蛍光染料を使用します。</li>
			<li>1 h. 無標号の抗体を削除は、0.15 M ナトリウムの 1 L に対して透析か PD 10 脱塩カラムを使用して、4 ° C で暗闇の中でインキュベートし、生体内でアプリケーションのリン酸緩衝生理食塩水 (PBS) で解決します。</li>
			<li>吸光光度法による最終的な抗体濃度とラベリングの比率を決定します。</li>
			<li>250 330 nm の吸収でタンパク質濃度を測定し、染料による追加吸収を検討します。280 に極大吸収を修正 750 で最大の吸収の 11% (タンパク質) nm nm (次の手順) Cyanine7 の分類のため。</li>
			<li>測定 250 800 nm (通常 1:10) 化合物の希釈と 750 Cyanine7 の濃度を抽出 nm。</li>
			<li>として色素とタンパク質比を決定する: 染料/抗体 = 750 で最大吸収 nm/200,000/(280 最大吸収 nm - 750 で最大吸収 x 0.11 nm)/170,000。</li>
			<li>4 ° C で抗体溶液を保持し、注入前に漂白を避けるために光からシールドします。</li>
		</ol>
		</li>
		<li>それが使用されるまで注入と光からの盾の直前に滅菌注射器に必要な抗体の解決の容積を読み込みます。</li>
		<li>プローブ注入の最適なタイミングとトレーサー動態に応じて、スキャンの手順を決定します。</li>
		<li>酸素吸入 1.5 2.5% イソフルランを用いたマウスを麻酔安全標識抗体の尾静脈注射用専用落を置くか。</li>
		<li>フルレングスの抗体、標識抗体、少なくとも 24 h、スキャンする前にマウス大腸炎における抗マウス F4/80 マクロファージ可視化などを注入します。マウスを静脈注射 (静注) 尾経由で 2.0 nmol の色素に対応する額の標識抗体を静脈。</li>
		<li>使用同様に標識非特異的抗体 (例えば、ラット IgG または一次抗体遺産に対応する別のアイソタイプ) 線量のアイソタイプ コントロールとして特定のプローブと同等。 注:生体内での結果をスキャン制御化合物の注入を画像データ特定のプローブの解釈のための参考資料として提供することができます後。</li>
		<li>光の反射・吸収を最小限に抑えるため腹部の動物の毛皮を剃る電気かみそりを使用します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. 技術的な装置
<ol>
	<li>小動物蛍光 (図 4) の獣医蛍光を介したトモグラフィ (FMT) デバイスを使用します。</li>
	<li>「新研究」をクリックしてしてプロジェクトごとに新しい研究を作成ボタンをクリックし、、撮像パラメーターおよび将来の参考のための線量を含む関連するトレーサー研究説明に含めます。</li>
	<li>この研究の中で「新しい研究グループ」をクリックするとそれぞれの研究デザイン (例えば、特定のトレースと非特異的アイソタイプ コントロール) によると研究グループを作成するボタン。動物のそれぞれの番号を持つ各研究グループを装備します。</li>
	<li>トレーサーの構成要素のシステムを調整します。<ol>
		<li>ラベルのバリエーションの正規化し、大井データから定量的測定を有効にするのにトレーサーの各バッチのキャリブレーションを実行します。</li>
		<li>個々 のシステムの校正用測定器メーカーのガイダンスに従ってください。「新しいトレーサーを追加」を選択する、システムは手順のガイドを提供します。応用抗体溶液の希釈と計算される絶対プローブのトレーサー濃度を提供します。</li>
		<li>FMT、(重要な組織に似ている)、定義済みの厚さと吸収特性の組織模倣ファントムを使用し、使用される抗体の溶液の体積でそれを埋めます。FMT のデバイスでこれを測定します。 注: 将来体内測定から絶対トレーサー濃度を計算するのに指定されたプローブは、一緒に指定された濃度の基準値の測定は、システムが使用されます。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>スリーブ検査カセットを使用し温度 42 ° C 注: これは、検査中に低体温になるからマウスを防ぎます。</li>
</ol>
3. 動物の麻酔
<ol>
	<li>1.5-2% vol % イソフルラン ([2-chloro-2-(difluoromethoxy)-1,1,1-trifluoro-ethane]) マウスを麻酔する 1.5 L O2最低の連続的な流れを使用してください。</li></ol>簡単に麻酔の深さをコントロールし、スタッフの露出を最小限に抑えるため齧歯動物麻酔 (イソフルラン気化器) の特別に設計された吸入システムを使用します。
	<li>防漏誘導チャンバーにマウスを置き、イソフルラン供給 (100% (v/v)、酸素 3 L/分で 5 vol %) 用気化器入れます。リカンベントと無意識になるまで、マウスを監視します。</li>
	<li>100 %v/v、1.5 の vol %、検査中に動きの人工物を最小限に抑えるために 1.5 L/分の酸素投与のノーズコーンを介して連続イソフルラン吸入とトモグラフィーの検討カセットに配置します。5 分よりも長く持続する手順、角膜の損傷を防ぐためマウスの目に眼軟膏を適用します。</li>
	<li>反射神経をチェックすることによって麻酔の深さを評価します。その背面にマウスを置く麻酔で十分な場合、マウスがにしないでください。その足の指の間そっとマウスをピンチします。麻酔は十分ですが、脚は撤退 (外科的許容範囲のステージ) をできません。</li>

4. 蛍光を介した断層レントゲン写真撮影スキャン
注: 適応、この FMT システムに固有の次の詳細については、必要に応じて、代替蛍光反射イメージング デバイスまたは FMT システムの研究 (材料の表を参照してください)。
<ol>
	<li>検査カセットにその背中に麻酔下のマウスを置きます。</li>
	<li>スキャンの手順を実行します。<ol>
		<li>イメージング システムにカセットを挿入し、連続的な麻酔を確実にすぐにそれを閉じます。以前作成した研究グループから適切なサンプルを選択します。トレーサー濃度の値は正しく計算するドロップ ダウン メニューから管理されるトレーサーを選択します。</li>
		<li>適切な波長の蛍光反射率画像を取得 (720 nm Cyanine7) スキャン計画・概要」イメージの取得」ボタンをクリックしてスキャン フィールド。</li>
		<li>スキャン フィールド蛍光反射イメージ上のオーバーレイとして表示されますを参照してください。(例えば、コロンまたは腹部)、関心の領域に調整空気または残りの毛皮の領域を回避します。イメージ ターゲットに応じて画像数データ ポイント スキャン フィールド内から選択して設定粗い右側のメニューの中、細かいスキャン フィールドの解像度に。 注意: は、細かいスキャン フィールド可能性があります大幅に長くスキャン時間を犠牲にしてより良い空間分解能を提供することに注意します。</li>
		<li>「スキャン」をクリックして選択した波長のデータ/画像の取得を開始します。 注: 腹部全体の中細スキャンのスキャン時間; 約 5 分になります今回は、各データ ポイントは個別に励起レーザーに照らされたされ生じる蛍光性が記録されます。</li>
		<li>スキャンの終わりにイメージングのカセットから動物を削除し、ケージに戻ってそれを置く前に完全回復する動物を許可します。</li>
		<li>実験中にさまざまな時点で必要と認められる場合は FMT を繰り返します (0、5、および 9-10 日間など(試験終了))、しかし、バック グラウンド蛍光信号を増加させる体内の抗体の蓄積を考慮します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. スキャン後
<ol>
	<li>個室ケージ赤光地球温暖化ランプの下でペーパー タオルの上にマウスを置きし、完全復旧までの不快感や苦痛の兆候をマウスを監視します。いつ完全に目を覚まし、それぞれのケージに戻るには、マウスを置きます。</li>
	<li>100% (v/v) の用量でアイソレータへの CO2の配信実験の終わりにマウス、100 vol % と 3 L/分を安楽死させます。高濃度 CO2の突然の暴露は、苦痛を引き起こす可能性がありますと、CO2で商工会議所をあらかじめ記入しないでください。マウスが急激な頚部転位などの安楽死のそれに続くセカンダリ モードによる呼吸を停止した後は、死を確認します。</li>
	<li>腹部の開腹手術で大腸を外植体し、手順に従って 4.2.1 - 4.2.4 explanted コロンの前のヴィヴォスキャンを実行します。縦 Metzenbaum 外科はさみを使用して各コロンを開き、さらに分析のためにそれを準備する前に生理食塩液を徹底的にすすいでください。</li>
	<li>メスを使用すると、遠位結腸から 0.5 cm の断片を切り取り、すぐに 1.5 mL クライオ チューブで。凍結液体窒素で-70 ° c 店さらに使用 (例えばミエロペルオキシダーゼ (MPO) 測定) まで。</li>
	<li>木の棒を使用し、組織学的解析の粘膜の外側 (「スイスロール技法」) との近位端に遠位から残り縦に開かれているコロンをロールアップします。定着剤で準備を配置 (材料の表を参照してください)、-80 ° C14で凍結します。</li>
</ol>
6. データ再構築と解釈
<ol>
	<li>それぞれは、イメージング ソフトウェアの再構成ツールを使用して、raw 画像データから蛍光分布の 3次元マップを作成スキャンはスキャンしたときに、自動的に再構築ツールに追加する関数"キューに追加復興"が選択されます。<ol>
		<li>それ以外の場合、それぞれの研究の下のドロップ ダウン メニューからスキャンを選択し研究グループ、スキャンを右クリックし、「復興に追加」を選択</li>
	</ol>
	</li>
	<li>詳細な分析、解析ソフトウェアにデータ セットを読み込みます。上部バーのドロップ ダウン メニューからそれぞれの研究を選択し、右側のメニューから [研究グループと個々 の動物この動物のため実行するスキャンのすべてが表示されます。正しいスキャンを選択し、「読み込み」をクリックしてください 注: トレーサー分布の三次元左側の当初取得蛍光反射率画像のオーバーレイとして表示されます。モデルを回転の分析を容易に拡大することができます。</li>
	<li>非特異的ラベル蓄積 (例えば肝臓や尿膀胱) 再建された 3 D マップ上の病巣を特定し、ターゲット組織 (例えば腸や腸) から区別するため。</li>
	<li>一番上のバーからターゲットの最も適切な ROI 形状を選択します。解析ソフトウェアのそれぞれの測定ツールを配置することによって利益 (率 ROI) の領域としてラベル対象組織ソフトウェアがモルのスキャンが済んでトレーサー量、投資収益率と同様、(ピコ) の蛍光強度を提供します。</li>
	<li>(組織) の炎症性の浸潤との相関関係の疾患活動性の評価のために最も適した相当として ROI サイズに正規化された、適切な投資収益率でトレーサーの合計量を選択します。 注: 特定のモデルの代表として適切な場合は、投資収益率の他の機能を選択できます。</li>
</ol>
7。Ex Vivo解析
<ol>
	<li>ヘマトキシリンとエオシン染色と蛍光抗体法。
	<ol>
		<li>70% のエタノール (エタノール); 2 分でそれらを配置することによって、セクションを deparaffinize します。その後水ですすいでください。5 分のヘマトキシリン液で染色し、その後 10 分間ぬるま湯ですすいでください。</li>
		<li>エオシン溶液 2 分間で対比染色、蒸留水ですすぎ、もう一度蒸留水ですすぎ。</li>
		<li>場所 70 %etoh、96 %etoh、99% エタノール、およびキシレン (2 回) が脱水し、セクションをクリア各 2 分の。メディアを樹脂製マウントをマウントします。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>蛍光抗体法。
	<ol>
		<li>螢光抗体の汚損のため以前に取得した組織切片 (「スイスロール」) を使用し、7 μ m の低温カット セクションを準備します。</li>
		<li>10 分 5.0% ラット血清中のアセトン固定と冷凍コロン セクションをブロックし、希薄 (1/500 v/v) ビオチン化初代ラット抗マウス F4/80 抗体一晩インキュベートします。トリス緩衝生理食塩水 (TBS) で三度のセクションを洗浄し、PBS/BSA のストレプトアビジン FITC (1: 100 v/v) と孵化 (0.1 %w/v) 4 ° C でオーバー ナイト</li>
		<li>TBS の各セクションを洗って 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI、1: 1000 v/v) コントラストを達成するために染まります。共焦点顕微鏡蛍光画像を分析 (フィルター キューブ N2.1 励起フィルター 515 560; 40 倍の倍率表の材料を参照) と高出力フィールドごと F4/80-陽性細胞をカウントします。 注: は、生体内でFMT と事後組織解析免疫組織染色や蛍光染色、意図されていたターゲットによってなどを結合するときに同じクローンとフォーマットの抗体を使用してください。F4/80 陽性マクロファージ体内と体外の検出、さまざまな形式が使用されました。</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MPO コロン サンプルの測定。
	<ol>
		<li>新鮮な取得、PBS 洗浄コロン サンプルや MPO 測定のため解凍試験片に使用します。すべてのサンプルの重量を量るし、組織を均質化、ELISA、換散バッファーのキット (材料の表を参照してください) 組織の mg 当たり換散バッファーの 20 μ L のボリュームで。</li>
		<li>15 超音波 s (超音波周波数: 20 kHz、電力: 70 W) 200 x g と 4 ° C で 10 分間のサンプルを遠心力と</li>
		<li>市販 ELISA キット (材料の表を参照) の使用のメーカー説明によると。重複のテストを実行します。</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Bruckner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Murine+endoscopy+for+in+vivo+multimodal+imaging+of+carcinogenesis+and+assessment+of+intestinal+wound+healing+and+inflammation.">Murine endoscopy for in vivo multimodal imaging of carcinogenesis and assessment of intestinal wound healing and inflammation.</a> J Vis Exp. (90), (2014).</li><li>Lewis, J. S., Achilefu, S., Garbow, J. R., Laforest, R., Welch, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small+animal+imaging.+current+technology+and+perspectives+for+oncological+imaging.">Small animal imaging. current technology and perspectives for oncological imaging.</a> Eur J Cancer. 38 (16), 2173-2188 (2002).</li><li>Bettenworth, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translational+18F-FDG+PET/CT+imaging+to+monitor+lesion+activity+in+intestinal+inflammation.">Translational 18F-FDG PET/CT imaging to monitor lesion activity in intestinal inflammation.</a> J Nucl Med. 54 (5), 748-755 (2013).</li><li>Vowinkel, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Apolipoprotein+A-IV+inhibits+experimental+colitis.">Apolipoprotein A-IV inhibits experimental colitis.</a> J Clin Invest. 114 (2), 260-269 (2004).</li><li>Korlach, J., Schwille, P., Webb, W. W., Feigenson, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+lipid+bilayer+phases+by+confocal+microscopy+and+fluorescence+correlation+spectroscopy.">Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence correlation spectroscopy.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 96 (15), 8461-8466 (1999).</li><li>Ntziachristos, V., Tung, C. H., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+molecular+tomography+resolves+protease+activity+in+vivo.">Fluorescence molecular tomography resolves protease activity in vivo.</a> Nat Med. 8 (7), 757-760 (2002).</li><li>Ntziachristos, V., Bremer, C., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+imaging+with+near-infrared+light:+new+technological+advances+that+enable+in+vivo+molecular+imaging.">Fluorescence imaging with near-infrared light: new technological advances that enable in vivo molecular imaging.</a> Eur Radiol. 13 (1), 195-208 (2003).</li><li>Ntziachristos, V., Bremer, C., Graves, E. E., Ripoll, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+tomographic+imaging+of+near-infrared+fluorescent+probes.">In vivo tomographic imaging of near-infrared fluorescent probes.</a> Mol Imaging. 1 (2), 82-88 (2002).</li><li>Ballou, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+labeling+in+vivo+using+cyanine-conjugated+monoclonal+antibodies.">Tumor labeling in vivo using cyanine-conjugated monoclonal antibodies.</a> Cancer Immunol Immunother. 41 (4), 257-263 (1995).</li><li>Wirtz, S., Neufert, C., Weigmann, B., Neurath, M. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+mouse+models+of+intestinal+inflammation.">Chemically induced mouse models of intestinal inflammation.</a> Nat Protoc. 2 (3), 541-546 (2007).</li><li>Kawada, M., Arihiro, A., Mizoguchi, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insights+from+advances+in+research+of+chemically+induced+experimental+models+of+human+inflammatory+bowel+disease.">Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease.</a> World J Gastroenterol. 13 (42), 5581-5593 (2007).</li><li>Nowacki, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+5A+apolipoprotein+A-I+(apoA-I)+mimetic+peptide+ameliorates+experimental+colitis+by+regulating+monocyte+infiltration.">The 5A apolipoprotein A-I (apoA-I) mimetic peptide ameliorates experimental colitis by regulating monocyte infiltration.</a> Br J Pharmacol. 173 (18), 2780-2792 (2016).</li><li>Hansch, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+experimental+arthritis+with+near-infrared+fluorescence.">In vivo imaging of experimental arthritis with near-infrared fluorescence.</a> Arthritis Rheum. 50 (3), 961-967 (2004).</li><li>Bialkowska, A. B., Ghaleb, A. M., Nandan, M. O., Yang, V. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improved+Swiss-rolling+Technique+for+Intestinal+Tissue+Preparation+for+Immunohistochemical+and+Immunofluorescent+Analyses.">Improved Swiss-rolling Technique for Intestinal Tissue Preparation for Immunohistochemical and Immunofluorescent Analyses.</a> J Vis Exp. (113), (2016).</li><li>Diaz-Granados, N., Howe, K., Lu, J., McKay, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dextran+sulfate+sodium-induced+colonic+histopathology,+but+not+altered+epithelial+ion+transport,+is+reduced+by+inhibition+of+phosphodiesterase+activity.">Dextran sulfate sodium-induced colonic histopathology, but not altered epithelial ion transport, is reduced by inhibition of phosphodiesterase activity.</a> Am J Pathol. 156 (6), 2169-2177 (2000).</li><li>Kim, J. J., Shajib, M. S., Manocha, M. M., Khan, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Investigating+intestinal+inflammation+in+DSS-induced+model+of+IBD.">Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD.</a> J Vis Exp. (60), e3678 (2012).</li><li>Dieleman, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+experimental+colitis+induced+by+dextran+sulphate+sodium+(DSS)+is+characterized+by+Th1+and+Th2+cytokines.">Chronic experimental colitis induced by dextran sulphate sodium (DSS) is characterized by Th1 and Th2 cytokines.</a> Clin Exp Immunol. 114 (3), 385-391 (1998).</li><li>Kojouharoff, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neutralization+of+tumour+necrosis+factor+(TNF)+but+not+of+IL-1+reduces+inflammation+in+chronic+dextran+sulphate+sodium-induced+colitis+in+mice.">Neutralization of tumour necrosis factor (TNF) but not of IL-1 reduces inflammation in chronic dextran sulphate sodium-induced colitis in mice.</a> Clin Exp Immunol. 107 (2), 353-358 (1997).</li><li>Sunderkotter, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Subpopulations+of+mouse+blood+monocytes+differ+in+maturation+stage+and+inflammatory+response.">Subpopulations of mouse blood monocytes differ in maturation stage and inflammatory response.</a> J Immunol. 172 (7), 4410-4417 (2004).</li><li>Willmann, J. K., van Bruggen, N., Dinkelborg, L. M., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+imaging+in+drug+development.">Molecular imaging in drug development.</a> Nat Rev Drug Discov. 7 (7), 591-607 (2008).</li><li>Ntziachristos, V., Ripoll, J., Wang, L. V., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+and+listening+to+light:+the+evolution+of+whole-body+photonic+imaging.">Looking and listening to light: the evolution of whole-body photonic imaging.</a> Nat Biotechnol. 23 (3), 313-320 (2005).</li><li>Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Going+deeper+than+microscopy:+the+optical+imaging+frontier+in+biology.">Going deeper than microscopy: the optical imaging frontier in biology.</a> Nat Methods. 7 (8), 603-614 (2010).</li><li>Stuker, F., Ripoll, J., Rudin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+molecular+tomography:+principles+and+potential+for+pharmaceutical+research.">Fluorescence molecular tomography: principles and potential for pharmaceutical research.</a> Pharmaceutics. 3 (2), 229-274 (2011).</li><li>Beziere, N., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optoacoustic+imaging:+an+emerging+modality+for+the+gastrointestinal+tract.">Optoacoustic imaging: an emerging modality for the gastrointestinal tract.</a> Gastroenterology. 141 (6), 1979-1985 (2011).</li><li>Habtezion, A., Nguyen, L. P., Hadeiba, H., Butcher, E. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Leukocyte+Trafficking+to+the+Small+Intestine+and+Colon.">Leukocyte Trafficking to the Small Intestine and Colon.</a> Gastroenterology. 150 (2), 340-354 (2016).</li><li>Ungar, B., Kopylov, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+the+development+of+new+biologics+in+inflammatory+bowel+disease.">Advances in the development of new biologics in inflammatory bowel disease.</a> Ann Gastroenterol. 29 (3), 243-248 (2016).</li><li>Sandborn, W. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vedolizumab+as+induction+and+maintenance+therapy+for+Crohn's+disease.">Vedolizumab as induction and maintenance therapy for Crohn's disease.</a> N Engl J Med. 369 (8), 711-721 (2013).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Etrolizumab+as+induction+therapy+for+ulcerative+colitis:+a+randomised,+controlled,+phase+2+trial.">Etrolizumab as induction therapy for ulcerative colitis: a randomised, controlled, phase 2 trial.</a> Lancet. 384 (9940), 309-318 (2014).</li><li>Coskun, M., Vermeire, S., Nielsen, O. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Targeted+Therapies+for+Inflammatory+Bowel+Disease.">Novel Targeted Therapies for Inflammatory Bowel Disease.</a> Trends Pharmacol Sci. , (2016).</li><li>Vermeire, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+mucosal+addressin+cell+adhesion+molecule+antibody+PF-00547,659+in+ulcerative+colitis:+a+randomised+study.">The mucosal addressin cell adhesion molecule antibody PF-00547,659 in ulcerative colitis: a randomised study.</a> Gut. 60 (8), 1068-1075 (2011).</li><li>Terai, T., Nagano, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-molecule+fluorophores+and+fluorescent+probes+for+bioimaging.">Small-molecule fluorophores and fluorescent probes for bioimaging.</a> Pflugers Arch. 465 (3), 347-359 (2013).</li><li>Ren, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+Measurement+of+Tumor+Vascular+Permeability+and+Perfusion+using+a+Hybrid+System+for+Simultaneous+Magnetic+Resonance+and+Fluorescence+Imaging.">Dynamic Measurement of Tumor Vascular Permeability and Perfusion using a Hybrid System for Simultaneous Magnetic Resonance and Fluorescence Imaging.</a> Mol Imaging Biol. 18 (2), 191-200 (2016).</li><li>Ale, A., Ermolayev, V., Deliolanis, N. C., Ntziachristos, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+background+subtraction+technique+for+hybrid+fluorescence+molecular+tomography/x-ray+computed+tomography+imaging+of+a+mouse+model+of+early+stage+lung+cancer.">Fluorescence background subtraction technique for hybrid fluorescence molecular tomography/x-ray computed tomography imaging of a mouse model of early stage lung cancer.</a> J Biomed Opt. 18 (5), 56006 (2013).</li><li>Chames, P., Van Regenmortel, M., Weiss, E., Baty, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+antibodies:+successes,+limitations+and+hopes+for+the+future.">Therapeutic antibodies: successes, limitations and hopes for the future.</a> Br J Pharmacol. 157 (2), 220-233 (2009).</li><li>Faust, A., Hermann, S., Schafers, M., Holtke, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+probes+and+their+potential+contribution+to+radiotracer+development.">Optical imaging probes and their potential contribution to radiotracer development.</a> Nuklearmedizin. 55 (2), 51-62 (2016).</li><li>Mahler, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+susceptibility+of+inbred+mouse+strains+to+dextran+sulfate+sodium-induced+colitis.">Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis.</a> Am J Physiol. 274 (3 Pt 1), G544-G551 (1998).</li></ol>

著者が明らかに何もありません。

医療イメージング技術は、近年急速に進化してきたが我々 はまだ開発のごく初期の段階で炎症性プロセスまたは他の病気と同様、腫瘍を検出する当社の能力に制限されます。ただし、これは理解腫瘍の成長、侵略、または転移開発および炎症性疾患と変性、心血管及び免疫疾患の開発の細胞プロセスに重要です。伝統的なイメージング技術は、身体的または生理学的なパラメーターに依存し...

動物モデルは、科学的な研究で広く使用されて、多くの非侵襲的な手順が存在するモニターの疾患活動性と活力を体重の増減の定量化や血液、尿、糞便の分析など。ただし、これらは個体間変動予告も間接代理パラメーターのみです。彼らはよく反復的な時点でシリアルの観察を防ぐ組織標本の事後分析によって補完する必要があります、生理や病理組織学的観察を処理で体内を直接します。断面イメージング、光学イメージング、および内視鏡検査は、これらのプロセスの直接可視化を実現し、同じ動物1の反復的な解析ができますクロスを含む高度な小動物イメージング技術が浮上しています。,2,3。 さらに、繰り返し同じ動物の疾患のさまざまな状態を監視する可能性、必要な動物の倫理の観点から望ましいと考えられる動物の数を減らします。
生体内蛍光イメージングのためにいくつか別の光イメージング技術が存在します。もともと、共焦点レーザー顕微鏡を用いて地表および地下の蛍光イベント4,5を研究します。最近では、ただし、三次元組織の定量的評価を可能にする断層システム先進6をされています。これが単色光源7検波器、低吸収を提供する近赤外線 (NIR) スペクトルで発光する蛍光プローブの開発によって達成されました。伝統的な断面解析イメージングしながらコンピューター断層撮影 (CT) や磁気共鳴画像 (MRI)、超音波 (米国)、ほとんど物理的なパラメーターに依存して、形態を視覚化するなど光イメージングすることができます追加情報を提供します。基になる分子プロセスに内因性あるいは外因性蛍光プローブ8をの。
分子生物学の進歩は、ターゲットの増加する数のスマートかつターゲットを絞った蛍光分子プローブの生成を促進に貢献しています。たとえば、受容体を介した取り込みと特定のターゲット領域における分布視覚化できます carbocyanine 誘導体標識抗体9を使用しています。体のそうでなければアクセスできない領域に特定のトレーサーとして機能するラベル付けできますが、利用可能な抗体の豊富な腫瘍と神経変性のモデル分子・細胞のプロセスに前例のない洞察を提供します。心血管系、免疫学的、および炎症性疾患7。
本研究では大腸炎のマウスモデルにおける蛍光を介したトモグラフィの使用をについて説明します。デキストラン硫酸ナトリウム (DSS)-誘導大腸炎、炎症性腸疾患 (IBD)10のような腸の炎症の標準化学物質誘発マウス モデル。腸炎症11の開発に生来の免疫システムの貢献を評価するために特に便利です。採用、アクティブ化、および単球やマクロファージの浸潤は、IBD の病因の重要なステップを表す、採用の可視化や浸潤の動態が、たとえばの効果をモニターします。12の臨床設定で、潜在的な治療剤。我々 は DSS 大腸炎の誘導をについて説明し、単球/マクロファージ マーカー F4/80 の具体的な可視化の蛍光分子トモグラフィーを用いた消化管粘膜へのマクロファージ浸潤の断層撮影による評価を示します13さらに、抗体はラベリング; などの補助および補足的な手順を示す。実験のセットアップ;疾患活動指標など従来の読み出しとの相関関係で、得られた画像の分析と解釈流れ cytometry と組織学的解析および免疫組織化学。我々 は、この手法との比較その他の画像診断装置の制限をについて説明します。

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alfalfa-free diet</td><td>Harlan Laboritories, Madison, USA</td><td>2014</td><td></td></tr><tr><td>Bepanthen eye ointment</td><td>Bayer, Leverkusen, Germany</td><td>80469764</td><td></td></tr><tr><td>Dextran sulphate sodium (DSS)</td><td>TdB Consulatancy, Uppsala, Sweden</td><td>DB001</td><td></td></tr><tr><td>Eosin</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 4382</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>E 9884</td><td></td></tr><tr><td>Florene 100V/V</td><td>Abbott, Wiesbaden, Germany</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Haematoxylin&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sigma - Aldrich, Deisenhofen, Germany</td><td>HHS32-1L</td><td></td></tr><tr><td>O.C.T. Tissue Tek compound&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td>Sakura, Zoeterwonde, Netherlands</td><td>4583</td><td>fixative for histological analyses</td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline, PBS</td><td>Lonza, Verviers, Belgium</td><td>4629</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Chloride 0,9%</td><td>Braun, Melsungen, Germany</td><td>5/12211095/0411</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate powder</td><td>Sigma Aldrich Deisenhofen, Germany</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Standard diet</td><td>Altromin, Lage, Germany</td><td>1320</td><td></td></tr><tr><td>Tissue-Tek Cryomold</td><td>Sakura, Leiden, Netherlands</td><td>4566</td><td></td></tr><tr><td>Hemoccult (guaiac paper test)</td><td>Beckmann Coulter, Germany</td><td>3060</td><td></td></tr><tr><td>Biotin rat-anti-mouse anti-F4/80 antibody</td><td>Serotec, Oxford, UK</td><td>MCA497B</td><td></td></tr><tr><td>Biotin rat-anti-mouse anti-GR-1&amp;nbsp;</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg Germany</td><td>553125</td><td></td></tr><tr><td>Streptavidin-Alexa546</td><td>Molecular Probes, Darmstadt, Germany</td><td>S-11225</td><td>excitation/emission maximum:&amp;nbsp; 556/573nm</td></tr><tr><td>Anti-CD11b rat-anti-mouse antibody TC</td><td>Calteg, Burlingame, USA</td><td>R2b06</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse F4/80 antibody</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>123102</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>FITC-conjugated anti-Ly6C rat-anti-mouse antibody</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Germany</td><td>553104</td><td></td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>BD Pharmingen, Heidelberg, Germany</td><td>342003</td><td></td></tr><tr><td>Cy7 NHS Ester</td><td>GE Healthcare&amp;nbsp;Europe, Freiburg, Germany</td><td>PA17104</td><td></td></tr><tr><td>MPO ELISA</td><td>Immundiagnostik AG, Bensheim, Germany</td><td>K 6631B</td><td></td></tr><tr><td>Cy5.5 labeled anti-mouse F4/80 antibody</td><td>BioLegend, London, UK</td><td>123127</td><td>ready to use labelled Antibodies (alternative)</td></tr><tr><td>Anti-Mouse F4/80 Antigen PerCP-Cyanine5.5</td><td>eBioscience, Waltham, USA</td><td>45-4801-80</td><td>ready to use labelled Antibodies (alternative)</td></tr><tr><td>DMSO (Dimethyl sulfoxide)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>67-68-5</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>792632</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumins (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>A4612</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline Solution (TBS)</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>SRE0032</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>FACS Calibur Flow Cytometry System</td><td>BD Biosciences GmbH, Heidelberg, Germany</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FMT 2000 In Vivo Imaging System</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>True Quant 3.1 Imaging Analysis Software</td><td>PerkinElmer Inc., Waltham, MA, USA</td><td>included in FMT2000</td><td></td></tr><tr><td>Leica DMLB Fluorescent Microscope</td><td>Leica,&amp;nbsp; 35578 Wetzlar, Germany&amp;nbsp;</td><td>DMLB</td><td></td></tr><tr><td>Bandelin Sonopuls HD 2070</td><td>Bandelin, 12207 Berlin, Germany</td><td>HD 2070</td><td>ultrasonic homogenizer</td></tr><tr><td>Disposable scalpel No 10</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z692395-10EA</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum scissors 14cm</td><td>Ehrhardt Medizinprodukte GmbH, Geislingen, Germany</td><td>22398330</td><td></td></tr><tr><td>luer lock syringe 5ml</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z248010</td><td></td></tr><tr><td>syringe needles</td><td>Sigma-Aldrich, Deisenhoffen, Germany</td><td>Z192368&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Tube 50ml</td><td>BD Biosciences, Erembodegem, Belgium</td><td>352070</td><td></td></tr></tbody></table>

fluorescence-mediated tomography for the detection and quantification of macrophage-related murine intestinal inflammation

病気のマウスモデルが科学的な研究に不可欠であります。しかし、内視鏡や断層イメージングなど多くの診断ツールは、動物モデルで日常的には採用されません。従来実験的読み出しは、しばしば事後と前のヴィヴォ分析、個人内のフォロー アップ検査を防止し、必要な研究の動物の数を増やすに依存します。蛍光を介したトモグラフィーできます蛍光プローブの非侵襲的、反復的、定量的な三次元評価です。非常に敏感であり、特異的検出と異なる分子標的の特性評価を可能にする分子のメーカーの使用を許可します。特に、ターゲット プローブは、炎症、自己免疫疾患、感染症、血管疾患、細胞遊走、腫瘍などで遺伝子の活性化および蛋白質の表現の分析のための革新的なツールを表します。この記事で私たちは体内検出と (すなわちF4/80 陽性マクロファージ浸潤) の広く使用されているマウス モデルにおける炎症の評価のこの高度なイメージング技術のステップバイ ステップの手順を提供します。腸の炎症。この手法は免疫細胞と幹細胞の追跡など、他の研究分野でもされる可能性があります。

大腸炎の評価:
DSS 誘発大腸炎は人間の IBD に似ており、減量、直腸出血、表面的な潰瘍、感受性のあるマウス15粘膜損傷につながる腸管炎症の化学物質誘発マウス モデルです。特に自然免疫炎症性腸10,11の開発の貢献の研究に有用です。合併の炎症?...

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Fluorescence-mediated Tomography for the Detection and Quantification of Macrophage-related Murine Intestinal Inflammation

ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

Murine models of disease are indispensable to scientific research. However, many diagnostic tools such as endoscopy or tomographic imaging are not ...

fluorescence-mediated-tomography-for-detection-quantification

Universidad de Cartagena UDEC

Research

JoVE Journal

Medicine

8.1K ビュー.  University Hospital Münster. ターゲット特定プローブなど各種疾患 (例えば炎症、感染、腫瘍) におけるタンパク質発現の分子機構を解析するための革新的なツールを表します。本研究では F4/80 固有蛍光を介したトモグラフィによる大腸炎のマウスモデルにおける腸管マクロファージ浸潤の定量的三次元断層評価について述べる。

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Computed Tomography-guided Time-domain Diffuse Fluorescence Tomography in Small Animals for Localization of Cancer Biomarkers

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light absorption by tissue chromophores (e.g., hemoglobin, water, lipids, melanin) typically limits optical signal propagation through thicknesses larger than a few millimeters2. Compared to other visible wavelengths, tissue absorption for red and near-infrared (near-IR) light absorption dramatically decreases and non-elastic scattering becomes the dominant light-tissue interaction mechanism. The relatively recent development of fluorescent agents that absorb and emit light in the near-IR range (600-1000 nm), has driven the development of imaging systems and light propagation models that can achieve whole body three-dimensional imaging in small animals3.
Despite great strides in this area, the ill-posed nature of diffuse fluorescence tomography remains a significant problem for the stability, contrast recovery and spatial resolution of image reconstruction techniques and the optimal approach to FMI in small animals has yet to be agreed on. The majority of research groups have invested in charge-coupled device (CCD)-based systems that provide abundant tissue-sampling but suboptimal sensitivity4-9, while our group and a few others10-13 have pursued systems based on very high sensitivity detectors, that at this time allow dense tissue sampling to be achieved only at the cost of low imaging throughput. Here we demonstrate the methodology for applying single-photon detection technology in a fluorescence tomography system to localize a cancerous brain lesion in a mouse model.
The fluorescence tomography (FT) system employed single photon counting using photomultiplier tubes (PMT) and information-rich time-domain light detection in a non-contact conformation11. This provides a simultaneous collection of transmitted excitation and emission light, and includes automatic fluorescence excitation exposure control14, laser referencing, and co-registration with a small animal computed tomography (microCT) system15. A nude mouse model was used for imaging. The animal was inoculated orthotopically with a human glioma cell line (U251) in the left cerebral hemisphere and imaged 2 weeks later. The tumor was made to fluoresce by injecting a fluorescent tracer, IRDye 800CW-EGF (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) targeted to epidermal growth factor receptor, a cell membrane protein known to be overexpressed in the U251 tumor line and many other cancers18. A second, untargeted fluorescent tracer, Alexa Fluor 647 (Life Technologies, Grand Island, NY) was also injected to account for non-receptor mediated effects on the uptake of the targeted tracers to provide a means of quantifying tracer binding and receptor availability/density27. A CT-guided, time-domain algorithm was used to reconstruct the location of both fluorescent tracers (i.e., the location of the tumor) in the mouse brain and their ability to localize the tumor was verified by contrast-enhanced magnetic resonance imaging.
Though demonstrated for fluorescence imaging in a glioma mouse model, the methodology presented in this video can be extended to different tumor models in various small animal models potentially up to the size of a rat17.

Diffuse fluorescence tomography offers a relatively low-cost and potentially high-throughout approach to preclinical in vivo tumor imaging. The methodology of optical data collection, calibration, and image reconstruction is presented for a computed tomography-guided non-contact time-domain system using fluorescent targeting of the tumor biomarker epidermal growth factor receptor in a mouse glioma model.

癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

Small animal fluorescence molecular imaging (FMI) can be a powerful tool for preclinical drug discovery and development studies1. However, light ...

医学

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that distinguish acute and chronic inflammation in mouse models. With tissue damage or pathogen invasion, neutrophils are the first line of defense, playing a major role in mediating the acute inflammatory response. As the inflammatory reaction progresses, circulating monocytes gradually migrate into the site of injury and differentiate into mature macrophages, which mediate chronic inflammation and promote tissue repair by removing tissue debris and producing anti-inflammatory cytokines. Intraperitoneal injection of luminol (5-amino-2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione, sodium salt) enables detection of acute inflammation largely mediated by tissue-infiltrating neutrophils. Luminol specifically reacts with the superoxide generated within the phagosomes of neutrophils since bioluminescence results from a myeloperoxidase (MPO) mediated reaction. Lucigenin (bis-N-methylacridinium nitrate) also reacts with superoxide in order to generate bioluminescence. However, lucigenin bioluminescence is independent of MPO and it solely relies on phagocyte NADPH oxidase (Phox) in macrophages during chronic inflammation. Together, luminol and lucigenin allow non-invasive visualization and longitudinal assessment of different phagocyte populations across both acute and chronic inflammatory phases. Given the important role of inflammation in a variety of human diseases, we believe this non-invasive imaging method can help investigate the differential roles of neutrophils and macrophages in a variety of pathological conditions.

In vivo Imaging Method to Distinguish Acute and Chronic Inflammation

We describe a non-invasive imaging method for distinguishing inflammatory stages. Systemic delivery of luminol reveals areas of acute inflammation dependent upon MPO activity in neutrophils. In contrast, injection of lucigenin allows for visualization of chronic inflammation dependent upon Phox activity in macrophages.

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

Inflammation is a fundamental aspect of many human diseases. In this video report, we demonstrate non-invasive bioluminescence imaging techniques that ...

免疫・感染学

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous number of imaging techniques currently available and the progress in instrumentation, there is still a need for highly sensitive probes that are suitable for in vivo imaging. One typical problem of available preclinical fluorescent probes is their rapid clearance in vivo, which reduces their imaging sensitivity. To circumvent rapid clearance, increase number of dye molecules at the target site, and thereby reduce background autofluorescence, encapsulation of the near-infrared fluorescent dye, DY-676-COOH in liposomes and verification of its potential for in vivo imaging of inflammation was done. DY-676 is known for its ability to self-quench at high concentrations. We first determined the concentration suitable for self-quenching, and then encapsulated this quenching concentration into the aqueous interior of PEGylated liposomes. To substantiate the quenching and activation potential of the liposomes we use a harsh freezing method which leads to damage of liposomal membranes without affecting the encapsulated dye. The liposomes characterized by a high level of fluorescence quenching were termed Lip-Q. We show by experiments with different cell lines that uptake of Lip-Q is predominantly by phagocytosis which in turn enabled the characterization of its potential as a tool for in vivo imaging of inflammation in mice models. Furthermore, we use a zymosan-induced edema model in mice to substantiate the potential of Lip-Q in optical imaging of inflammation in vivo. Considering possible uptake due to inflammation-induced enhanced permeability and retention (EPR) effect, an always-on liposome formulation with low, non-quenched concentration of DY-676-COOH (termed Lip-dQ) and the free DY-676-COOH were compared with Lip-Q in animal trials.

Fluorescence-quenching of a Liposomal-encapsulated Near-infrared Fluorophore as a Tool for In Vivo Optical Imaging

The use of fluorophores for in vivo imaging can be greatly limited by opsonization, rapid clearance, low detection sensitivity and cytotoxic effects on the host. Encapsulation of fluorophores in liposomes by film hydration and extrusion leads to fluorescence quenching and protection which enables in vivo imaging with high detection sensitivity.

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光<em&gt;インビボ</em&gt;光学イメージング

Optical imaging offers a wide range of diagnostic modalities and has attracted a lot of interest as a tool for biomedical imaging. Despite the enormous ...

生物工学

Hybrid &#181;CT-FMT imaging and image analysis

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to assess the biodistribution of novel probes and to assess disease progression using established molecular probes or reporter genes. The combination with an anatomical modality, e.g., micro computed tomography (&#181;CT), is beneficial for image analysis and for fluorescence reconstruction. We describe a protocol for multimodal &#181;CT-FMT imaging including the image processing steps necessary to extract quantitative measurements. After preparing the mice and performing the imaging, the multimodal data sets are registered. Subsequently, an improved fluorescence reconstruction is performed, which takes into account the shape of the mouse. For quantitative analysis, organ segmentations are generated based on the anatomical data using our interactive segmentation tool. Finally, the biodistribution curves are generated using a batch-processing feature. We show the applicability of the method by assessing the biodistribution of a well-known probe that binds to bones and joints.

Hybrid  &#181;CT-FMT imaging and image analysis

We describe a protocol for hybrid imaging, combining fluorescence-mediated tomography (FMT) with micro computed tomography (&#181;CT). After fusion and reconstruction, we perform interactive organ segmentation to extract quantitative measurements of the fluorescence distribution.

ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

Fluorescence-mediated tomography (FMT) enables longitudinal and quantitative determination of the fluorescence distribution in vivo and can be used to ...

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques enable the observation of live cellular behavior inside the organ but can be challenging in some types of cancer due to organ and tumor accessibility such as intestine. Direct observation of intestinal tumors has not been previously reported. A surgical procedure described here allows direct observation of myeloid cell dynamics within the intestinal tumors in live mice by using transgenic fluorescent reporter mice and injectable tracers or antibodies. For this purpose, a four-color, multi-region, micro-lensed spinning disk confocal microscope that allows long-term continuous imaging with rapid image acquisition has been used. ApcMin/+ mice that develop multiple adenomas in the small intestine are crossed with c-fms-EGFP mice to visualize myeloid cells and with ACTB-ECFP mice to visualize intestinal epithelial cells of the crypts. Procedures for labeling different tumor components, such as blood vessels and neutrophils, and the procedure for positioning the tumor for imaging through the serosal surface are also described. Time-lapse movies compiled from several hours of imaging allow the analysis of myeloid cell behavior in situ in the intestinal microenvironment.

Real-time Imaging of Myeloid Cells Dynamics in ApcMin/+ Intestinal Tumors by Spinning Disk Confocal Microscopy

By using transgenic reporter mice and injectable fluorescent labels, long-term intravital spinning disk confocal microscopy enables direct visualization of myeloid cell behavior into intestinal adenoma in the ApcMin/+ colorectal cancer model.

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング<em&gt;のApc<sup&gt;最小/ +</sup</em&gt;腸腫瘍ディスク共焦点顕微鏡スピニングすることにより

Myeloid cells are the most abundant immune cells within tumors and have been shown to promote tumor progression. Modern intravital imaging techniques ...

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions preclinically. However, valid assessment of pathological alterations often requires histological analysis, and when performed ex vivo, necessitates death of the animal. Therefore in conventional experimental settings, intra-individual follow-up examinations are rarely possible. Thus, development of murine endoscopy in live mice enables investigators for the first time to both directly visualize the gastrointestinal mucosa and also repeat the procedure to monitor for alterations. Numerous applications for in vivo murine endoscopy exist, including studying intestinal inflammation or wound healing, obtaining mucosal biopsies repeatedly, and to locally administer diagnostic or therapeutic agents using miniature injection catheters. Most recently, molecular imaging has extended diagnostic imaging modalities allowing specific detection of distinct target molecules using specific photoprobes. In conclusion, murine endoscopy has emerged as a novel cutting-edge technology for diagnostic experimental in vivo imaging and may significantly impact on preclinical research in various fields.

Murine Endoscopy for In Vivo Multimodal Imaging of Carcinogenesis and Assessment of Intestinal Wound Healing and Inflammation

Small animal imaging techniques allow serial diagnostic examinations and therapeutic interventions in vivo. Recently, the scope of applications has significantly widened and currently includes assessment of colonic tumor development, wound healing and monitoring of inflammation. This protocol illustrates these diverse potential applications of murine endoscopy.

マウス内視鏡検査のため<em&gt;インビボ</em&gt;発がんと腸の評価のマルチモーダルイメージング創傷治癒および炎症

Mouse models are widely used to study pathogenesis of human diseases and to evaluate diagnostic procedures as well as therapeutic interventions ...

Quantitative Visualization of Leukocyte Infiltrate in a Murine Model of Fulminant Myocarditis by Light Sheet Microscopy

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently labelled structures in large biological specimens, and is down to cellular resolution. Meanwhile, the constant refinement of underlying protocols and the enhanced availability of specialized commercial systems enable us to investigate the microstructure of whole mouse organs and even allow for the characterization of cellular behavior in various live-cell imaging approaches. Here, we describe a protocol for the spatial whole-mount visualization and quantification of the CD45+ leukocyte population in inflamed mouse hearts. The method employs a transgenic mouse strain (CD11c.DTR)that has recently been shown to serve as a robust, inducible model for the study of the development of fulminant fatal myocarditis, characterized by lethal cardiac arrhythmias. This protocol includes myocarditis induction, intravital antibody-mediated cell staining, organ preparation, and LSFM with subsequent computer-assisted image post-processing. Although presented as a highly-adapted method for our particular scientific question, the protocol represents the blueprint of an easily adjustable system that can also target completely different fluorescent structures in other organs and even in other species.

Here, we describe a light-sheet microscopy approach to visualize the cardiac CD45+ leukocyte infiltrate in a murine model of aseptic fulminant myocarditis, which is induced by the intratracheal diphtheria toxin treatment of CD11c.DTR mice.

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

Light-sheet fluorescence microscopy (LSFM), in combination with chemical clearing protocols, has become the gold standard for analyzing fluorescently ...

Intravital Imaging of Intraepithelial Lymphocytes in Murine Small Intestine

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal epithelium. Due in part to the lack of a definitive ligand for the &#947;&#948; T cell receptor, our understanding of the regulation of &#947;&#948; IEL activation and their function in vivo remains limited. This necessitates the development of alternative strategies to interrogate signaling pathways involved in regulating &#947;&#948; IEL function and the responsiveness of these cells to the local microenvironment. Although &#947;&#948; IELs are widely understood to limit pathogen translocation, the use of intravital imaging has been critical to understanding the spatiotemporal dynamics of IEL/epithelial interactions at steady-state and in response to invasive pathogens. Herein, we present a protocol for visualizing IEL migratory behavior in the small intestinal mucosa of a GFP &#947;&#948; T cell reporter mouse using inverted spinning disk confocal laser microscopy. Although the maximum imaging depth of this approach is limited relative to the use of two-photon laser-scanning microscopy, spinning disk confocal laser microscopy provides the advantage of high speed image acquisition with reduced photobleaching and photodamage. Using 4D image analysis software, T cell surveillance behavior and their interactions with neighboring cells can be analyzed following experimental manipulation to provide additional insight into IEL activation and function within the intestinal mucosa.

We describe a method to visualize GFP-labeled &#947;&#948; IELs using intravital imaging of murine small intestine by inverted spinning disk confocal microscopy. This technique enables the tracking of live cells within the mucosa for up to 4 h and can be used to investigate a variety of intestinal immune-epithelial interactions. &#160;

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

Intraepithelial lymphocytes expressing &#947;&#948; T cell receptor (&#947;&#948; IEL) play a key role in immune surveillance of the intestinal ...

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota and the vertebrate gut. The spatial landscape of the gut microbiota is tightly controlled by physical features - intestinal mucus, crypts, and folds - and is affected by host-controlled properties such as pH, oxygen availability, and immune factors. These properties limit the ability of commensal microbes and pathogens alike to colonize the gut stably. At the micron-scale, microbial organization determines the close-range interactions between different microbes as well as the interactions between microbes and their host. These interactions then affect large-scale organ function and host health.
This protocol enables the visualization of the gut microbiota spatial organization from distances between cells to organ-wide scales. The method is based on fixing gut tissues while preserving intestinal structure and mucus properties. The fixed samples are then embedded, sectioned, and stained to highlight specific bacterial species through fluorescence in situ hybridization (FISH). Host features, such as mucus and host cell components, are labeled with fluorescently labeled lectins. Finally, the stained sections are imaged using a confocal microscope utilizing tile-scan imaging at high magnification to bridge the micron to centimeter length scales. This type of imaging can be applied to intestinal sections from animal models and biopsies from human tissues to determine the biogeography of the microbiota in the gut in health and disease.

Visualization of Gut Microbiota-host Interactions via Fluorescence In Situ Hybridization, Lectin Staining, and Imaging

This streamlined protocol details a workflow to detect and image bacteria in complex tissue samples, from fixing the tissue to staining microbes with fluorescent in situ hybridization.

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

Measuring the localization of microbes within their in vivo context is an essential step in revealing the functional relationships between the microbiota ...

Fluorescent Reporter 定量による全臓器病原体追跡(英語)

High&#45;Resolution Three&#45;Dimensional Whole&#45;Organ Tomography of Microbial Infections

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen cells within this diverse environment significantly affects their stress levels, responses, fate, and contribution to the overall progression of the disease and treatment failure. However, due to the technical difficulties in locating &#181;m-sized pathogen cells within cm-sized host organs, this area of research has been relatively unexplored. Here, we present a method for addressing this challenge. We employ serial two-photon tomography and AI-enhanced image analysis to locate individual Salmonella cells throughout the entire spleen, liver lobes, and whole lymph nodes of infected mice. Using fluorescent reporters and in vivo antibody administration, the replication rate of single Salmonella cells, their local interaction with specific immune cells, and bacterial responses to antibiotics can be determined. These methodologies open avenues for a comprehensive examination of infections, their prevention, and treatment within the three-dimensional tissue context.

著者スポットライト:組織における抗生物質と免疫系に対する細菌の応答を解明する

Here, we describe a procedure that enables organ-wide detection of pathogenic bacteria during infection and quantification of fluorescent reporter activities.

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

Most infections take place within three-dimensional host tissues with intricate anatomy and locally varying host physiology. The positioning of pathogen ...

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

要約

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癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング

マウス内視鏡検査のため

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

検出とマクロファージによるマウス腸管炎症の定量化のための蛍光を介したトモグラフィー

要約

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癌バイオマーカーの局在の小型動物のCTガイド下時間領域拡散蛍光トモグラフィー

急性及び慢性炎症を区別するために生体内イメージング法における

のためのツールと​​してのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光

ハイブリッドμCT-FMT撮像と画像解析

における骨髄細胞ダイナミクスのリアルタイムイメージング

マウス内視鏡検査のため

光シート顕微鏡による劇症心筋炎のマウスモデルにおける白血球浸潤の定量的可視化

マウス小腸における上皮内リンパ球の分体イメージング

蛍光を介した蛍光による腸内微生物叢-宿主相互作用の可視化( Situ ハイブリダイゼーション、レクチン染色、イメージング)

微生物感染症の高解像度三次元全臓器断層撮影法

のためのツールとしてのリポソームカプセル化された近赤外蛍光体の蛍光消光